Name: Metagenomic ניתוח של תחמיץ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למד ניתוח מטגנומי באמצעות shotgun sequencing לזיהוי קהילות חיידקיות בתחמיץ. השיטה כוללת חילוץ DNA, הכנת ספרייה וביואינפורמטיקה עם Kracken ו-CHROMA לסיווג טקסונומי ואנוטציה פונקציונלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לאנדרו בירד על דגימות התחמיץ ולאודרי פרבוס משירות ריצוף ה-DNA של אקסטר על עזרתה בהכנת ספריות ריצוף DNA. שירות ריצוף אקסטר ומתקני ליבה חישוביים באוניברסיטת אקסטר. פרס התשתית הקלינית של מועצת המחקר הרפואי (MR/M008924/1). קרן התמיכה האסטרטגית המוסדית של Wellcome Trust (WT097835MF), פרס הציוד הרב-משתמש של Wellcome Trust (WT101650MA) ופרס BBSRC LOLA (BB/K003240/1).

למחברים אין מה לחשוף.

בעוד בניתוח סיליקון יכול לתת תובנה מצוינת קהילות החיידקים שנמצאות בתוך דגימות סביבתיות, זה קריטי, כי הסיווגים טקסונומיות הפגינו להתבצע בשיתוף עם בקרות רלוונטיות וכי בעומק של רצף מתאים הושג על מנת ללכוד את כולו אוכלוסיית 51 נוכחית. עם כל ניתוח חישובית, ישנם מסלולים רבים כדי להשיג מטרה דומה. השיטות שבהם השתמשנו במחקר זה הם דוגמאות של שיטות מתאימות וישירה, כי כבר הפגיש להשיג מגוון של ניתוחים על Microbiome תחמיץ. מגוון ומספר גדל והולך של כלי ביואינפורמטיקה וטכניקות זמינים לנתח נתונים metagenomic, למשל Phylosift 8 ו MetaPhlAn2 52, ואלה יש להעריך לפני החקירה עבור הרלוונטיות שלהם המדגם req ניתוחuired 53. שיטות ניתוח metagenomic מוגבלים על ידי מסדי נתונים עבור זמין עבור סיווג, עומק רצף ואיכות רצף. עיבוד bioinformatic הפגין כאן בוצע על מחשב מקומי, גבוה Powered; אולם מערכות מבוססות ענן זמינים אף הם. שירותי ענן מבוסס אלה מאפשרים להשכרה של כוח מחשוב הדרושים מבלי השקעת העלות הגבוהה של עבודה מקומית חזקה מתאימה. יישום הפוטנציאל של שיטה זו יהיה להעריך תחמיץ לפני השימוש בו בחקלאות, כדי לוודא ששום חיידקים מזיקים נוכחים ולכן למנוע מהם להיכנס לשרשרת המזון.

Metagenomics הוא הניתוח הישיר של DNA מטוהר מן הקהילות ביולוגיות נמצאות בתוך דגימות סביבתיות 1 ו שמש במקור כדי לזהות חיידקי unculturable נמצאים במשקעים 2. Metagenomics כבר בשימוש נרחב במשך מספר יישומים, כגון זיהוי Microbiome האדם 3, לסיווג אוכלוסיות חיידקים בתוך האוקיינוס 4 ואפילו לניתוח של קהילות חיידקים המתפתחים על מכונות קפה 5. המבוא של טכנולוגיות רצף הדור הבא הביא תפוקת רצף גדולה ופלט. כתוצאה מכך, רצפי DNA הפכו יותר חסכוניים 6 ואת העומק של רצף שניתן לבצע גדלה מאוד, מה שמאפשר metagenomics להפוך כלי רב עצמה, אנליטי. &quot;Front-end&quot; שיפורים בהיבט המעשי, המולקולרי של רצף metagenomic הניעו את הצמיחה של בכלי ביואינפורמטיקה סיליקון זמין עבור הסיווג הטקסונומי 7-9, ביאור תפקודי 10,11 וייצוג חזותי 12,13 של נתוני רצף DNA. מספר הגדל וההולך של זמין, רצף פרוקריוטים ו האיקריוטים 14 הגנום מאפשר דיוק נוסף בסיווג קהילות חיידקים, אשר מבוצעות תמיד מול מסד נתוני התייחסות &quot;עורפי&quot; של הגנום רצף 15. שתי גישות עיקריות ניתן לאמץ לניתוח metagenomic. השיטה המקובלת יותר היא ניתוח של הגן 16S rRNA קידוד באזור של הגנום של חיידקים. 16S rRNA הוא שמור ביותר בין המינים פרוקריוטים אבל מפגין תשעה אזורים היפר-משתנה (V1 - V9) אשר ניתן לנצל לצורך זיהוי מינים 16. המבוא של רצף ארוך יותר (≤ 300 נ&quot;ב סוף לזווג) מותר לניתוח רצפי DNA פורש שני אזורים-משתנה יתר, בפרטV3 - באזור V4 17. התקדמות בטכנולוגיות רצף אחרות, כגון אוקספורד nanopore 18 PacBIO 19, מתירה את גן 16S rRNA כולו להיות רצף בסמיכות. בעוד 16S ספריות מבוססות rDNA לספק גישה ממוקדת, לשם זיהוי מינים ולאפשר זיהוי של דנ&quot;א מספר נמוך עותק המתרחש באופן טבעי בתוך דגימות מטוהרות, ספריות רצף רובה לאפשר זיהוי של מינים שעלולים להכיל אזורי DNA כי הם או לא amplifiable ידי 16S רצפי פריימר סמן rRNA בשימוש, או בגלל ההבדלים בין רצף התבנית ואת רצף הגברה פריימר גדולים מדי 20,21. יתר על כן, למרות polymerases DNA יש איכות גבוהה של שכפול ה- DNA, שגיאות בסיס בכל זאת יכולה להתרחש במהלך הגברת PCR ושגיאות המשולבות אלה עלולות לגרום סיווג שגוי של שמקורם מינים 22. הטיות הגברת PCR של seq התבניתמשפיעה יכולה להתרחש גם; רצפים של DNA עם תוכן GC גבוה יכולים להיות בתת-ייצוג בברכת amplicon הסופי 23 ובדומה שינויי בסיס טבעיים, כגון גליקול תימין, יכול לעצור polymerases DNA גורם כשלי ההגברה של DNA רצפי 24. לעומת זאת, ספריית DNA רצף אקדח היא ספריית DNA כי הוכנה באמצעות כל ה- DNA מטוהר כי כבר שחולץ ממדגם ובהמשך מקוטע לתוך אורכי שרשרת דנ&quot;א קצר לפני הכנה על רצף. סיווג טקסונומי של רצפי DNA שנוצר על ידי רצף הרובה הוא יותר כמדויק בהשוואה רצף amplicon 16S rRNA 25, למרות העלות הכספית הנדרשת כדי להגיע לעומק רצף אמין הוא גדול יותר מזה של רצף amplicon 26. היתרון העיקרי של metagenomics רצף אקדח הוא שאזורי רצף של הגנום השונה במדגם זמינים וסיקור גן פעם הם היוסווג 27 טקסונומית. נתוני רצף metagenomic מנותחים על ידי מגוון גדל והולך של כלי bioinformatic. כלים אלה מסוגלים לבצע מגוון רחב של יישומים, למשל, ניתוח בקרת איכות של הנתונים רצף גלם 28, חופפים של סוף לזווג קורא 29, דה נובו הרכבה של רצף מקריא contigs ופיגומים 30,31, הסיווג הטקסונומי וויזואליזציה של רצף הקורא התאסף רצפי 7,12,32,33 ואת הביאור התפקודי של רצפים התאספו 34,35. תחמיץ, המיוצר על ידי חקלאים בכל רחבי העולם מדגנים מותססים כמו תירס (Zea Mays), משמש ברובה כמו לבהמות. תחמיץ מטופל עם sp לקטובצילוס חיידק. כדי לסייע תסיסה 36 אך עד כה, יש ידע מוגבל של אוכלוסיות חיידקים אחרים שנמצאו תחמיץ. fermentatioתהליך n יכול להוביל מיקרו אורגניזמים בלתי-רצויים ומזיקים פוטנציאל להיות נפוץ בתוך תחמיץ 37. בנוסף שמרים ועובש, חיידקים הם סתגלניים במיוחד לסביבת אנאירובי תוסס תחמיץ ומזוהים בתדירות גבוהה יותר עם מחלות בעלי חיים ולא השפלה של התחמיץ 38. חיידקים חומצה בוטירית ניתן להוסיף בטעות מאדמת נשאר בעת מילוי בממגורות תחמיץ והם מסוגלים להמיר את חומצת חלב, תוצר של עיכול אנאירובי, חומצה בוטירית, ובכך להגדיל את רמת החומציות של תחמיץ 39. העלייה זו pH יכולה להוביל להתגברות חיידקים מקולקלים לא יוכל בדרך כלל כדי לקיים את צמיחה בתנאי תסיסת תחמיץ אופטימלי 38. Spp Clostridium. , Spp ליסטריה. ו spp Bacillus. הם מדאיג במיוחד, במיוחד תחמיץ עבור להאכיל בקר לחלב, כפי נבגי החיידקים ששרדו את gastrבדרכי ointestinal 40 יכולות להיכנס-שרשרת מזון, להוביל קלקול מזון, במקרים נדירים, כדי חי למותם של בני אדם 37,39,41-44. יתר על כן, בעוד שקשה להעריך את ההשפעה הכלכלית המדויקת של טיפול וטרינרים ואובדן בעלי חיים הנגרם על ידי קלקול תחמיץ, היא עשויה להיות מזיק חווה אם התפרצות הייתה להתרחש. ההשערה היא כי באמצעות גישת metagenomic אנחנו יכולים לסווג אוכלוסיות החיידקים שנמצאות בדגימות תחמיץ ויתר על כן לזהות קהילות חיידקים הקשורים קלקול תחמיץ כי היו, בתורו, יש פוטנציאל השפעה מזיקה על בעלי החיים, המאפשר פעולה מתקנת כדי להיות נלקח לפני התחמיץ הוא לשמש כמקור מזון.

