Name: באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: חקור אינטראקציות חלבון-חלבון בסמיכות ליפידים במערכת מיטוכונדרית באמצעות שיטת הפיגום הליפוזומלי. טכניקה זו מאפשרת לחקור השפעת ליפידים על דינמיקת מיטוכונדריה ומכשירי פיצול תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למימון שהתקבל מאיגוד הלב האמריקאי (SDG12SDG9130039).

1. הכנת Liposome פיגום הערה: באופן אידיאלי, ניסויים ראשוניים צריכות להשתמש פיגום פשוט חסר ייחוד יחסית (מורכב dOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine או PC) DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) (1,2-dioleoyl - SN -glycero-3 - [(N - (5-אמינו-1-carboxypentyl) חומצת iminodiacetic) succinyl]. (מלח ניקל)) בניין הנחה של ניסויים אלה, פריצת שומנים, גמישות, ועקמומיות ניתן הציג כגורמים בודדים עם הפוטנציאל לשנות אינטראקציות קרום הפרוקסימלי. ניתן להשיג שינויים אלה על ידי הוספת כמויות מוגדרות של מרכיבי שומנים ספציפיים, כולל phosphatidylserine או cardiolipin (CL), phosphatidylethanolamine (סמים או PE), או galactosyl ceramide (β). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבי שומנים מומסים כלורופורם במבחנת זכוכית נקיה. להתאדות ממס עם גז חנקן יבש תוך כדי סיבוב הצינור כדי ליצור סרט שומנים דק. הסר ממס שיורים עם centrifugaמאייד l עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: ניסוחים liposome שונים משמשים הפרוטוקולים המתואר להלן: ליפוזומים פיגום (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) / 96.7 mol% dOPC), ליפוזומים פיגום עם cardiolipin (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipin / 86.7 mol% dOPC), ליפוזומים פיגום גמישה עם cardiolipin (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) / 10 mol% cardiolipin / 35 DOPE mol% / 51.7 mol% dOPC), ו הפיגום מועשר ליפוזומים (10 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) / 15 mol% cardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 mol% dOPC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף הצפת (25 HEPES מ&quot;מ (4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic), 150 מ&quot;מ KCl, pH מותאם 7.5 עם KOH) שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס כך ריכוז השומנים הסופי הוא 1 - 2 מ&quot;מ. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם vortexing מזדמנים resuspend את תערובת שומנים לחלוטין (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים צינור מבחן פלסטיק, במקום צינור בחנקן נוזלי עד קפוא לחלוטין (roughly 30 s), ומניחים באמבט מים C ° 37 עד מופשר לחלוטין (בערך 1 - 2 דקות). חזור עבור סכום כולל של 4 מחזורים להקפיא להפשיר (איור 1b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין מכבש שומנים על ידי השריית 4 תומך מסנן ומסנן פוליקרבונט במאגר והרכבת המכבש לפי הוראות יצרן. Extrude פתרון השומנים דרך המסנן 21 פעמים. עדין, לחץ מתמיד על מנת להבטיח חלוקת גודל הומוגנית (איור 1 ג &#39;). הערה: עבור כל הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה, 1.0 מיקרומטר פוליקרבונט הסינון שימש שחול. האינטראקציה Drp1 עם שומנים anionic ניתן לצפות עם מגוון רחב של קטרים liposome הנעים בין 50 ננומטר עד 400 ננומטר 12 ומעלה 13. לפיכך, גודל המסנן של 1 מיקרומטר נבחר להיות אידיאלי הוא פעילות GTPase ועבור במיקרוסקופ אלקטרונים. אם קטרי liposome אחרים הם רצויים, הכנת שלפוחית unilamellar הענקית 14,15 (GUVs) או unilamell הקטןar שלפוחית 16 (רכבי שטח) ניתן להשתמש. ניתן להשתמש פיזור אור דינאמי להעריך ההטרוגניות גודל liposome 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן ליפוזומים הנמתח על 4 מעלות צלזיוס וזורקים לאחר 3 - ד 5. </li></ol> 2. שימוש הפיגום ליפוזומים עבור ניתוח חלבון מחייב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה MffΔTM שלו מתויג (5 מיקרומטר הסופי) עם ליפוזומים פיגום (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +); 50 מיקרומטר הסופי) לפחות 15 דקות ב RT הצפת + BME (25 HEPES מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ β-mercaptoethanol (BME), pH מותאם 7.5 עם KOH). עבור פקד MFF ללא, דגירה ליפוזומים עם חלבון לשליטתו מתויג (כגון GFP) להיקשר ומגן החשוף נ.ת.ע (Ni 2 +). הערה: MffΔTM התבטא וטיהר כמתואר במחקר קודם 2. GFP היה מטוהר באופן דומה, אך צעד חילוף יונים הושמט. BME נדרשה experimen אלהts כי Drp1 רגיש חמצון, אשר יכול לשנות תכונות הפעילות והרכבה שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Drp1 (2 מיקרומטר הסופי) ו דגירה של 1 ש &#39;ב RT. הערה: Drp1 התבטא וטיהר כמתואר במחקר קודם 2. לאחר הדגרה עם Drp1, השפעת נוקלאוטיד מחייב על עיוות הממברנה יכול להיחקר על ידי דוגרים שעה נוספת אחת עם 2 מ&quot;מ MgCl 2 ואו 1 מ&quot;מ GTP, 1 מ&quot;מ GMP-PCP, או הצפת + BME. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הילוכים הכתמים שליליים מיקרוסקופי אלקטרונים (EM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 μL של המדגם כדי סדין של סרט במעבדה, ויניח רשת Rh Cu / מצופה פחמן על המדגם. דגירת דקות רשת 1 על המדגם, למחוק משם נוזל עודף על נייר סינון, ולהעביר לירידה של אצטט uranyl 2%. דגירת 1 דקות, כתם כתם עודף על נייר סינון, ומעביר תיבת רשת. חנות תחת ואקום O / N כדי להבטיח התייבשות מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תמונה באמצעות microsc אלקטרוני הילוכיםאופ ב 18,500 - 30,000X הגדלה לצפות לשינויי ultrastructural ב מורפולוגיה חלבון liposome 17. הערה: שינויי ultrastructural ניתן לכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, כגון 13 ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). קישוט החלבון ניתן למדוד בהשוואת תבניות שומנים עירום. בנוסף, בקטרים של מגזרים צינורי ניתן למדוד מהחלק החיצוני של המכלולים 13. ניתוח מפורט יותר ניתן לבצע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני cryo- 17. שיטה זו יכולה לשמש כדי תמונה מקורית מכלולים חלבון-שומנים ממס ללא שימוש כתמים מתכת כבדה אשר מעיל המדגם. בדרך זו, תכונות מבניות מפורטות לא ניכרו כתם שלילי, לרבות שינויים במורפולוגיה השומנים הבסיסיות, ניתן לבדוק לכמת. </li></ol></li></ol> 3. השימוש של הפיגום ליפוזומים עבור אנזימתי Assay הערה: Coloriassay GTPase מטרי 18 שימש למדידת שחרור פוספט באמצעות הידרוליזה GTP. מבחני GTPase חלופיים זמינים 19 והוא יכול להיות מיושם על פי הצורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת MffΔTM המתויג שלו (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), או GFP (5 מיקרומטר סופי עבור כל) עם ליפוזומים פיגום (150 מיקרומטר סופיים) במשך 15 דקות ב RT הצפה + BME (נפח = 30 μL). להוסיף Drp1 (500 סופי ננומטר) דגירת דקות נוספות 15 ב RT (נפח = 80 μL). הערה: Fis1 היה מטוהר באופן דומה MFF 2, אבל הצעד כרומטוגרפיה-חילוף יונים הושמט. מטרת GFP המתויג שלו היא להגן על נ.ת.ע (Ni 2 +) headgroups ולמנוע אינטראקציות תשלום ספציפיות עם חלבונים אחרים. אם אין כל השפעה נצפית בהעדר GFP, אז פקד זה לא ייתכן שיידרש. חלבוני חסימה אלטרנטיביים (גודל דומה לחלבון של עניין) יכולים לשמש גם, אבל GFP מאפשר הדמיה ישירה של אינטראקציות עם scafלקפל ליפוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צינורות אל thermocycler מוגדר 37 ° C, ליזום תגובות על ידי תוספת של GTP ו MgCl 2 (1 מ&quot;מ ו -2 הסופי מ&quot;מ, בהתאמה; נפח = 120 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודות הזמן הרצוי (כלומר T = 5, 10, 20, 40, 60 דק &#39;), להעביר 20 μL של תגובה הבארות של צלחת microtiter המכיל 5 μL של 0.5 M EDTA כדי Chelate Mg 2+ ולעצור את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין סט של סטנדרטים פוספט על ידי דילול KH 2 PO 4 ב הצפה + BME לכייל תוצאות. קבוצה יעילה של סטנדרטים היא 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, ו -0 מיקרומטר. הוסף 20 μL של כל בארות המכילות 5 μL של 0.5 M EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 150 μL של מלכיט מגיב ירוק (1 מ&quot;מ קרבינול ירוק מלכיט, 10 מ&quot;מ אמוניום molybdate tetrahydrate ו -1 N HCl) זה טוב, ולקרוא OD 650 5 דקות לאחר תוספת. הערה: GTP הוא חומצה יציבה, ויהיה hydrolyze בנוכחות מגיבה ירוק מלכיט. ודא tהוא הזמן בין הוספת מגיב מלכיט והקריאה הוא קבוע על מנת להבטיח תוצאות לשחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומת סטנדרט ידי התוויית OD 650 של סטנדרטים כפונקציה של ריכוז פוספט. השתמש רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את הקשר בין OD 650 ו ריכוז פוספט במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רגרסיה ליניארית, להמיר את OD 650 של דגימות תגובת חלבון פוספט מיקרומטר. לקבוע את שיעור דור פוספט עבור כל תערובת תגובה על ידי התוויית ריכוז פוספט כפונקציה של זמן, ולהמיר k חתול על ידי חלוקת הריבית על ידי ריכוז Drp1 (0.5 מיקרומטר). הערה: רק השיעור ליניארי הראשוני אמורה לשמש כדי לקבוע את שיעור דור פוספט, ומינימום של 3 נקודות נתונים חייב לשמש. אם קצב התגובה הוא מהיר מספיק ששלושת נקודות הנתונים הראשונות הם לא ליניארי (כלומר r 2 של ההתאמה ליניארית הוא פחות מ 0.9) סימןificantly קצר כמובן זמן עם נקודות זמן לפחות 3 צריך להתבצע. </li></ol>

<ol><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+Protein+1+Oligomerization+in+Solution+Impairs+Functional+Interactions+with+Membrane-anchored+Mitochondrial+Fission+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor.</a> J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).</li>
<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Fusion+and+Fission+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals.</a> Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).</li>
<li>Bui, H. T., Shaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+Assembly+Strategies+and+Adaptor+Proteins+in+Mitochondrial+Fission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission.</a> Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).</li>
<li>Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+into+the+understanding+of+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances into the understanding of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).</li>
<li>Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fis1%2C+Mff%2C+MiD49%2C+and+MiD51+mediate+Drp1+recruitment+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission.</a> Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).</li>
<li>Otera, H., Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mff+is+an+essential+factor+for+mitochondrial+recruitment+of+Drp1+during+mitochondrial+fission+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).</li>
<li>Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Novel+Tail-anchored+Membrane+Protein+Mff+Controls+Mitochondrial+and+Peroxisomal+Fission+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).</li>
<li>Koirala, S., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchangeable+adaptors+regulate+mitochondrial+dynamin+assembly+for+membrane+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).</li>
<li>Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimeric+equilibrium+intermediate+nucleates+Drp1+reassembly+on+mitochondrial+membranes+for+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission.</a> Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).</li>
<li>Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Splice+Variants+of+Dynamin-related+Protein+1+Differentially+Utilize+Mitochondrial+Fission+Factor+as+an+Effector+of+Cooperative+GTPase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity.</a> J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).</li>
<li>Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Interaction+with+Cardiolipin+Triggers+Functional+Activation+of+Dynamin-Related+Protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li>
<li>Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanoenzymatic+Core+of+Dynamin-Related+Protein+1+Comprises+the+Minimal+Machinery+Required+for+Membrane+Constriction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of giant unilamellar vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li>
<li>Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use+small+unilamellar+phospholipid+vesicles+by+ultrasonication+with+a+beaker+resonator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator.</a> Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).</li>
<li>Mears, J. A., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+Visualization+of+Dynamins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 Visualization of Dynamins.</a> Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).</li>
<li>Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Colorimetric+Assays+for+Dynamin%27s+Basal+and+Stimulated+GTPase+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities.</a> Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).</li>
<li>Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnm1+forms+spirals+that+are+structurally+tailored+to+fit+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria.</a> J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).</li>
<li>Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+oligomerization+and+mitochondrial+remodelling+of+dynamin+1-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein.</a> EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).</li>
<li>James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hFis1%2C+a+Novel+Component+of+the+Mammalian+Mitochondrial+Fission+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery.</a> J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).</li>
<li>Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Protein+hFis1+Regulates+Mitochondrial+Fission+in+Mammalian+Cells+through+an+Interaction+with+the+Dynamin-Like+Protein+DLP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).</li>
<li>Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+and+independent+roles+of+Drp1+adaptors+Mff+and+MiD49%2F51+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission.</a> J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).</li>
<li>Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Directed+Self-Assembly+Enhances+RTK+Catalytic+Domain+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function.</a> J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).</li>
<li>Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+Assembly+of+Signaling+Proteins%3A+A+Novel+Drug+Screening+and+Research+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool.</a> Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).</li>
<li>Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+membrane-bound+murine+MHC+class+I+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).</li>
<li>Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+helix+dimerization%3A+Beyond+the+search+for+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).</li>
<li>Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+of+membrane-spanning+and+glycosylphosphatidylinositol-+linked+proteins%3A+toward+establishing+rules+governing+the+lateral+mobility+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins.</a> J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).</li>
<li>Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion of membrane proteins.</a> J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).</li>
<li>Gambin, Y., Reffay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+the+lateral+mobility+of+transmembrane+peptides+with+hydrophobic+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch.</a> J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).</li>
<li>Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanotubes+as+substrates+for+helical+crystallization+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקירת אינטראקציות בין חלבונים מעורבים חלבונים בממברנה נפרד. על ידי ניצול פיגום ליפוזום מודולרי, חוקרים מסוגלים להעריך את הפעילות של חלבונים אחד או יותר בסביבת שומנים הפרוקסימלי. מחקרים קודמים הוכיחו בשיטה דומה עבור אנזימי קולטן של קרום הפלזמה 24 - 26. הרחבנו בשיטה זו כדי לשלב קו-פקטורי שומנים ולחקור אינטראקציות בין חלבונים שמרכיבים את ליבת mechanoenzymatic של מכונות ביקוע המיטוכונדריה. <p class="jove_content" style=";text...

