Name: יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: למד שיטה לתיוג ספציפי של נוגדנים באמצעות חומצת אמינו המכילה אזיד ו-SPAAC. הטכניקה מאפשרת שילוב ביוקוניוגציה יעיל בחקר ביולוגיה כימית והנדסת חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<html> 1. בניית פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות פלסמיד ביטוי (pBAD-HerFab-L177TAG) שיבטא את הגן נוגדן היעד (pBAD-HerFab-WT) עם -tag 6 שלו, ולהחליף את קודון עבור לאוצין-177 עם קודון ענבר (TAG) 27, באמצעות טכניקת mutagenesis אתר מכוון קונבנציונלית. ראה טבלה של חומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות עוד פלסמיד ביטוי (pEVOL-AFRS) המכיל את הגנים עבור Tyr tRNA התפתחו synthetase aminoacyl-tRNA (המפיצים המורשים) זוג. השתמש וקטור הפלסמיד והמעוצב, pEVOL, עבור התאגדות יעילה של UAAs. פרוטוקולי מידע שיבוט פלסמיד המפורטים מתוארים בדוח הקודם. 28 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג פלסמיד דנ&quot;א באיכות גבוהה באמצעות הכנת ערכות פלסמיד זמינות מסחרי. יחס 260/280 של ~ 1.8 הוא אופטימלי עבור ה- DNA המטוהר. במידת הצורך, לבצע 1% ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כדי לבדוק את הטוהר של ה- DNA. </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. הכנת תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כל DNA 1 μL של pEVOL-AFRS 28 ו pBAD-HerFab-L177TAG 20 זן μL Escherichia coli DH10β. מערבבים בעדינות, בעזרת פיפטה. פלסמידים יכול להיות המועברים ביחד או בתגובות עצמאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת cuvettes 0.1 ס&quot;מ, לקבוע את הגדרות electroporation 25 μF ו -2.5 קילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קובט לתוך השקופיות של החדר המזעזע. דחוף את השקופית לתוך התא עד קובט יוצר קשר עם משרד האלקטרודות הקאמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pulse פעם על ידי לחיצה על כפתור הדופק עד יצפצף electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל סופר מרק אופטימלי עם דיכוי catabolite (SOC) בינוני המכיל 2% (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) תמצית שמרים, 10 mM NaCl, 2.5 KCl מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ MgCl 2, ו -20 גלוקוז מ&quot;מ כדי קובט במהירות ולהעביר את התערובת לתוך מבחנה. דגירת התאים עבור 1 ש &#39;ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים טרנספורמציה E. coli תאים על מרק Lysogeny (LB) אגר צלחות המכילות אנטיביוטיקה מתאימה (35 מיקרוגרם / מ&quot;ל chloramphenicol ו -100 מיקרוגרם / מ&quot;ל אמפיצילין לבחירת pEVOL-AFRS ו pBAD-HerFab-L177TAG, בהתאמה). דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה טרנספורמציה אחת 5 אנטיביוטיקה המכיל בינוני מ&quot;ל LB. דגירה במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. </li></ol></li></ol> ביטוי טיהור 3. HerFab-L177AF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביטוי של HerFab-L177AF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התרבות העיקרי (5 מ&quot;ל) לתוך 200 אמפיצילין המכיל בינוני מ&quot;ל LB (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו AF (1 מ&quot;מ), ואחריו הדגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד. הערה: 100 מ&quot;מ AF פתרון המניות (10 מ&quot;ל) הוכנה על ידי המסת 206 מ&quot;ג AF ב 100 מ&quot;מ חומצה הידרוכלורית (10 מ&quot;ל, נפח סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של 1.6 M arabinose (16לריכוז סופי מ&quot;מ) כאשר התרבות מגיע ביומן פאזיים (OD 550 = 0.8, OD = צפיפות אופטית). דגירה במשך 12 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant ולהקפיא גלולה ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי תא 20 חיץ מ&quot;ל periplasmic תמוגה המכיל 30 מ&quot;מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 20% סוכרוז ו -0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ליזוזים, דגירה את התערובת במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate התא 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעביר את supernatant לצינור טרי וזורק את הכדור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרומטוגרפיה זיקה Ni-נ.