<table><tbody><tr><td>ערכת SPIN FastDNA לאדמה</td><td>MP ביו</td><td>116560200</td><td>מיצוי DNA</td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP ביו</td><td></td><td>116004500 מיצוי DNA</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP חרוזים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63880</td><td>מאגר טיהור DNA</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>טיהור DNA</td></tr><tr><td>קיוביט פלואורומטר</td><td>תרמו פישר</td><td>Q33216</td><td>DNA כימות</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>תרמו פישר</td><td>Q32854</td><td>כימות DNA</td></tr><tr><td>Nextera XT ערכת הכנה לספריית</td><td>DNA Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>הכנת ספרייה</td></tr><tr><td>Nextera XT ערכת אינדקס</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>הכנת ספרייה</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>DNA</td></tr><tr><td>Quantification HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>כימות DNA</td></tr><tr><td>HS D100 ריאגנטים של סרט מסך</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>כימות DNA</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>כימות DNA</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 ו-401425</td><td>כימות DNA</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA Sequencing - מסופק על ידי א שירות רצף</td></tr><tr><td>תחנת עבודה ניתוח הספק גבוה</td><td>שונים</td><td></td><td>מקומיים או מבוססי ענן, מערכת מועדפת על המשתמש</td></tr></tbody></table>

metagenomic ניתוח של תחמיץ

Metagenomic Analysis of Silage

מטגנומיקה מוגדרת כניתוח ישיר של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) המטוהרת מדגימות סביבתיות ומאפשרת זיהוי טקסונומי של הקהילות המיקרוביאליות הקיימות בתוכן. קיימות שתי גישות מטגנומיות עיקריות; ריצוף אזור קידוד הגנים 16S rRNA, המציג שונות מספקת בין טקסונים לזיהוי, וריצוף רובה ציד, שבו מנותחים גנומים של האורגניזמים הנמצאים בדגימה ומיוחסים ל"יחידות טקסונומיות תפעוליות"; מינים, סוגים או משפחות בהתאם למידת כיסוי הרצף. 
במחקר זה, נעשה שימוש בריצוף רובה ציד כדי לנתח את הקהילה המיקרוביאלית הקיימת בתחמיץ בקר, ובשילוב עם מגוון כלים ביואינפורמטיים לבדיקת איכות וסינון קריאות רצף ה-DNA, לבצע סיווג טקסונומי של אוכלוסיות החיידקים הקיימות בתוך התחמיץ שנדגם, ולהשיג הערות פונקציונליות של הרצפים. שיטות אלו שימשו לזיהוי חיידקים שעלולים להזיק שהיו קיימים בתוך התחמיץ, אינדיקציה לקלקול תחמיץ. אם תחמיץ מקולקל אינו מתוקן, אז בבליעה הוא עלול להיות קטלני לבעלי החיים.