לימוד אינטראקציות קרום הפרוקסימלי חלבונים הוא מאמץ מאתגר בשל קושי משחזר את הסביבה הטבעית של חלבונים בממברנה נפרדים המעורבים 1. זאת בשל הצורך של solubilization דטרגנט ואת הכיוון הלא סדירה של חלבונים proteoliposomes. על מנת למנוע בעיות אלה, יש לנו עובדים אסטרטגיה לפיה תחומים מסיסים של חלבונים בממברנה נפרדים מבוטאות חלבוני היתוך התג שלו, ושברי מסיסים אלה מעוגנים ליפוזומים פיגום באמצעות אינטראקציות עם נת&quot;ע (Ni 2 +) headgroups על השומנים משטח. באמצעות פיגומים אלה, אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי שומנים יכולות להיחקר על פני טווח של קומפוזיציות שומנים וחלבונים. יש לנו ליישם ביעילות בשיטה זו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבונים הקריטיים השולטים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה ולבחון אינטראקציות שומנים לווסת pr זהocess 2. במהלך ביקוע המיטוכונדריה, חלבון שיפוץ קרום משומר, שנקרא הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) 3, מגויסת אל פני השטח של הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי (OMM) בתגובה לאותות הסלולר המווסתים הומאוסטזיס אנרגיה, איתות אפופטוטיים, וכמה אחרים תהליכי המיטוכונדריה נפרדים. GTPase גדול, cytosolic זה גייס אל פני השטח של המיטוכונדריה דרך אינטראקציות עם חלבונים OMM אינטגרלי 4 - 8. תפקידו של חלבון אחד כזה, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), כבר קשה להבהיר עקב אינטראקציה חלשה לכאורה עם Drp1 במבחנה. אף על פי כן, מחקרים גנטיים הראו בבירור כי MFF חיונית 7,8 ביקוע המיטוכונדריה מוצלח. השיטה המתוארת בכתב היד הזה הייתה מסוגלת להתגבר על חסרונות קודמים על ידי החדרת אינטראקציות שומנים סימולטני המקדמות אינטראקציות Drp1-MFF. בסך הכל, revea assay הרומן הזההובל כוחות יסוד המנחים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה וספק שלב חדש ללימודי מבניים ותפקודיים מתמשכים של מכונה מולקולרית חיונית זה. נכון להיום, בחינת יחסי הגומלין בין Drp1 ו MFF כבר מסובך בגלל הגמישות המובנית של MFF 9, ההטרוגניות של Drp1 פולימרים 2,10, והקושי מטהרים reconstituting באורך מלא MFF עם תחום הטרנסממברני שלם 11. טיפלנו אתגרים אלה באמצעות נ.ת.ע (Ni 2 +) ליפוזומים פיגום כדי לשקם MFF מתויג שלו חסר תחום הטרנסממברני שלה (MffΔTM-שלו 6). אסטרטגיה זו הייתה יתרון משום MffΔTM היה מסיס מאוד כאשר ביטוי יתר ב E. coli, וחלבון מבודד זה היה מחדש בקלות על ליפוזומים הפיגום. כאשר קשור לתבניות השומנים האלה, MFF להניח אוריינטציה זהה, פונים כלפי חוץ על פני הממברנה.בנוסף יתרונות אלה, שומנים המיטוכונדריה, כגון cardiolipin, נוספו לייצב מתקפלים וההתאגדות MFF עם קרום 11. Cardiolipin גם אינטראקציה עם התחום המשתנה של Drp1 2,12 אשר עשוי לייצב באזור המופרע הזה ולהקל הרכבה של מכונות הביקוע. שיטה חזקה זו ישימה נרחב למחקרים עתידיים המבקשים להעריך אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי הממברנה. באמצעות שימוש אינטראקציות קשירה / זיקה נוספות, התחכום של מחקרי כינון מחדש קרום אלה ניתן לשפר כדי לחקות מורכבות נוספת נמצאת על פני השטח של ממברנות בתוך תאים. במקביל, קומפוזיציות שומנים ניתן לשנות באופן מדויק יותר לחקות את סביבות יליד מתחמי macromolecular אלה. לסיכום, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת התרומה היחסית של חלבונים ושומנים בעיצוב מורפולוגיות הממברנה במהלך proc הסלולר הקריטיesses.

