יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכניס בדיקות כימיות באופן ספציפי לתוך מקטע נוגדנים על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הכימית כגון בשינוי חלבונים, הנדסה וצימוד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להחדיר את בדיקת המטרה או המרק שלך באופן ספציפי לחלבונים או נוגדנים על ידי ערבוב פשוט.

לאחר בניית הפלסמידים, הוסף מיקרוליטר אחד מכל אחד ל-20 מיקרוליטר של זן E.Coli DH10-beta בריכוז של שניים כפול 10 לשמונת התאים למיקרוליטר לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. השתמש בפיפטה כדי לערבב בעדינות את התמיסה. לאחר מכן מניחים 20 מיקרוליטר מהתמיסה המעורבת לקובטה נקייה.

הגדר את מכונת האלקטרופורציה ל-25 מיקרופאראד ו-2.5 קילו-וולט. לאחר מכן הכנס את הקובט למגלשה של תא ההלם. דחוף את השקופית לתוך החדר עד שהקובטה יוצרת מגע איתן עם אלקטרודות החדר.

לחץ על לחצן הדופק פעם אחת עד שמכונת האלקטרופורציה תצפצף. לאחר מכן, הוסף מדיום SOC מיליליטר אחד לקובט במהירות. לאחר מכן העבירו את התערובת למבחנה.

דגירה עם טלטול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר השלמת הדגירה, מורחים את תאי ה-E.Coli שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר מרק ליזוגניות המכילות אנטיביוטיקה מתאימה. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.

לאחר השלמת הדגירה של הצלחת, יש לחסן מושבה אחת שעברה טרנספורמציה בחמישה מיליליטר של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה. דגירה עם טלטול במשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את התרבית העיקרית ל-200 מיליליטר של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין ו-AF מילי-מולרי אחד. דגירה עם טלטול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות.

הוסף שני מיליליטר של 1.6 ארבינוז מולארי כאשר התרבית מגיעה לצפיפות אופטית של 0.8 ב-550 ננומטר. לאחר מכן דגרו עם טלטול בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. בסיום הדגירה, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב -11, 000 פעמים גרם למשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנטנט והקפיאו את הכדור בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. כאשר מוכנים לליזה את התאים, השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיליליטר של מאגר ליזה פרפלזמי בצינור צנטריפוגה טרי. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן, צנטריפוגה של התא ליזאט ב -18, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי והשליכו את הגלולה. לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של מתלה שרף Ni-NTA.

בעזרת מסובב, מערבבים בעדינות את הצינור למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר סיום הערבוב, שפכו את המתלה לעמוד פוליפרופילן. שוטפים את השרף שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר מאגר כביסה.

יש לחסל את נוגדן המטרה עם 300 מיקרוליטר של מאגר פליטה. לאחר מכן, קבע את ריכוז החלבון המוטנטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. התחל בהוספת 10 מיקרוליטר של תמיסה של 10 מיקרו-מולרית של HerFab-L177AF במאגר פוספט המכיל 10 מילי-מולרי נתרן פוספט דו-בסיסי ו-100 מילי-מולרי נתרן כלורי לצינור צנטריפוגה טרי.

לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסה של 200 מיקרו-מולרית של Cy 5.5 azadibenzocyclooctyne במים. לאחר מכן, מכסים את כלי התגובה בנייר אלומיניום. אפשרו לתגובת מהדורת הציקלו, המקודמת על ידי כתמים, להמשיך במשך שש שעות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר השלמת התגובה, הוסף 30 מיקרוליטר של דגימה ו-450 מיקרוליטר של מאגר פוספט כדי לשטוף צבע Cy 5.5 חופשי בעמודת סיבוב מסנן צנטריפוגלי. צנטריפוגה את עמוד הסיבוב ב -14, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הזרימה ואז העבירו את הדגימה המטוהרת לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

אחסן את ה-HerFab המטוהר עם התווית בארבע מעלות צלזיוס אלא אם כן מוכן לניתוח. התחל בהוספת 13 מיקרוליטר של HerFab מטוהר 7.8 מיקרומולר לצינור טרי. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטרים של מאגר דגימת חלבון LDS.

דוגרים על התערובת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, חבר את קלטת הג'ל של ארבע עד 12% Bis-Tris SDS-PAGE לתא האלקטרופורזה. הוסף מאגר ריצה.

לאחר מכן, טען את דגימות החלבון המצומדות ביצרן המשקל המולקולרי הצבוע מראש. בצע אלקטרופורזה בג'ל למשך 35 דקות ב -200 וולט. לאחר השלמת האלקטרופורזה, העבירו את הג'ל למערכת תיעוד וניתוח ג'ל.

סרקו את Cy 5.5 ולאחר מכן צבעו את הג'ל בכתם חלבון מסחרי. במחקר זה, מקטע הנוגדן Her-Fab מצומד באופן ספציפי לאתר עם A זה מושג על ידי שילוב חומצת אמינו המכילה אזיד בשבר ולאחר מכן תגובה של מקטע הנוגדן המוטנטי עם ציקלאוקטין מתוח. ניתוח SDS-PAGE מבוצע עבור חלבונים מוטנטיים המתבטאים הן עם והן בלי חומצת האמינו המכילה אזיד.

כפי שניתן לראות, שבר הנוגדן באורך מלא הושג רק בנוכחות חומצת האמינו. הנוגדן המכיל את חומצת האמינו מוערך לצימוד באמצעות תגובה עם נגזרת אזדיבנזוציקלאוקטין מקושרת Cy 5.5 Cy 5.5 ומנותח על ידי SDS-PAGE. תמונות הקרינה מראות צימוד של מקטע הנוגדן המוטנטי עם Cy 5.5 בעוד שלא נצפתה צימוד בביקורת.

לאחר ביטוי נכון וטיהור החלבון שלך עם אצטילפנילאלנין, ניתן לתייג את החלבון ביעילות עם בדיקה עם הזן מכיוון שתגובת התיוג אינה דורשת מגיב נוסף, אתה יכול להכניס את הגשושית לחלבון היעד שלך פשוט על ידי ערבוב הגשושית עם החלבון שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכניס בדיקה כימית ספציפית למקטע נוגדן על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד.