פגיעה איסכמיה reperfusion התרמה בעור האוזן עכבר Intravital multiphoton הדמיה של המערכת החיסונית

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להבין כיצד תאי חיסון מגיבים לאיסכמיה באמצעות הדמיה רב-פוטונית תוך-חיונית של עור אוזן העכבר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה מהשאלות החשובות ביותר בתחום האימונולוגיה והדרמטולוגיה כדי להבין את ההתנהגות הדינמית של תא החיסון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מודל הדמיה חזק לחקר פעילויות תאיות בעור במצב דלקתי או מנוחה.

למרות ששיטה זו עשויה לספק תובנה לגבי פגיעות רפרפוזיה איסכמיות, ניתן ליישם זאת גם על מערכות אחרות כגון תגובות רגישות יתר כמו גם זיהומים. כדי להתחיל בהליך זה, הנח את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גופו על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הליך ההכנה. אשר את עומק ההרדמה על ידי היעדר רפלקס צביטה בבוהן.

לאחר מכן, יש למרוח חומר סיכה עיניים על עיני החיה כדי למנוע יובש בזמן ההרדמה. לאחר מכן, מרחו בזהירות קרם אפילציה על שני השלישים העליונים של האוזן הגבית והמתינו שתיים-שלוש דקות. לאחר מכן, הסירו את הקרם בעזרת אפליקטורים רטובים מכותנה בצורה יסודית אך עדינה.

כעת, השרה איסכמיה בעור אוזן העכבר באמצעות מגנטים ניאודימיום. לשם כך, ראשית הכנס את המגנטים למכווני הפלסטיק האישיים שלהם. מקם מגנט אחד כך שרק הקצה ייגע עם מגנט גחון שני, אותו יש למקם מתחת לצד הגחון של האוזן כשהאוזן מונחת שטוחה על המגנט.

ברגע שמוכן, תן בזהירות למגנטים להתאחד. לאחר 1.5 שעות של איסכמיה, הסר את המגנטים על ידי סיבובם זה מזה באמצעות מכווני הפלסטיק, מה שמאפשר לעירוי מחדש. מיד לאחר הסרת המגנט, יש לתת את אוונס בלו או חומר תיוג כלי דם אחר לבחירתכם דרך הווריד.

בשלב זה, חותכים שתי חתיכות נייר דבק. הניחו לדפנות הדבק להיצמד זו לזו תוך השארת כמילימטר אחד של דבק לרוחבו. לאחר מכן, חתוך את המסקינגטייפ לשניים כדי להתאים את מיקומו בתוך החריץ על משטח האוזן.

הכנס את נייר הדבק הזה בערך באמצע הדרך דרך החריץ כך שהצד הדביק פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מקם את העכבר על כרית החימום כך שהאוזן שיש לצלם תהיה ליד רצועת נייר הדבק. על ידי שימוש בשני אפליקטורים עם קצה כותנה לח PBS, לחץ בעדינות את האוזן על רצועת ההדבקה.

השתמש ברצועה כמדריך, הביא את אוזן העכבר דרך החריץ ובמקביל כוונן את העכבר קרוב יותר לכיוון הבמה. מכיוון שעור האוזן שביר מאוד, שלב זה חייב להיעשות בזהירות רבה כדי למנוע פציעות הנגרמות על ידי הכנה. כדי להסיר את הסרט הדביק, הוסף תחילה טיפה של PBS כדי להפחית את הדבקות של הסרט.

לאחר מכן, הפרד את אוזן העכבר מסרט המיסוך בעדינות ככל האפשר בעזרת מברשת צבע עדינה. שטח את האוזן כנגד משטח האוזן על ידי גלגול עדין של אפליקטור כותנה לח על האוזן. לאחר מכן, הניחו טיפה של PBS מתחת לכיסוי והניחו אותה בעדינות מעל האוזן.

לאחר מכן, הכנס את בדיקת הטמפרטורה הרקטלית וחבר את החוטים למערכת החימום בהתאם להוראות היצרן. כדי לרכוש תמונות, הנח את החיה מתחת למיקרוסקופ הרב-פוטוני. התחל עם אזור הדמיה שנמצא בסמיכות לקצה האיסכמיה המאופיין בדליפה מסיבית של אוונס בלו.

התרשים הסכמטי כאן מראה את מיקום המגנטים. שתי התמונות הללו מציגות אוזן טרום-איסכמית ופוסט-איסכמית לאחר הידוק מגנט. בסכימה זו של האוזן מציין את האזור המצולם ביחס למקום בו הוצב המגנט.

רצף זמן זה של הקרנה מקסימלית, מראה את חדירת הנויטרופילים בתגובה לרפרפוזיה בעור אוזן עכבר לבקן LysM-eGFPM לאחר 1.5 שעות של איסכמיה. בנקודות זמן מוקדמות יותר, היעדר האות הכחול של אוונס מצביע על חסימה זמנית של כלי הדם לאחר איסכמיה. לאחר השליטה, ניתן לבצע הכנות לאוזן האיסכמית להדמיה תוך פחות מ-30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבדוק כל הזמן את עומק ההרדמה ואת טמפרטורת העכבר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטה אחרת כמו צביעת עכבר שלם של עור אוזן העכבר כדי לקבל תצוגה גלובלית של הלוקליזציות התאיות. לאחר פיתוחו של פרוטוקול זה, הוא סלל את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה והדרמטולוגיה לחקור חסינות מולדת בעור אוזני העכבר.

לאחר צפייה בסרטונים אלה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים מודל הדמיית עור אוזן עכבר כדי לחקור פגיעה איסכמית ברפרפוזיה. אל תשכח שעבודה עם מיקרוסקופ מולטיפוטו עלולה להיות מסוכנת. ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון הדרכת בטיחות בלייזר.