<table><tbody><tr><td>פוספטידילכולין (DOPC)</td><td>אוונטי ליפידים קוטביים</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>פוספטידיל-אתנולמין (DOPE)</td><td>אוונטי ליפידים קוטביים</td><td></td> 850725-DGS-NTA<td></td></tr><tr><td>(Ni2+)</td><td>אוונטי ליפידים קוטביים</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>קרדיוליפין לב בקר (CL)</td><td>אוונטי ליפידים קוטביים</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>אקרוס אורגני</td><td></td><td></td>268320010</tr><tr><td>מכבש ליפוזום</td><td>אוונטי קוטב ליפידים</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh רשתות כתמים שליליות</td><td>טד פלה</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרופוגה</td><td>בקמן</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>רצועות</td> <td>צלחת מיקרוטיטרThermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie Dye</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>אקרוס אורגניקס</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE ג'ל</td><td>ביו ראד</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli טעינת צבע</td><td>ביו ראד</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>מלכיט ירוק קרבינול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום מוליבדט Tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>סרט מעבדה</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV מיקרוסקופ</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 רוטור</td><td>בקמן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריVap מקורר רכז</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax קורא Microplate</td><td>מכשירים</td><td></td><td></td> מולקולריים</tr></tbody></table>

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

מחקרים של חלבונים בממברנה נפרדים במבחנה מסובך לעתים קרובות על ידי הנוכחות של תחום הטרנסממברני הידרופובי. שמסבך עוד יותר את המחקרים הללו, reincorporation של חלבונים בממברנה דטרגנט-solubilized לתוך ליפוזומים הוא תהליך סטוכסטיים שבו טופולוגיה חלבון אי אפשר לאכוף. מאמר זה מציע שיטה חלופית לטכניקות מאתגרות אלו אשר מנצלות פיגום מבוסס liposome. מסיסות חלבון מוגברת על ידי מחיקה של תחום הטרנסממברני, וחומצות אמינו אלה מוחלפים עם מחצית קשירה, כגון תג שלו. לקשור זה אינטראקציה עם קבוצת עיגון (Ni 2 + מתואם על ידי חומצה nitrilotriacetic (נ.ת.ע (Ni 2 +)) עבור חלבונים שלו מתוייגים), אשר כופה טופולוגיה חלבון אחידה על פני השטח של liposome. דוגמה מוצגת שבה האינטראקציה בין הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) עם חלבון ממברנלי אינטגרלי, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), היה investigated בשיטה ליפוזום פיגום זה. בעבודה זו, אנו הדגמנו את היכולת של MFF לגייס מסיסי Drp1 ביעילות אל פני השטח של ליפוזומים, אשר עורר פעילות GTPase שלה. יתר על כן, Drp1 הצליח tubulate תבנית השומנים המעוטר MFF בנוכחות שומנים ספציפיים. דוגמא זו ממחישה את האפקטיביות של ליפוזומים פיגום באמצעות מבחנים מבניים ותפקודיים ומדגישה את תפקיד MFF בהסדרת פעילות Drp1.

בעוד האינטראקציה בין Drp1 ו MFF הודגמה להיות חשוב לביקוע המיטוכונדריה, אינטראקציה זו כבר קשה לשחזר במבחנה. מטרתנו הייתה לחקות את הסביבה התאית טוב יותר שבו Drp1 ו MFF אינטראקציה. לשם כך, ליפוזומים המכילים ריכוזים הגבלת נת"ע (Ni 2 +) headgroups הוכנו על ידי rehydrating סרט השומנים כמתואר לעיל. פתרון השומנים בתחילה מורכב שלפוחית unilamellar ו multilamellar בקטרים הטרוגנית כפי שמעיד האטים (איור 1 א) הפתרון. אטימות ז...

