הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להנדס גורמי שחבור מלאכותיים שיכולים לתפעל באופן ספציפי שחבור חלופי של מטרה נתונה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום עיבוד ה-RNA, כגון ויסות ווויסות שגוי של שחבור חלופי בתאים סרטניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הגמישות שלה.

אנו יכולים לתכנן גורמים מלאכותיים המקדמים או מעכבים סוגים שונים של שחבור חלופי בכל גן נתון. ידגימו את ההליך הזה הואן-הואן, עמית מחקר במעבדה שלי, וצ'יאן-יון, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. DNA PUF מסוג בר משמש כתבנית ליצירת פיגום תחום PUF המותאם אישית.

השתמש בפריימרים PCR המכילים רצפי PUF המזהים באופן ספציפי נוקלאוטידים שונים של RNA בכל מיקום. עבור כל חזרה על PUF, השתמש בארבעה פריימרים שונים כדי לזהות בסיס שונה בכל מיקום. בסיבוב הראשון של PCR, השתמש בזוגות הפריימרים המוצגים כדי ליצור רצפי קידוד עבור ארבע חזרות PUF, שברי גשר אוניברסליים ושברי כובע.

בסיבוב השני, השתמש במוצרי ה-PCR שנוצרו בשלב האחרון כתבניות עם שילובי הפריימרים שהוכחו כמייצרים רצפי קידוד עבור קודי זיהוי RNA R-אחד עד R-4, ו-R-5 עד R-8. בסיבוב השלישי, השתמש במוצרים מהסיבוב השני וגשר בין ארבע לחמש כתבניות עם פריימר R-one קדימה ופריימר הפוך R-eight כדי ליצור רצפי קידוד עבור R-one ל-R-8 ללא כובעים. בסיבוב הרביעי PCR, השתמש ב-R-one עד R-eight, במכסה קצה של חמישה ראשוניים ובמכסה קצה של שלושה ראשוניים כתבניות, כדי ליצור רצפי קידוד עבור תחומי PUF שלמים.

כדי להתחיל בטרנספקציה של תאי HEK-293T, מערבבים את מגיב הטרנספקציה הליפוזומלי על ידי היפוך עדין של הבקבוקים. לאחר מכן יש לדלל שני מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה ליפוזומלי ב-50 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לכל טרנספקציה. מערבבים בעדינות ואז דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, יש לדלל 04 מיקרוגרם של וקטור ביטוי תחום עשיר בגליצין, ו-0.2 מיקרוגרם של פלסמיד מדווח השחבור המודולרי ב-50 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בצינור סטרילי. לאחר מכן יש לדלל 0.4 מיקרוגרם של וקטור ביטוי תחום אפקטור RS, ו-0.2 מיקרוגרם של פלסמיד מדווח PGZ-three ב-50 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת. לבסוף, יש לדלל 0.4 מיקרוגרם של וקטור ביטוי PGL-RS-PUF ו-0.2 מיקרוגרם של פלסמידים מדווחים PEZ-1B או PEZ-2F ב-50 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בצינור סטרילי.

לאחר חמש דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, מערבבים בעדינות את מגיב הטרנספקציה הליפוזומלי המדולל עם תערובות הפלסמיד המדוללות. דוגרים את התערובות הסופיות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסיפו את תערובות הטרנספקציה המכילות את וקטורי הביטוי לכל באר של צלחת בת 24 בארות עם תאי HEK-293, ודגרו לפחות 12 שעות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר 12 שעות דגירה, קצרו את התאים שעברו טרנספטציה על ידי טריפסיניזציה וצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את המדיום והוסיפו 0.5 מיליליטר של מאגר מיצוי RNA לכל צינור. הוסף 0.1 מיליליטר כלורופורם לכל 0.5 מיליליטר של מאגר מיצוי RNA לכל דגימה.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינורות למשך 15 דקות בטמפרטורה של 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את הבסיס המימי לצינור טרי. הוסף 0.25 מיליליטר איזופרופנול לכל 0.5 מיליליטר של מאגר מיצוי RNA המשמש בהומוגניזציה הראשונית.

מערבבים על ידי מערבולת, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה כמו קודם, משקעי ה- RNA נראים בדרך כלל בתחתית הצינור. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את כדור ה-RNA עם 0.5 מיליליטר של 75% אתנול לכל 0.5 מיליליטר של מאגר מיצוי RNA.