ת.ע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ההשעיה שרף Ni-נ.ת.ע לכל צינור צנטריפוגות (שרף 400 μL עבור תרבות מ&quot;ל 200), ומערבבים בעדינות על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את ההשעיה לתוך עמוד פוליפרופילן ולשטוף את שרף שלוש פעמים עם 5 bu לשטוף מ&quot;לffer המכיל 50 מ&quot;מ לאא 2 PO 4 (pH 8.0), 20 מ&quot;מ imidazole, ו -300 מ&quot;מ NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute הנוגדן היעד עם חיץ elution 300 μL המכיל 50 מ&quot;מ לאא 2 4 PO (8.0 pH), 250 imidazole מ&quot;מ, ו -300 מ&quot;מ NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז של חלבון מוטנטי ידי השיטה ברדפורד 29 או על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר. חשב את מקדם הכחדה (75,866 M -1 cm -1) עבור HerFab-L177AF ב 280 ננומטר על ידי מחשבון מקדם הכחדה חלבון באמצעות מקדם הכחדה (2471 M -1 cm -1) עבור AF. הערה: את רצף החומצות האמיניות של HerFab ניתן למצוא באתר צמח השדה (GI: 783,282,791 ו GI: 783,282,792). </li></ol></li></ol> 4. הצמידה של מטוהרי HerFab-L177AF עם בדיקות אלקין שימוש קדם-זנים יזיד-אלקין cycloaddition (SPAAC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) ב H 2 O (20081; לריכוז סופי M) לפתרון של 10 μL של HerFab-L177AF (10 מיקרומטר הריכוז הסופי) במאגר פוספט המכיל 10 מ&quot;מ Na 2 HPO 4 (pH 7.0) ו 100 mM NaCl. הערה: ככל חלופות, difluorinated cyclooctyne (DIFO) ו bicyclo [6.1.0] nonyne (BCN) נגזרים זמינים גם עבור אותו יישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תגובת cycloaddition קדם-הזן להמשיך במשך 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. אם בדיקה רגישה לאור (למשל, Cy5.5) משמשת, מכסה את כלי התגובה ברדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את HerFab סומן על פי שלב 5. </li></ol> 5. טיהור תווית HerFab <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של המדגם לעמודה ספין מסנן צנטריפוגלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה העמודה ספין על 14,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק זרימה דרך העברת מטוהרים מדגם מהעמודה ספין כדי צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחלופה לשלב 5.3 5.1-, לבצע purification ידי דיאליזה נגד אותו החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את HerFab שכותרתו מטוהר על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 6. SDS-PAGE ניתוח של תווית HerFab <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 חיץ מדגם חלבון μL LDS המכיל 106 מ&quot;מ טריס · HCl, 141 בסיס טריס מ&quot;מ (pH 8.5), 2% LDS, 10% גליצרול, 0.51 mM EDTA, 0.22 מ&quot;מ Serva כחול G250, ו 0.175 מ&quot;מ פנול אדום עד 13 μL של מטוהרים שכותרתו HerFab (7.8 מיקרומטר או 0.38 מ&quot;ג / מ&quot;ל) בנוכחות (+) או העדרה (-) של 2 μL dithiothreitol (DTT, 100 מ&quot;מ הריכוז הסופי). דגירה את התערובת על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הקלטת ג&#39;ל 4-12% Bis-טריס SDS-PAGE לתא אלקטרופורזה ולהוסיף הפעלת המאגר. טען את דגימות חלבון מצומדות ואת סמן משקל מולקולרי מראש מוכתם. בצע ג&#39;ל אלקטרופורזה במשך 35 דקות ב 200 V. הערה: שמור את תא אלקטרופורזה בחושך במשך כל תקופת למזער צילום הלבנה של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אלקטרופורזה, להעבירהג&#39;ל סורק ג&#39;ל ניאון, ולסרוק עבור פליטת קרינה באורך הגל המתאים. לקבלת Cy5.5, להשתמש במצב Cy5 בתוכנת הסורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ג&#39;ל עם כתם חלבון מסחרי. </li></ol>