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא ללכוד אינטראקציות חלבון-חלבון שומנים-פרוקסימליים במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום הדינמיקה המיטוכונדריאלית, כגון כיצד אינטראקציות חלבון-חלבון בקרום החיצוני המיטוכונדריאלי יכולות להיות מושפעות משומנים נלווים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שקשירת תחומי חלבון מסיסים לתבניות שומנים מבטיחה שניתן להשיג אישור מקורי יותר.יתר על כן, ניתן להעריך אינטראקציות מורכבות בין חלבונים מסיסים לשותפיהם הקשורים בנוכחות קופקטורים מוגדרים של שומנים למרות שאנו משתמשים בשיטה זו כדי לחקור אינטראקציות חלבון במנגנון הביקוע המיטוכונדריאלי, ניתן ליישם אותה גם על קומפלקסים חלבונים אחרים המתמקמים בתאי ממברנה מגוונים. מי שידגים את ההליך הזה יהיה ריאן, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.ראשית, שלבו תמיסות כלורופורם של השומנים הרצויים במבחנה מזכוכית נקייה. אידוי הממס בגז חנקן יבש תוך סיבוב הצינור ליצירת סרט שומנים דק. לאחר מכן הסר את הממס השיורי עם המאייד הצנטריפוגלי למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הוסף מאגר A שחומם מראש כדי לתת ריכוז שומנים סופי של מילימול עד שניים. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם מערבולת מדי פעם כדי להשהות מחדש את תערובת השומנים במלואה. לאחר הדגירה, העבירו את תערובת השומנים למבחנה מפלסטיק והניחו את השפופרת בחנקן נוזלי למשך כ-30 שניות עד להקפאה מלאה.לאחר מכן הניחו את השפופרת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתי דקות עד להפשרה מלאה. לאחר מכן, הכינו מכבש שומנים על ידי השריית ארבעה תומכי פילטר ומסנן פוליקרבונט במאגר A והרכבת המכבש בהתאם להוראות היצרן. הוצא את תמיסת השומנים דרך המסנן 21 פעמים באמצעות לחץ קבוע עדין כדי להבטיח חלוקת גודל הומוגנית.בזמן האקסטרום, השתמש בלחץ קבוע איטי כדי להבטיח הומוגניות בגודל הליפוזום. עם פילטר מיקרון אחד, זה פחות חשוב. אבל עם גדלי מסננים קטנים יותר, יכול להציג הטרוגניות נראית לעין יותר.אחסן את הליפוזומים המוחצנים בארבע מעלות צלזיוס. דגירה של גורם ביקוע מיטוכונדריאלי או Mff עם ליפוזומי פיגום למשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר במאגר A ו-BME. לבקרה נטולת Mff, דגרו על הליפוזומים עם חלבון בקרה מתויג His, כגון GFP, כדי לקשור ולהגן על ניקל-NTA חשוף.הוסיפו לתערובת הליפוזום חלבון אחד או Drp1 הקשור לדינמין ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו חמישה מיקרוליטר מהדגימה ליריעת סרט מעבדה והניחו רשת נחושת-רודיום מצופה פחמן על גבי הדגימה. לאחר דגירה של דקה, הסר את עודפי הנוזלים בעזרת נייר סינון והוסף טיפה של 2% אורניל אצטט.