Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום להתמיינות כונדרוגנית של ASC לתיקון סחוס פגום. שיטה זו היא לגרום להתמיינות פרכונדרוגנית של ASC באמצעות כוח כבידה צנטריפוגלי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התמיינות כונדרוגנית של ASC, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון התמיינות אוסטאוגנית ופיברוגנית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לגרום בקלות להתמיינות כונדרוגנית מתאי גזע מבלי לטפל בציטוקינים. המדגימים את ההליך יהיו ירי אליס רים ויוג'ון נאם מהמעבדה שלי. התחל בקצירת 80% תאי גזע שמקורם בשומן מצלחת תרבית של 100 מיליליטר על ידי השלכת המדיום ושטיפה עם חמישה מיליליטר PBS.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של PBS המכיל מילי-מולרי EDTA, ודגרו במשך שתי דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח המכיל 5% פחמן דו חמצני. לאחר שתי דקות, הקש בעדינות על צלחת התרבית ואז הוסף ארבעה מיליליטר של מדיום טרי והעביר את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים ב -250 פעמים גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר בינוני. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.

להעמסת כבידה צנטריפוגלית, העבירו 2.5 פעמים עשר עד התאים החמישיים לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב-2400 פעמים גרם למשך 15 דקות. לאחר הצנטריפוגה, המשך לתרבית גלולה או מיקרומסה. מיד לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוב את הסופרנטנט וב -500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות כונדרוגני, או CDM, ו -50 מיקרוגרם למיליליטר של חומצה L-אסקורבית 2-פוספט שהוכנה טרי לגלולה.

בקרה חיובית, לגרום להתמיינות כונדרוגנית ולאסוף את התאים שלה על ידי הוספת CDM המכיל 10 ננוגרם למיליליטר TGF-beta-1. יש לכסות את הצינורות באופן רופף ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח המכיל 5% פחמן דו חמצני למשך שלושה שבועות. מיד לאחר הצנטריפוגה העומסת על כוח הכבידה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-10 מיקרוליטר CDM.

ליצירת מיקרומסה, פיפטה את התאים התלויים מחדש למרכז באר של צלחת 24 באר ואז הנח את הצלחת לתוך החממה. לאחר שעתיים, הוסיפו בזהירות 500 מיקרוליטר CDM לבאר, תוך פיפטינג על דופן הצלחת כדי למנוע שיבוש המיקרומסה. כבקרה חיובית, בצע תרבית מיקרו-מסה עם תאים לא צנטריפוגים על ידי הוספת CDM המכיל 10 ננוגרם למיליליטר TGF-beta-1.

דגירה על המיקרו-מסה למשך שלושה שבועות. ביום 21 לאחר היווצרות מיקרו-מסה, השתמש בפיפטה כדי לקצור את כדורי הכדור, ולאחר מכן שטוף עם 1X PBS. תקן את כדורי הכדור על ידי טבילה ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות.

למחרת, השליכו את הקיבוע ושטפו את כדורי התאים במים נטולי יונים. הניחו שכבה אחת של גזה על קלטת הרקמות והעבירו את כדורי הכדור הקבועים באמצעות פיפטה. מכסים את הגלולה על ידי קיפול הגזה וסוגרים את מכסה הקלטת.

לאחר מכן, ייבשו את כדורי הכדור על ידי טבילה באתנול 70% למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, המשיכו בסדרה של ריכוזי אתנול למשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן טבלו את הכדורים ב-100% קסילן למשך 15 דקות.

טבלו את כדורי הכדור בפרפין בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס להטמעה. לאחר מכן, חותכים חמישה חלקים בעובי מיקרון מכדור התא המוטבע בפרפין באמצעות מיקרוטום סיבובי. צף את החלקים באתנול של 50%, ולאחר מכן העביר אותם לאמבט מים של 50 מעלות צלזיוס.

הרכיבו את החלקים הצפים על מגלשות, ולאחר מכן המשיכו לספרנין o וכחול אלציאן לצביעה חיסונית-פלואורסצנטית. כדי לקבוע כוח כבידה צנטריפוגלי מתאים, ASC סובבו בכוח משיכה צנטריפוגלי של אפס, 300, 600, 1, 200 ו-2, 400 פעמים גרם למשך חמש עשרה דקות. ביטוי ה-mRNA של SOX9 הוערך 24 שעות לאחר גירוי CG.

CG של 2, 400 פעמים g גרם באופן משמעותי לביטוי SOX9 mRNA. כדי להעריך את הביטוי של גנים הקשורים לכונדרוגנזה, סך ה-RNA הופק מ-ASC לא מגורים, ASC שעברו צנטריפוגה, או טופלו ב-TGF-beta-one. כפי שניתן לראות כאן, גירוי CG גורם לביטוי קולגן מסוג 2 ואגרקן.

ביטוי יתר של קולגן מסוג 2 ב-ASC שטופלו ב-CG אושר על ידי אימונופלורסנט באמצעות נוגדן נגד קולגן מסוג 2 בנוגדנים משניים מצומדים Alexa Fluor 594. כדי לקבוע את ההשפעה של CG על ביטוי יתר של ECM הקשור לכונדרוגנזה, ASC טופלו ב-TGF-beta-one כביקורת חיובית. הביקורת השלילית הייתה תרבית גלולה שאינה נתונה להעמסת CG, או טיפול TGF-beta-one.

ביטוי יתר של ECM הקשור לכונדרוגנזה הוערך בכדורי ספרואידים המורכבים מ-ASC צנטריפוגה באמצעות שימוש בספרנין o וצביעה כחולה אלציאנית. גליקוזאמינוגליקן, מרכיב עיקרי בסחוס המפרקי, נצבע בכחול על ידי כחול אלציאני, או בכתום על ידי ספרנין o. לאחר 14 יום של תרבית מיקרו-מסה, עיבוי כונדרוציטים הוערך לפי גודל האגרגטים.

גודלו של כל אגרגט, שנוצר על ידי CG, היה בסביבות 0.5 מילימטרים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום להתמיינות כונדוגנית של תאי גזע באמצעות כוח כבידה צנטריפוגלי.