<ol><li>Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).</li>
<li>Wu, X., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+at+the+interface+of+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis at the interface of chemistry and biology.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).</li>
<li>Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+the+keto+functional+groupto+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli.</a> proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Deiters, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+incorporation+of+an+alkyne+into+proteins+in+Esshcerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).</li>
<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+transcyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).</li>
<li>Lee, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+acrylamide+fuctionality%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded acrylamide fuctionality.</a> ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+norbornene+directs+site-specific+cellular+protein+labelling+via+a+rapid+bioorthogonal+raction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction.</a> Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li>
<li>Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Cu-free+click+chemistry+with+readily+synthesized+biarylazacyclooctynones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azadibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283+%2B+2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition.</a> Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mechanism+to+mouse%3A+a+tale+of+two+bioorthogonal+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+with+strained+alkenes+and+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation with strained alkenes and alkynes.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).</li>
<li>Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne%E2%88%92azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).</li>
<li>Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+using+catalyst-free+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).</li>
<li>Yao, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+targeting+to+cellular+proteins+via+enzymemediated+azide+ligation+and+strain-promoted+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).</li>
<li>Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+bioorthogonal+functionalities+into+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).</li>
<li>Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residue+choice+defines+efficiency+and+influence+of+bioorthogonal+protein+modification+via+genetically+encoded+strain+promoted+Click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry.</a> Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+an+emerging+concept+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).</li>
<li>Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staudinger+modification+of+proteins+containing+p-Azidophenylalanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine.</a> ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).</li>
<li>Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+and+efficient+method+for+the+site-specific+dual-labeling+of+proteins+for+single+molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+strategies+for+single-molecule+protein+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Click strategies for single-molecule protein fluorescence.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Kazane, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+antibody+multimers+through+peptide+nucleic+acid+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).</li>
<li>Ko, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+site-specific+antibody+labeling+by+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cho, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+extracellular+region+of+HER2+alone+and+in+complex+with+the+Herceptin+Fab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab.</a> Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השילוב הגנטי של חומצות אמינו לא טבעיות לחלבונים יש מספר יתרונות על פני שיטות אחרות משמשות שינוי חלבון. 1-3 אחד היתרונות החשובים הוא התחולה הכללית שלה לכל סוג של חלבון. באופן עקרוני, אין הגבלה בבחירת חלבון מטרה ואתר היעד של החלבון. עם זאת, החלפת משקע מבני או תפקודי חשובה עם UAA עלולה לגרום לשנות את המבנה והתפקוד של חלבון המטרה. באופן כללי, שאריות חשופות ממס לא אינטראקציה עם שאריות אחרות נבחרות עבור התאגדות של UAAs. לכן, מידע מבני מתוך מבנה הגבישי ברזולוציה גבוהה משמש כדי...