לאחר הדגירה של דקה נוספת, הסר את הכתם העודף עם נייר פילטר, והעביר את הדגימה לקופסת רשת. למחרת, דמו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בהגדלה של פי 18, 500 עד 30,000X כדי לצפות בשינויים אולטרה-מבניים במורפולוגיה של חלבונים וליפוזומים. דגירה של Mff ו-Fis1 עם הפיגומים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר במאגר A ו-BME.מוסיפים Drp1 ודוגרים על כל תערובת למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. העבירו את הצינורות לסט התרמו-ציקלר ל-37 מעלות צלזיוס והתחילו את התגובות על ידי הוספת GTP ומגנזיום כלוריד. בנקודות הזמן הרצויות, העבירו 20 מיקרוליטר מכל תערובת תגובה לבארות של צלחת מיקרוטיטר המכילה חמישה מיקרוליטרים של 0.5 EDTA מולארי כדי לקלוט את המגנזיום ולעצור את התגובה.לאחר מכן, הכינו סט של תקני פוספט על ידי דילול אשלגן פוספט במאגר A ו-BME כדי לכייל את התוצאות. הוסף 20 מיקרוליטר מכל תקן לבארות המכילות חמישה מיקרוליטר של 0.5 מולארי EDTA. הוסף 150 מיקרוליטר מגיב ירוק מלכיט לכל באר.לבסוף, קרא את OD 650 חמש דקות לאחר כל הוספה. GTP יעבור הידרוליזה איטית בנוכחות המגיב הירוק מלכיט החומצי. לכן יש להוסיף מגיב זה לכל בארות הדגימה תוך 10 דקות ממדידת הספיגה כדי למקסם את האות לרעש.בהיעדר Drp1, לא Mff ולא GFP גרמו לעיוות הממברנה. ורק ליפוזומים חסרי תכונות נצפו עבור ליפוזומים מועשרים בפיגומים מעוטרים ב-GFP או ESL. עם זאת, כאשר Drp1 נוסף לתבניות ESL מעוטרות ב-Mff, היה ברור שיפוץ של הליפוזומים.קישוט ה-SL עם Mff שיפר את פעילות GTPase. לעומת זאת, כאשר קבוצות הראש של NTA שנחשפו נחסמו עם GFP מתויג His, פעילות GTPase מוגברת זו בוטלה. קשירה של Fis1 חסר התחום הטרנסממברני שלו ל-SL, גם לא הצליחה לעורר גירוי של פעילות ה-GTPase של Drp1.בדומה ל-SL, תוספת של SL/Cl ל-Drp1 הביאה לגירוי קל של פעילות GTPase שהתהפך על ידי קשירת His-tagged Fis1 או GFP לליפוזומים. נצפתה סינרגיה בין Mff לקרדיוליפין כאשר פעילות ה-GTPase של Drp1 עוררה פי 2.6 כאשר הוא הודגר עם SL/CL מעוטר ב-Mff. כאשר תבניות SL/PE/CL עוטרו ב-Mff, פעילות Drp1 השתפרה.היכולת של Drp1 לעצב מחדש ליפוזומים לצינורות שומנים שופרה על ידי הוספת PE לליפוזומי הפיגום. לאחר השליטה, ניתן להכין פיגומים אלה ולהשתמש בהם תוך שעות אם ההליך מבוצע כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אינטראקציה אחרות של חלבונים ושומנים כמו מבחני שקיעה ופיזור אור על מנת לאפיין אינטראקציות פונקציונליות.היישום של טכניקה זו מאפשר לאנשים הבוחנים טרנסלוקציה של חלבון לממברנה ביולוגית מוגדרת לחקור אינטראקציות חלבון חולפות ואת ההשפעה של קופקטורים ספציפיים של שומנים על היווצרות וייצוב של מכלולים תאיים חיוניים.