לפני עיבוד bioinformatic, רצף גלם קורא קוצצו ומתאמים הוסרו באמצעות Trimmomatic תוכנה 28. לאחר שלב הזמירה וסינון, מספר כניסות הופחת ל -50% של רצף הקורא (טבלה 1). ציון Phred הבסיס הממוצע היה&gt; 30 לאחר בקרת איכות (איור 2). זוגות של רצפי DNA אשר היו אזורים חופפים מוזגו באמצעות תוכנת FLASH 29 כדי ליצור אחת כבר קורא, שאינו חופף קורא נשמרו בקובץ נפרד. 45.47% קורא (105,343) בשילוב בהצלחה. בעקבות חופפים של קורא באמצעות FLASH של קורא, שברי הוארך וכתוצאה מכך עברו הסיווג הטקסונומי חיידקי באמצעות קראקן תוכנה 7 ו היו דמיינו לאחר מכן עם תוכנת כתר (איור 3). .within-page = "1"&gt; רוב מינים של חיידקים הנמצאים metagenome תחמיץ נמצאים בתוך 4 טווח המערכת פרוקריוטים: Firmicutes (34%), Actinobacteria (28%), פרוטאובקטריה (27%) ו Bacteroidetes (7%) . חלוקת כיתות הנוכחי בתוך טווח המערכת אלה ניתן לראות באיור 4. המין הנפוץ ביותר metagenome היה spp לקטובצילוס. (24%; Firmicutes), spp Corynebacterium. (8%; Actinobacteria), spp Propionibacterium. (3%; Actinobacteria) ו spp Prevotella. (3%; Bacteroidetes). מינים חשובים לבריאות בעלי חיים הקשורים במחלות נצפו גם; Spp Clostridium. (1%) spp Bacillus. (0.6%), spp ליסטריה. (0.2%) נחזו להיות נוכח במדגם התחמיץ. ביאור פונקציונלי בוצע על התאספו קורא. Metagenome הורכב באמצעות מאסף Spades 30 באמצעות גזוז ומסונןלזווג-end מזווג קורא ליצירת 92,284 פיגומים. על מנת לזהות cellulases, חלבונים נחזו באמצעות MG-RAST והערות באמצעות מסד אנזימים פחמימות-Active (CAZy). של 97,562 חלבוני חזה, 6357 היו מפורשים כמו אנזים בפחמימות פעילות המשוערת באחד מחמש מעמדות האנזימים שמרכיבות את מסד נתוני CAZy (איור 5). תוצאות היו דמיינו כמו דיאגרמת ון באמצעות תוכנת InteractiVenn 50 מראה את חלוקת הסברי חלבון כולל אלו המכילים יותר מאחד ביאור בכיתת אנזים CAZy. מבין אלה, נחזו 3861 לקיים פעילות hydrolase glycoside ו יאופיינו הלאה במעבדה כדי לאשר פונקציה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg"> איור 1: bioinformatic Metagenomics צינור עבור הניתוח של תחמיץ. שתי גישות עיקריות היושימוש כדי לחקור את Microbiome של תחמיץ, סיווג הטקסונומי ביאור תפקודי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg"> איור 2: איכות רצף Per-בסיס לפני ואחרי קיצוץ מתאם הסרה. רצף שידורי בסיס עלילת איכות FASTQC מציגה את הציון הממוצע Phred פני האורך של הרצף קורא בקרת איכות לפני ואחרי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg"> איור 3: טקסונומי Classification של Microbiome חיידקית של תחמיץ מוצק. סיווג של רצף גזוז וחופפים קורא מתוך FLASH בוצע באמצעות קראקן 7 ובהמשך מדמיין עם כתר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg"> איור 4: התפלגות מחלקה טקסונומי של 4 טווח המערכת בשכיחותו Microbiome חיידקית של תחמיץ מוצק. האחוז לכל סוג של חיידקים בתוך ארבעה טווח המערכת הנפוצה ביותר. Firmicutes: וקלוסטרידיאה.את (אדום) ואת החיידקים (כחול כהה); פרוטאובקטריה: דלתא / אפסילון (ורוד), אלפא (בצבע כחול חיוור), גמא (כתום) בטא (טורקיז); Bacteroidetes: Flavobacteriia (כחול כהה) ו Bacteroidia(ירוק חיוור); Actinobacteria: Coriobacteriia (סגול כהה) ו Actinobacteria האחר (ירוק כהה). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg"> איור 5: CAZy ביאור של Proteome החזוי של Microbiome התחמיץ המוצק. דיאגרמת ון מראה את חלוקת חמשת כיתות האנזים מהערות CAZy ב proteome החזוי של Microbiome תחמיץ מוצק. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קורא # גלם </td><td rowspan="2"> # מסונן קורא (זיווג) </td> # מסונן קורא <td rowspan="2"> # הבזיק קורא </td></tr><tr><td> (מְזוּוָג) </td><td> (מזווג) </td></tr><tr><td> 2,374,949 x2 </td><td> 231,679 x2 </td><td> 1,892,534 </td><td> 105,343 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: סיכום טבלת רצף קורא.