מאז ההתאגדות הגנטית של -methoxyphenylalanine p ב Escherichia coli נמסרה, 1 יותר מ -100 חומצות אמינו לא טבעיות (UAAs) שולבו בהצלחה לחלבונים שונים. 1-3 בין UAAs אלה, חומצות אמינו המכילות קבוצות פונקציונליות bioorthogonal נחקרו רבות ומייצגים את השיעור הגבוה ביותר. הקבוצות הפונקציונליות bioorthogonal המשמשים UAAs כוללים קטון, 4 אזיד, 5 אלקין, 6 cyclooctyne, 7 tetrazine, 8 α, β אמיד-בלתי רוויות, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 ו bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 למרות כל קבוצה פונקציונלית יש יתרונות וחסרונות, חומצות אמינו המכיל תזדנה שמשו בצורה המקיפה ביותר עבור נטיית חלבון. p -Azidophenylalanine (AF), אחת מחומצות אמינו המכיל azido, זמין, ו effic התאגדותהiency מצוין. חלבונים Mutant המכיל חומצת אמינו זו ניתן הגיבו עם alkynes ידי cycloaddition היה הזרז נחושת או עם cyclooctynes ​​ידי SPAAC. 12-20 לאחרונה, תרופות ביולוגיות היו למשוך תשומת לב רבה בתעשיית התרופות. המצומד נוגדן-תרופה (ADC) היא מחלקה של נוגדנים הטיפוליות הקיימות יתרון בשל יכולתם לטיפול ממוקד לטיפול בגידולים בבני אדם 21 מחלות אחרות. יותר מ -50 ADCs כרגע בניסויים קליניים, והמספר גדל במהירות. בפיתוח של ממירי ADC, גורמים רבים צריכים להילקח בחשבון על מנת למקסם את היעילות ולצמצם את תופעות הלוואי. בין גורמים אלה, תגובת נטייה יעילה באתר ספציפי כדי ליצור קשר קוולנטי בין נוגדן ותרופה היא קריטית. היעילות הרצויה וספציפי תגובת הנטייה יכולים להיות מושגת על ידי נטייה עם קבוצה פונקציונלית bioorthogonal בביתחומצת אמינו טבעית אשר משולבת באופן ספציפי נוגדן. הנה 22-26, אנו מדווחים פרוטוקול אתר ספציפי לשלב AF לתוך נוגדן ו להטות שבר נוגדנים מוטציה עם בדיקה ביוכימית.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>1. בניית פלסמיד</חזק></td></tr><tr><td>פלסמיד pBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>אופציונלי להכיל את קודון העצירה הענבר (TAG) במיקום הרצוי. Ko, W. et al. תיוג נוגדנים יעיל וספציפי לאתר על ידי תוספת ציקלו-אזיד-אלקין המקודמת על ידי זנים. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>פלסמיד pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. מערכת משופרת למוטגנזה לא טבעית של חומצות אמינו ב-E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>מארח</td></tr><tr><td>פלסמיד מיני ערכת הכנה</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500&nbsp; גרם</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>אלפא Aesar</td><td>L07482</td><td>1 גרם</td></tr><tr><td>מרק LB</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>2. הכנת תרבית</חזק></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>2.1 אלקטרופורציה</חזק></td></tr><tr><td>מיקרו פולסר</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו פולסר</td><td>קובטה BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp; ס"מ פער אלקטרודות, חבילה של 50</td></tr><tr><td>אמפיצילין נתרן</td><td>וואקו</td><td>018-10372</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>אלפא Aesar</td><td>B20841</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>אגר</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>SOC בינוני</td><td>סיגמא</td><td>S1797</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>3. ביטוי וטיהור של HerFab-L177AF</td></tr><tr><td colspan="4">3.1 ביטוי של Herfab-L177AF</td></tr><tr><td>p-azido-L-phenylalanine (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 גרם</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose, 99%</td> <td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית, 35~37%</td> <td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>3.2 ליזיס תאים</חזק></td></tr><tr><td>טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>EDTA דיסודיום מלח דיהידרט, 99.5%</td> <td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S9378</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>ליזוזים</td><td>סיאקו</td><td>126-0671</td><td>1 גרם</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>3.3 Ni-NTA כרומטוגרפיה של זיקה</חזק></td></tr><tr><td>שרף Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 מ"ל</td></tr><tr><td>עמוד פוליפרופילן</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/אריזה, קיבולת 1 מ"ל</td></tr><tr><td>אימידזול, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונובסיסי, 98%</td> <td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>נתרן כלורי, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>4. צימוד של HerFab-L177AF מטוהר עם בדיקות אלקין באמצעות Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 מ"ג</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>5. טיהור מסננים צנטריפוגליים מסומנים HerFab</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 מ"ל</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/חבילה, 500 ו-#956; קיבולת L</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>6. ניתוח SDS-PAGE של HerFab וסריקת ג'ל פלואורסצנטי</חזק></td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%</td> <td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 גרם</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS מאגר דגימה, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 מ"ל</td></tr><tr><td>MES מאגר ריצה</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE ג'לים Thermofisher</td><td></td><td>NO0321</td><td>12 בארות</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>טייפון 9210 מצלמת מצב משתנה</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-strain