using-scaffold-liposomes-to-reconstitute-lipid-proximal-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית ​​השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות אירועי היתוך אחד, בתיווך מלכודת בין ליפוזומים bilayers נתמך ערוצי microfluidic באמצעות TIRFM המקוטב, עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec. ליפידים ושחרור מטען מסיס ניתן לאתר בו זמנית. Liposome גודל, diffusivity שומנים, ואת הנקבוביות היתוך מאפיינים נמדדים.

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים מרביים הכינון של קרום חלבונים לתוך fusogenic proteoliposomes, פיוז'ן של proteoliposomes כזה עם היעד bilayers השומנים למסירה ללא אבקת החלבונים האלה ממברנה לתוך bilayer postfusion. השילוב של גישות אלה מאפשר הרכבה מהירה וקלה לשליטה של מערכות ממברנה רב רכיבים מורכבים.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

אנו מספקים פרוטוקול עבור במבחנה מבחני ארגון עצמי של המוח, שלי ליפידית הנתמכות בחדר פתוח. בנוסף, אנו נתאר כיצד הקף וזמינותו של לבושת השומנים microcompartments PDMS לחקות ויוו תנאים על ידי תגובת כליאה.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

היתוך ממברנה ביולוגי מזרז על ידי חלבונים היתוך מיוחדים. מדידת תכונות fusogenic של חלבונים ניתן להשיג על ידי ערבוב שומנים בעלי. אנו מציגים שיטה לטיהור רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, חלבון המרפא הומוטיפקס של המיון, ממנה את המבנה ליפוזומים מראש ובדיקת קיבולת היתוך.

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

היתוך מיטוכונדריאלי הוא תגובה הוםוסטטית חשובה הבסיסית לדינמיקה המיטוכונדריאלית. מתואר כאן היא מערכת איסוף חוץ תוך כדי לימוד היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שיכול לפתור רצועה קרום, עגינה, המיתוך, ופתיחת נקבוביות. הרב-תכליתיות של גישה זו בחקר מערכות קרום התא נדון.

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ללא תאים לייצור פרוטאוליפוזום באיכות גבוהה בשיטת דו-שכבתית-דיאליזה באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה וליפוזומים. שיטה זו מספקת אמצעים מתאימים לניתוח פונקציונלי של חלבוני ממברנה, סינון מטרות תרופות ופיתוח נוגדנים.

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

מאמר זה מציג בנייה מחדש פשוטה של סיר אחד של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק מופרדות פאזה. ניתן להכליל את השיטה וליישם אותה על אנקפסולציה או כליאה של מגוון רחב של ביומולקולות.

במבחנה בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs)

חקור אינטראקציות חלבון-חלבון בסמיכות ליפידים במערכת מיטוכונדרית באמצעות שיטת הפיגום הליפוזומלי. טכניקה זו מאפשרת לחקור השפעת ליפידים על דינמיקת מיטוכונדריה ומכשירי פיצול תאיים.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

גלה סרטונים נוספים