באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא ללכוד אינטראקציות חלבון-חלבון שומנים-פרוקסימליים במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום הדינמיקה המיטוכונדריאלית, כגון כיצד אינטראקציות חלבון-חלבון בקרום החיצוני המיטוכונדריאלי יכולות להיות מושפעות משומנים נלווים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שקשירת תחומי חלבון מסיסים לתבניות שומנים מבטיחה שניתן להשיג אישור מקורי יותר.

יתר על כן, ניתן להעריך אינטראקציות מורכבות בין חלבונים מסיסים לשותפיהם הקשורים בנוכחות קופקטורים מוגדרים של שומנים למרות שאנו משתמשים בשיטה זו כדי לחקור אינטראקציות חלבון במנגנון הביקוע המיטוכונדריאלי, ניתן ליישם אותה גם על קומפלקסים חלבונים אחרים המתמקמים בתאי ממברנה מגוונים. מי שידגים את ההליך הזה יהיה ריאן, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

ראשית, שלבו תמיסות כלורופורם של השומנים הרצויים במבחנה מזכוכית נקייה. אידוי הממס בגז חנקן יבש תוך סיבוב הצינור ליצירת סרט שומנים דק. לאחר מכן הסר את הממס השיורי עם המאייד הצנטריפוגלי למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הוסף מאגר A שחומם מראש כדי לתת ריכוז שומנים סופי של מילימול עד שניים. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם מערבולת מדי פעם כדי להשהות מחדש את תערובת השומנים במלואה. לאחר הדגירה, העבירו את תערובת השומנים למבחנה מפלסטיק והניחו את השפופרת בחנקן נוזלי למשך כ-30 שניות עד להקפאה מלאה.

לאחר מכן הניחו את השפופרת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתי דקות עד להפשרה מלאה. לאחר מכן, הכינו מכבש שומנים על ידי השריית ארבעה תומכי פילטר ומסנן פוליקרבונט במאגר A והרכבת המכבש בהתאם להוראות היצרן. הוצא את תמיסת השומנים דרך המסנן 21 פעמים באמצעות לחץ קבוע עדין כדי להבטיח חלוקת גודל הומוגנית.

בזמן האקסטרום, השתמש בלחץ קבוע איטי כדי להבטיח הומוגניות בגודל הליפוזום. עם פילטר מיקרון אחד, זה פחות חשוב. אבל עם גדלי מסננים קטנים יותר, יכול להציג הטרוגניות נראית לעין יותר.

אחסן את הליפוזומים המוחצנים בארבע מעלות צלזיוס. דגירה של גורם ביקוע מיטוכונדריאלי או Mff עם ליפוזומי פיגום למשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר במאגר A ו-BME. לבקרה נטולת Mff, דגרו על הליפוזומים עם חלבון בקרה מתויג His, כגון GFP, כדי לקשור ולהגן על ניקל-NTA חשוף.

הוסיפו לתערובת הליפוזום חלבון אחד או Drp1 הקשור לדינמין ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו חמישה מיקרוליטר מהדגימה ליריעת סרט מעבדה והניחו רשת נחושת-רודיום מצופה פחמן על גבי הדגימה. לאחר דגירה של דקה, הסר את עודפי הנוזלים בעזרת נייר סינון והוסף טיפה של 2% אורניל אצטט.

לאחר הדגירה של דקה נוספת, הסר את הכתם העודף עם נייר פילטר, והעביר את הדגימה לקופסת רשת. למחרת, דמו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בהגדלה של פי 18, 500 עד 30,000X כדי לצפות בשינויים אולטרה-מבניים במורפולוגיה של חלבונים וליפוזומים. דגירה של Mff ו-Fis1 עם הפיגומים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר במאגר A ו-BME.

מוסיפים Drp1 ודוגרים על כל תערובת למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. העבירו את הצינורות לסט התרמו-ציקלר ל-37 מעלות צלזיוס והתחילו את התגובות על ידי הוספת GTP ומגנזיום כלוריד. בנקודות הזמן הרצויות, העבירו 20 מיקרוליטר מכל תערובת תגובה לבארות של צלחת מיקרוטיטר המכילה חמישה מיקרוליטרים של 0.5 EDTA מולארי כדי לקלוט את המגנזיום ולעצור את התגובה.

לאחר מכן, הכינו סט של תקני פוספט על ידי דילול אשלגן פוספט במאגר A ו-BME כדי לכייל את התוצאות. הוסף 20 מיקרוליטר מכל תקן לבארות המכילות חמישה מיקרוליטר של 0.5 מולארי EDTA. הוסף 150 מיקרוליטר מגיב ירוק מלכיט לכל באר.

לבסוף, קרא את OD 650 חמש דקות לאחר כל הוספה. GTP יעבור הידרוליזה איטית בנוכחות המגיב הירוק מלכיט החומצי. לכן יש להוסיף מגיב זה לכל בארות הדגימה תוך 10 דקות ממדידת הספיגה כדי למקסם את האות לרעש.

בהיעדר Drp1, לא Mff ולא GFP גרמו לעיוות הממברנה. ורק ליפוזומים חסרי תכונות נצפו עבור ליפוזומים מועשרים בפיגומים מעוטרים ב-GFP או ESL. עם זאת, כאשר Drp1 נוסף לתבניות ESL מעוטרות ב-Mff, היה ברור שיפוץ של הליפוזומים.

קישוט ה-SL עם Mff שיפר את פעילות GTPase. לעומת זאת, כאשר קבוצות הראש של NTA שנחשפו נחסמו עם GFP מתויג His, פעילות GTPase מוגברת זו בוטלה. קשירה של Fis1 חסר התחום הטרנסממברני שלו ל-SL, גם לא הצליחה לעורר גירוי של פעילות ה-GTPase של Drp1.

בדומה ל-SL, תוספת של SL/Cl ל-Drp1 הביאה לגירוי קל של פעילות GTPase שהתהפך על ידי קשירת His-tagged Fis1 או GFP לליפוזומים. נצפתה סינרגיה בין Mff לקרדיוליפין כאשר פעילות ה-GTPase של Drp1 עוררה פי 2.6 כאשר הוא הודגר עם SL/CL מעוטר ב-Mff. כאשר תבניות SL/PE/CL עוטרו ב-Mff, פעילות Drp1 השתפרה.

היכולת של Drp1 לעצב מחדש ליפוזומים לצינורות שומנים שופרה על ידי הוספת PE לליפוזומי הפיגום. לאחר השליטה, ניתן להכין פיגומים אלה ולהשתמש בהם תוך שעות אם ההליך מבוצע כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אינטראקציה אחרות של חלבונים ושומנים כמו מבחני שקיעה ופיזור אור על מנת לאפיין אינטראקציות פונקציונליות.

היישום של טכניקה זו מאפשר לאנשים הבוחנים טרנסלוקציה של חלבון לממברנה ביולוגית מוגדרת לחקור אינטראקציות חלבון חולפות ואת ההשפעה של קופקטורים ספציפיים של שומנים על היווצרות וייצוב של מכלולים תאיים חיוניים.