Metagenomics שימש לחקירת המיקרוביום של מזון בקר תחמיץ. הניתוח בוצע על ידי ריצוף רובה ציד. גישה זו שימשה לאפיון הרכב הקהילה המיקרוביאלית בתוך מזון הבקר.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להבין את קהילת החיידקים הקיימת בתוך דגימת תחמיץ, אם כי ניתן ליישם הליכים אלה על מגוון סוגי דגימות שונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בעת זיהוי הקהילות הפרוקריוטיות שנמצאות בתוך מערכות מיקרוביאליות מורכבות, כמו במקרה המוצג כאן, תחמיץ למזון לבעלי חיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שנעשה שימוש בריצוף רובה ציד במקום ריצוף אמפליקון 16S הקונבנציונלי יותר, מה שמאפשר דיוק הרבה יותר גדול בעת סיווג המיקרוביום.ניתן ליישם שיטה זו על מגוון רחב של דגימות אחרות שבהן עלולים להיווצר מיקרוקוסמוס מורכב, כגון במעיים אנושיים, על פני העור, בדגימות מים או אפילו סביב מכונת הקפה המשרדית. ערכה מסחרית משמשת לחילוץ DNA מדגימת התחמיץ. התחל הליך זה על ידי הוספת 100 עד 400 מיליגרם מהדגימה ל-978 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט ו-122 מיקרוליטר של מאגר ליזה בקרקע בצינור הליזיס המצורף.כלול בקרה שלילית שאין לה דגימת תחמיץ. הומוגניזציה של הדגימות על ידי הכנסת צינורות הליזיס להומוגניזטור למשך 40 שניות במהירות של 6.0 מטר לשנייה. צנטריפוגה את הליזטים למשך 15 דקות.העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי המכיל 250 מיקרוליטר של תמיסת משקעים חלבון וערבבו את התמיסה על ידי היפוך 10 פעמים. ואז צנטריפוגה למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה נקי של 15 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מטריצת קשירת DNA.מערבבים את התמיסה על ידי היפוך הצינור כל הזמן למשך שלוש דקות. הניחו לתערובת להתייצב במשך שלוש דקות, ואז השליכו 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט וערבבו את הסופרנטנט הנותר על ידי פיפטינג. העבירו 600 מיקרוליטר מהמתלה למסנן ספין וצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים G למשך דקה אחת.השליכו את המסנן וחזרו על התהליך עם המתלה שנותר. לאחר השלכת הסינון, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה למטריצת קשירת ה-DNA בתוך מסנן הספין, ערבב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה ב-14,000 פעמים G למשך דקה אחת. השלך את המסנן והצנטריפוגה את מסנן הסיבוב למשך שתי דקות כדי להבטיח שכל מאגר הכביסה הוסר.יבש את מסנן הסיבוב בחום של 23 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הוסף 100 מיקרוליטר של מים נטולי DNase מחוממים מראש למטריצת קשירת ה-DNA והעביר את מסנן הספין לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב-14,000 פעמים G למשך דקה אחת כדי לחסל את ה-DNA.אחסן את ה-DNA במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שיהיה צורך בניתוח נוסף. ה-DNA המופק מדגימות תחמיץ יטוהר באמצעות חרוזי טיהור DNA. מוציאים את החרוזים מהמקרר ומשאירים אותם בחום של 23 מעלות לפחות 30 דקות לפני השימוש.הוסף שני נפחים של חרוזים לכל דגימת DNA ודגר את התמיסה ב-23 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הניחו את הדגימות על מגנט הפרדה למשך חמש דקות ולאחר מכן השליכו את הסופרנטנט. שוטפים את החרוזים פעמיים עם 200 מיקרוליטר אתנול טרי 80%.