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

כרגע יש הרבה כלים כימיים זמינים להציג בדיקות כימיות לחלבונים ללמוד המבנה והתפקוד שלהם. שיטה יעילה היא הצמידה חלבון על ידי החדרה גנטית חומצת אמינו טבעית המכילה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. דו&quot;ח זה מתאר פרוטוקול מפורט נטיית נוגדן אתר ספציפי. הפרוטוקול כולל פרטים ניסיוניים עבור שילוב הגנטי של חומצה תזיד המכיל אמינו, ותגובת הנטייה ידי cycloaddition אלקין-יזיד קדם-זן (SPAAC). התגובה זן-קידם זה ממשיך ידי ערבוב פשוט של מולקולות מגיבים ב- pH וטמפרטורה פיזיולוגיים, ואינו דורש ריאגנטים נוספים כגון יוני נחושת (אני) ו ligands chelating-נחושת. לכן, שיטה זו תהיה שימושית עבור נטיית חלבון בכלל ופיתוח של conjugates תרופת הנוגדן (ADC).

במחקר זה, מקטע נוגדן היה האתר ספציפי מצומדות עם fluorophore על ידי שילוב של חומצות אמיניות המכילים תזדנה לתוך שהבר ותגובת שבר נוגדני המוטציה עם cyclooctyne מתוח (איור 1). HerFab נבחרה נוגדן היעד שלתוכו AF התאגד חומצת אמינו תזיד המכיל. כדי לבחור את שאריות HerFab להחלפה עם AF, המבנה הגבישי רנטגן של HerFab נותח. 30 דרישות חשובות עבור השאריות כוללות מספיק מרחק מאתר הנוגדן המחייב כדי למזער את הירידה וזיקתה מחייבת ונגישות ממס ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להחדרת בדיקות כימיות באופן ספציפי לתוך מקטע נוגדנים על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד, ולאחר מכן צימוד האזיד עם בדיקה כימית על ידי תוספת ציקלו-אזיד-אלקין המקודמת על ידי זן (SPAAC).