מערבולת נמרצת, ואז צנטריפוגה ב-7, 500 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט וייבש באוויר את כדורי ה-RNA. ממיסים את ה-RNA ב-50 מיקרוליטר מים נטולי RNase.

לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של חמש יחידות למיקרוליטר DNase-one, שבעה מיקרוליטרים של מאגר 10X ו-11 מיקרוליטר מים לכל תמיסת RNA של 50 מיקרוליטר. לאחר הדגירה, מחממים את התמיסות ל -70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להשבית את ה- DNase. לאחר ביצוע תגובת טרנסקריפטאז הפוכה לסינתזה של cDNA מכל דגימה, הוסף את מרכיבי הגוף המסומנים בתגובת PCR בסדר המוצג על המסך לצינורות PCR.

הכן תגובה אחת לכל דגימה. הפעל את תוכנית RT-PCR על המחזור התרמי. לבסוף, פתרו את מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד 10% עם מאגר TBE.

השתמש בסורק פלואורסצנטי כדי לדמיין את המוצרים, ומדוד את הכמות של כל איזופורם שחבור באמצעות תוכנת דנסיטומטריה. לבדיקת האימונופלואורסצנציה למדידת אפופטוזיס, הכינו תערובת טרנספקציה המכילה פלסמידים לביטוי תחום עשיר בגליצין כפי שהוצג קודם לכן, ותאי HeLa הגדלים על כיסוי זכוכית מצופה פוליליזין מחליקות בצלחת של שש בארות. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, תקן את התאים על החלקות הכיסוי עם מיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד ב-1x PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן שטפו בעדינות את התאים על החלקות הכיסוי עם שני מיליליטר של 1x PBS למשך חמש דקות. לאחר מכן, חדור התאים עם 0.2%Triton X-100 ב-1x PBS למשך 10 דקות. לאחר שטיפה שלוש פעמים עם PBS 1x כמו קודם, חסום קשירה לא ספציפית עם אלבומין סרום בקר 3% ב-PBS 1x למשך 10 דקות.

לדלל את נוגדן הדגל מ-1 ל-1,000 ב-3% BSA ב-PBS, ופיפטה 30 מיקרוליטר של נוגדן הדגל המדולל על יריעת פרפילם. השתמש במלקחיים כדי להסיר החלקת כיסוי. יבש בזהירות את עודפי המאגר עם מגבוני מעבדה, ולאחר מכן הנח את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מטה על התמיסה נגד הדגל.

דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הוסף כ-500 מיקרוליטר של 1x PBS לצד התא של החלקת הכיסוי עד שהוא צף על גבי התמיסה. החזר אותו לצלחת שש הבארות עם 1x PBS בבארות.

דגירה עם נוגדן משני על פרפילם כמו קודם למשך 15 דקות. שטפו כמו קודם, ולאחר מכן הרכיבו את החלקות הכיסוי על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות מדיום הרכבה המכיל DAPI. דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וצלמו אותם באמצעות מצלמה דיגיטלית.

באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, תאים רבים המבטאים Gly-PUF-531 היו בעלי DNA גרעיני מקוטע, מה שמצביע על כך שהם עוברים אפופטוזיס. כביקורת, לתאים המבטאים Gly-PUF מסוג פרא היה פחות DNA גרעיני מקוטע בהשוואה לתאים שעברו טרנספטציה של Gly-PUF-531. כאן, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית המשתמשת בנוגדנים נגד דגל שהתמזגו עם תאים מוכתמים ב-DAPI מראה כי ה-Gly-PUF-531 התמקם בעיקר בגרעינים של תאים שעברו טרנספטציה.

Gly-PUF מסוג פרא ממוקם גם בגרעינים של תאים שעברו טרנספטציה, מה שמרמז על כך ש-ESFs אלה מתנתקים מהמטרות שלהם כאשר ה-mRNA המחוברים במלואם מועברים לציטופלזמה. אחוז התאים האפופטוטיים עם DNA גרעיני מקוטע נמדד משדות שנבחרו באקראי של תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר השליטה, בניית פיגומי PUF עם ספציפיות קשירת RNA יכולה להיעשות תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתפעל באופן ספציפי שחבור חלופי בתאים אנושיים על ידי הנדסת גורמים מלאכותיים.