יבש את החרוזים באוויר למשך 10 דקות החרוזים צריכים להיות יבשים מספיק, אך לא מיובשים יתר על המידה, ולכן חיוני לבדוק חזותית את החרוזים לפני שממשיכים. הסר את הדגימות ממגנט ההפרדה, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה וערבב על ידי פיפטינג. דגרו את המתלה בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן הניחו את הדגימות בחזרה על מגנט ההפרדה למשך שלוש דקות.העבירו את הסופרנטנט המכיל את הדנ"א לצינור נקי והשליכו את החרוזים. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו פתרון עבודה באמצעות יחס של 199 לאחד של מאגר למגיב. הוסף 10 מיקרוליטר מכל תקן DNA ל -190 מיקרוליטר של תמיסת עבודה.הוסף 10 מיקרוליטר DNA מטוהר ל -190 מיקרוליטר של תמיסת עבודה. דגרו את הדגימות הסטנדרטיות וה-DNA ב-23 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר מכן, נתח את התקנים לפני דגימות ה-DNA על הפלואורומטר בהתאם להוראות שעל המסך.חיוני שה- DNA המטוהר יהיה באיכות טובה ומכומת במדויק, כך שאם יש ספק לגבי איכות וריכוז ה- DNA, יש לחזור על מיצוי ה- DNA. ספריית ריצוף רובה הציד מוכנה באמצעות ערכת הכנה לספרייה מסחרית. מדללים את דגימות ה-DNA ל-0.2 ננוגרם למיקרוליטר באמצעות מאגר פליטה.מערבבים חמישה מיקרוליטרים של ה-DNA המטוהר עם 10 מיקרוליטר של מאגר תיוג וחמישה מיקרוליטרים של תערובת אנזימי תיוג. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הוסף חמישה מיקרוליטרים של מאגר מנטרל לכל דגימה ודגר את התמיסה ב-23 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטר מכל אחד ממדדי הריצוף הספציפיים לדגימה ו -15 מיקרוליטר של תערובת המאסטר PCR. הכניסו את הדגימות לתרמו-סייקלר ובצעו PCR. טהר את ה-DNA המוכן בשיטת טיהור החרוזים כפי שהודגם קודם לכן, אך עם פליטה סופית של 30 מיקרוליטר של מאגר פליטה.לאחר מכן, ה-DNA מרוצף ומגוון כלים ביואינפורמטיים משמשים לניתוח נתוני הרצף כמתואר בפרוטוקול הטקסט. סיווג טקסונומי של המיקרוביום החיידקי בוצע באמצעות תוכנת Kracken ולאחר מכן הוצג באמצעות תוכנת CHROME. רוב מיני החיידקים הקיימים במטגנום התחמיץ נמצאים בתוך ארבעה פילה פרוקריוטית, פירמיקוטים ב-34% אקטינובקטריה ב-28% פרוטאובקטריה ב-27% ובקטורואיטיס ב-7%התפלגות המחלקות הקיימות בתוך פילה אלה מצוינת גם כן.הערות פונקציונליות שבוצעו על קריאות מורכבות הביאו ל-6,357 חלבונים חזויים המבוארים כאנזים פעיל פחמימות משוער ואחת מחמשת מחלקות האנזימים המרכיבות את מסד הנתונים של האנזימים הפעילים בפחמימות. דיאגרמת ון זו מציגה את התפלגות הערות החלבון, כולל אלה המכילים יותר מביאור אחד של מחלקת אנזימים. מתוכם, 3,591 נחזו לפעילות גליקוזיד הידרולאז.לאחר השליטה, ניתן להשלים את הכנת ספריות ריצוף ה-DNA ביום אחד אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לוודא שאין זיהום צולב בין דגימות ולהשתמש תמיד בבקרות מתאימות כגון ריק. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוחים ביופומטיים אחרים על מנת לאמת את הסיווגים שבוצעו על ידי קראקן.טכניקות מטאגנומיות אלה מאפשרות לחוקרים לחקור את המיקרוביום במערכות מורכבות רבות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ספריות ריצוף DNA מטגנומיות ולבצע ניתוחים ביואינפורמטיים על קריאות רצף ה-DNA שהתקבלו. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים קושרי DNA עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש ללבוש אמצעי זהירות כגון כפפות ומעילי מעבדה בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים...