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכניס בדיקות כימיות באופן ספציפי לתוך מקטע נוגדנים על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הכימית כגון בשינוי חלבונים, הנדסה וצימוד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להחדיר את בדיקת המטרה או המרק שלך באופן ספציפי לחלבונים או נוגדנים על ידי ערבוב פשוט.לאחר בניית הפלסמידים, הוסף מיקרוליטר אחד מכל אחד ל-20 מיקרוליטר של זן E.Coli DH10-beta בריכוז של שניים כפול 10 לשמונת התאים למיקרוליטר לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. השתמש בפיפטה כדי לערבב בעדינות את התמיסה. לאחר מכן מניחים 20 מיקרוליטר מהתמיסה המעורבת לקובטה נקייה.הגדר את מכונת האלקטרופורציה ל-25 מיקרופאראד ו-2.5 קילו-וולט. לאחר מכן הכנס את הקובט למגלשה של תא ההלם. דחוף את השקופית לתוך החדר עד שהקובטה יוצרת מגע איתן עם אלקטרודות החדר.לחץ על לחצן הדופק פעם אחת עד שמכונת האלקטרופורציה תצפצף. לאחר מכן, הוסף מדיום SOC מיליליטר אחד לקובט במהירות. לאחר מכן העבירו את התערובת למבחנה.דגירה עם טלטול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר השלמת הדגירה, מורחים את תאי ה-E.Coli שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר מרק ליזוגניות המכילות אנטיביוטיקה מתאימה. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.לאחר השלמת הדגירה של הצלחת, יש לחסן מושבה אחת שעברה טרנספורמציה בחמישה מיליליטר של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה. דגירה עם טלטול במשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את התרבית העיקרית ל-200 מיליליטר של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין ו-AF מילי-מולרי אחד. דגירה עם טלטול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות.הוסף שני מיליליטר של 1.6 ארבינוז מולארי כאשר התרבית מגיעה לצפיפות אופטית של 0.8 ב-550 ננומטר. לאחר מכן דגרו עם טלטול בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. בסיום הדגירה, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב -11, 000 פעמים גרם למשך חמש דקות.השליכו את הסופרנטנט והקפיאו את הכדור בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. כאשר מוכנים לליזה את התאים, השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיליליטר של מאגר ליזה פרפלזמי בצינור צנטריפוגה טרי. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.לאחר מכן, צנטריפוגה של התא ליזאט ב -18, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי והשליכו את הגלולה. לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של מתלה שרף Ni-NTA.בעזרת מסובב, מערבבים בעדינות את הצינור למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר סיום הערבוב, שפכו את המתלה לעמוד פוליפרופילן. שוטפים את השרף שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר מאגר כביסה.יש לחסל את נוגדן המטרה עם 300 מיקרוליטר של מאגר פליטה. לאחר מכן, קבע את ריכוז החלבון המוטנטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. התחל בהוספת 10 מיקרוליטר של תמיסה של 10 מיקרו-מולרית של HerFab-L177AF במאגר פוספט המכיל 10 מילי-מולרי נתרן פוספט דו-בסיסי ו-100 מילי-מולרי נתרן כלורי לצינור צנטריפוגה טרי.לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסה של 200 מיקרו-מולרית של Cy 5.5 azadibenzocyclooctyne במים. לאחר מכן, מכסים את כלי התגובה בנייר אלומיניום. אפשרו לתגובת מהדורת הציקלו, המקודמת על ידי כתמים, להמשיך במשך שש שעות ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר השלמת התגובה, הוסף 30 מיקרוליטר של דגימה ו-450 מיקרוליטר של מאגר פוספט כדי לשטוף צבע Cy 5.5 חופשי בעמודת סיבוב מסנן צנטריפוגלי. צנטריפוגה את עמוד הסיבוב ב -14, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הזרימה ואז העבירו את הדגימה המטוהרת לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.אחסן את ה-HerFab המטוהר עם התווית בארבע מעלות צלזיוס אלא אם כן מוכן לניתוח. התחל בהוספת 13 מיקרוליטר של HerFab מטוהר 7.8 מיקרומולר לצינור טרי. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטרים של מאגר דגימת חלבון LDS.דוגרים על התערובת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, חבר את קלטת הג'ל של ארבע עד 12% Bis-Tris SDS-PAGE לתא האלקטרופורזה. הוסף מאגר ריצה.לאחר מכן, טען את דגימות החלבון המצומדות ביצרן המשקל המולקולרי הצבוע מראש. בצע אלקטרופורזה בג'ל למשך 35 דקות ב -200 וולט. לאחר השלמת האלקטרופורזה, העבירו את הג'ל למערכת תיעוד וניתוח ג'ל.סרקו את Cy 5.5 ולאחר מכן צבעו את הג'ל בכתם חלבון מסחרי. במחקר זה, מקטע הנוגדן Her-Fab מצומד באופן ספציפי לאתר עם A זה מושג על ידי שילוב חומצת אמינו המכילה אזיד בשבר ולאחר מכן תגובה של מקטע הנוגדן המוטנטי עם ציקלאוקטין מתוח. ניתוח SDS-PAGE מבוצע עבור חלבונים מוטנטיים המתבטאים הן עם והן בלי חומצת האמינו המכילה אזיד.כפי שניתן לראות, שבר הנוגדן באורך מלא הושג רק בנוכחות חומצת האמינו. הנוגדן המכיל את חומצת האמינו מוערך לצימוד באמצעות תגובה עם נגזרת אזדיבנזוציקלאוקטין מקושרת Cy 5.5 Cy 5.5 ומנותח על ידי SDS-PAGE. תמונות הקרינה מראות צימוד של מקטע הנוגדן המוטנטי עם Cy 5.5 בעוד שלא נצפתה צימוד בביקורת.לאחר ביטוי נכון וטיהור החלבון שלך עם אצטילפנילאלנין, ניתן לתייג את החלבון ביעילות עם בדיקה עם הזן מכיוון שתגובת התיוג אינה דורשת מגיב נוסף, אתה יכול להכניס את הגשושית לחלבון היעד שלך פשוט על ידי ערבוב הגשושית עם החלבון שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכניס בדיקה כימית ספציפית למקטע נוגדן על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד.