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

קונסורציומים חיידקים בתוך bumble דבורים כוורות להעשיר ולשמר אבקה של דבורה הזחלים. באמצעות רצף הדור הבא, יחד עם המעבדה, המבוסס על שדה ניסויים, כתב יד זה מתאר פרוטוקולים המשמשים כדי לבדוק את ההשערה כי שאריות פטריות לשנות את microbiome אבקה, ודמוגרפיה המושבה, המוביל בסופו של דבר אל המושבה הפסד.

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות יש אפליקציות רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית, ניטור סביבתי metagenomic אפיון בקטריאלי עמידות לאנטיביוטיקה. במאמר זה, הוכח נוהל metagenomic אדמה רצפי DNA לצורך זיהוי מינים בטכנולוגיה רצף nanopore.

Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכין דגימות דנ א מזון, סביבתית microbiomes זיהוי מתואמת, subtyping של חיידקי סלמונלה דרך רצף quasimetagenomic. שימוש משולב של העשרת תרבות, immunomagnetic ההפרדה (IMS) ועקירה מרובים הגברה (מד א) מאפשרת ריכוז אפקטיבי של DNA גנומי סלמונלה מזון ודוגמאות סביבתיים.

ניתוח קוואזי-metagenomic של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור אמפליקון מטגנומי לקביעת אוכלוסיית החיידקים של ענבי טרמינט, ענבים מותססים ויין סופי.

יצירת פרופיל של אוכלוסיית החיידקים של תסיסה של ענבי טרמינט במהלך ייצור היין באמצעות ריצוף אמפליקון מטאגנומי

מוצגת שיטה לניתוח מטבולומי של שעורה. השיטה כוללת פיצול ונגזרת של מטבוליטים וניתוחם על ידי כרומטוגרפיה גזית/ספקטרומטריית מסה (GC/MS). ניתן להשתמש בניתוח מטבולומי כדי לקבוע את ההשפעה של גידול משולב ולחץ בצורת על התבואה.

ניתוח מטבולומי של שעורה על ידי כרומטוגרפיה גזית/ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה וחסכונית של הרכב החיידקים במוצרי חלב על ידי שילוב קולטורומיקה עם MALDI-TOF MS. הוא מספק תוצאות טקסונומיה דומות לריצוף 16S rRNA עם זמן אספקה קצר יותר משיטות תרבית מסורתיות.

הערכת בטיחות מיקרוביאלית של מחלבות באמצעות פרופיל פרוטאומי חיידקי באמצעות גישת MALDI

למד ניתוח מטגנומי באמצעות shotgun sequencing לזיהוי קהילות חיידקיות בתחמיץ. השיטה כוללת חילוץ DNA, הכנת ספרייה וביואינפורמטיקה עם Kracken ו-CHROMA לסיווג טקסונומי ואנוטציה פונקציונלית.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

גלה סרטונים נוספים