efficient-site-specific-antibody-labeling-strain-promoted-azide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר...

שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

DNA וחלבונים-במיוחד רצף שכותרתו עם זיקה או קבוצות כתב ניאון באמצעות methyltransferases DNA או חלבון ואנלוגים cofactor סינטטיים. בהתאם לסגולי כקו-הפקטורים של האנזימים, aziridine או אנלוגים cofactor מופעלים כפולים מועסקים תיוג אחת או שני שלבים.

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

צבעי ציאנין עמידים לאור מחוברים לאוליגונוקלאוטידים כדי לנטר הכלאה על ידי העברת אנרגיה.

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי חלבונים קושרי מולקולות קטנים באמצעות תיוג פוטו-אפיניטי. היתרון בטכניקה זו הוא שקישור ותיוג קוולנטי של חלבוני המטרה מתרחש בסביבה התאית החיה, ומסיר את הסיכון לשיבוש מבנה החלבון המקומי ותנאי הקישור עם ליזיס התאים.

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

נוהל מפורט לסינתזה של אזיד 125 I-שכותרתו ואת radiolabeling של dibenzocyclooctyne (DBCO) -group מצומדות, 13 ננומטר בגודל ננו-חלקיקי זהב באמצעות תגובת לחץ ללא נחושת מתואר.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Radiolabeling היעיל של חלקיקי זהב על ידי שימוש<sup&gt; 125</sup&gt; שכותרתו לי אזיד תותבת קבוצה

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

שילוב נגזרת cyclopropene של ליזין נוגדנים מאפשר הצמדה בייעודי לאתר, מהיר ויעיל של מולקולות tetrazine מניבי לייצר נוגדן-סמים conjugates.

קידוד גנטי חומצת אמינו קאנונית לדור של נוגדן תרופתיים Conjugates דרך תגובה מהירה Bioorthogonal

ב פרוטוקול זה, נתאר את הסינתזה של התרמילים, phenyoxadiazolyl מתיל מבוססי sulfone ריאגנט של הקובץ המצורף באתר סלקטיבית של מטענים תיולים של מולקולות, במיוחד נוגדנים. בנוסף, נתאר את סינתזה ואפיון של chelator bifunctional של תרמילי מניבי, ההטיה שלה נוגדן מודל.

סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

פלואור שתייגת אנטיביוטיקה הם כלים רבי-עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד היבטים מרובים של עמידות מיקרוביאלית. מאמר זה מתאר את הכנת אנטיביוטיקה מתויג fluorescently היישום שלהם כדי ללמוד עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. רגשים יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים של עמידות חיידקים (למשל, אפלוקס) על ידי ספקטרופוטומטר, זרימה cy try, ו מיקרוסקופ.

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

למד שיטה לתיוג ספציפי של נוגדנים באמצעות חומצת אמינו המכילה אזיד ו-SPAAC. הטכניקה מאפשרת שילוב ביוקוניוגציה יעיל בחקר ביולוגיה כימית והנדסת חלבונים.

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

גלה סרטונים נוספים