Name: תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: חקור את כוחות ההידבקות בין חומצות אמינו ופפטידים לשטחים אי-אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית כוח מולקולה בודדת עם מיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של אינטראקציות מולקולריות לפיתוח חומרים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מארי קירי הבינלאומי להשתלבות מחדש (EP7). פ.ד. מודה על תמיכתה של המועצה הישראלית להשכלה גבוהה.

1. שינוי טיפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון ניטריד רכש (Si 3 N 4) cantilevers AFM עם טיפים סיליקון (רדיוס שלוחה הנומינלי של ~ 2 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו כל שלוחה AFM על ידי טבילה באתנול נטול מים במשך 20 דקות. יבש בטמפרטורת החדר. ואז לטפל cantilevers על ידי חשיפת אותם פלזמה O 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את הטיפים נקי מעל (3 ס&quot;מ) א methyltriethoxysilane תמיסה המכילה ו 3- (aminopropyl) triethoxysilane על יחס של 15: 1 (V / V) ייבוש תחת אווירה אינרטי (או חנקן או ארגון) ולחבר את ייבוש משאבת ואקום. אבק עבור 2 שעות כדי ליצור בשכבה של שני סוגים אלה של תרכובות silane מעורבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעל קצה מתכתי (מפוברק לתהליך זה) להציב את הטיפים על פלטה חשמלית. לאחר מכן לייבש את הטיפים במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס בתנאים אטמוספריים. לפני השימוש, לנקות את הכיריים, בעל מתכתי פינצטה באמצעות אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את ועצות חדר temperature, ולאחר מכן לטבול את הטיפים לתוך תמיסה של Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS, MW 5,000 Da) בריכוז של 5 מ&quot;מ כלורופורם המכיל 0.5% (v / v) triethylamine עבור 1 שעות ב טמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את קצות כלורופורם במשך 5 דקות ולאחר מכן לטבול אותו dimethylformamide (DMF) במשך 5 דקות נוספות. כדי deprotect קבוצת Fmoc של מולקולות PEG המצורפות, לטבול את העצות 20% piperidine (v / v) ב DMF למשך 30 דקות. טובלים את הטיפים DMF למשך 4 דקות ולאחר מכן ב N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) עבור 4 דקות נוספות. חזור על רציפי טבילת שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צימוד של חומצות אמינו, לטבול את קצות לתוך תמיסה המכילה N-terminal חומצת אמינו מוגנים (AA) / diisopropylethylamine (DIPEA) / 2- (1H-benzotriazol-1-י.ל) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluophosphate (HBTU), על יחס טוחנת של 1: 1: 1 בריכוז כולל של 30 מ&quot;מ ב 5 מ&quot;ל NMP עבור 1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צימוד פפטיד, לטבול את קצות לתוך המשך פתרון 5 מ&quot;לaining 40 מ&quot;ג של הפפטיד מוגן (רשתות מסוף וצד N, למשל Fmoc-GLN (TRT) -Pro-עלא-סר (TBU) -Ser (TBU) -Arg (PBF) -Tyr (TBU) -COOH.) , 15 מ&quot;ג 2- (1H-benzotriazol-1-י.ל) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), ו -5 מ&quot;ל של DIPEA בתמ&quot;א עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובל את הקצוות בתמ&quot;א למשך 4 דקות. לאחר מכן, כדי להגן על חינם / unreacted NH 2 קודחות ידי קבוצת אצטיל, לטבול את קצות למשך 30 דקות בתערובת של אצטית אנהידריד / DIPEA ביחס טוחנת 4: 1 ו ריכוז כולל של 0.65 M בתמ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צימוד פפטיד, לבצע שני צעדים נוספים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי deprotect הרשתות בצד של הפפטיד, לטבול את קצות לתוך תמיסה המכילה 95% TFA, 2.5% triisopropylsilane, ומים 2.5% במשך שעה 1, ולאחר מכן לשטוף עם כלורופורם DMF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הקבוצה Fmoc של הפפטיד, לטבול את קצות לתוך 20% piperidine (v / v) ב DMF למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברצף טובלים את הפפטיד / חומצת אמינו-functionalizeטיפים ד במשך ארבע דקות כל אחד ב DMF (פפטידים) או תמ&quot;א (עבור חומצות אמינו), כלורופורם, 50% אתנול ומים. לבסוף לייבש את הקצה באוויר. </li></ol> הכנת פני שטח 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תציץ. קליב מצעים (בקוטר 9.9 מ&quot;מ) לפני כל שימוש באמצעות נייר דבק. לאחר מכן, לשטוף את המשטחים עם מים מזוקקים משולשים (TDW). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן Tio 2 סיליקון מצופה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את פרוסות סיליקון (100) לתוך 2 ריבועים ס&quot;מ באמצעות עט היהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את המצע במבחנת 15 מיליליטר מלא אצטון sonicate זה במשך חמש דקות באמבטיה קולית. ואז, במקום משטח זה במבחנה 15 מיליליטר מלא isopropanol ו sonicate זה במשך 5 דקות. לייבש את המצע באמצעות חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את פעילי שטח (למשל, ביק-348) באתנול להכין פתרון 5% (משקל / נפח). לאחר מכן, להוסיף 0.02 מ&quot;ל של הפתרון פעילי שטח כדי פיזור 2 מ&quot;ל של 30% Tio 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך הפתרון שהתקבל, ירידה יצוקה 0.2 מ&quot;ל על מצע Si נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשל משטחים אלה-casted ירידה ב 250 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות באוויר. 41 </li></ol></li></ol> 3. מדידות ספקטרוסקופיה חיל מולקולה בודדת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף פני השטח הרצוי לבעל המתכתי של AFM עם דבק דו רכיבי זמינים מסחרית. מניח את בעל מתכתי בעל הזכוכית של AFM, אשר מעוצב כמו צלחת פטרי קטנה. מלאו בעל זה עם טריס חיץ (50 מ&quot;מ pH = 7.4) או בכל מדיום הרצוי. ואז, במקום בעל על הבמה AFM מתחת בעל קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את cantilevers AFM עם קבועי קפיץ הנעים בין 10 ל 30 pN / ננומטר בשיטת תנודות תרמיות 26 (כלולה בתוכנת AFM) עם חוסר ודאות מוחלט של כ -10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הכח של האינטראקציה על ידי פניית החומצות אמיניות או הקצה פונקציונלי-פפטיד למצע עד שהוא נמצא בקשר עם המצע עם דחיסהכוח של ~ 200 pN ומיד לחזור קצה במהירויות שונות, בין 0.1 כדי 0.8 מיקרומטר / s, למרחק של ~ 200 ננומטר. </li></ol> ניתוח 4. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את ערכי הסטייה (V) לכפות על ידי הכפלת רגישות photodiode (V / m) ושימוש קבוע הקפיץ נקבע באופן ניסיוני. 42 זה נעשה באופן אוטומטי על ידי תוכנת AFM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג עקומות FD עם אירועי מולקולה אחת אחת, שיא כמה מאות עקומות (800-1,500). השג שני שיאים עקומי מולקולה בודדת: השיא הראשון מציין אינטראקציות ספציפיות בין העצה לבין המשטח, מקבילת השיא השנייה של האינטראקציה הספציפית של המולקולה עם המשטח. כאשר, עקומת FD להכיל יותר משתי הפסגות האלה, וזורקים אותם מן החישוב של הכח הסביר ביותר. הערה: אירועי הידבקות אחת בלבד נלקחים בחשבון (בין 10 ל 30% של העקומות). 43 </li></ol></li><li&gt; כדי לחשב את קצב הטעינה לכאורה, בכושר לפחות 50 כוח מול עקומות המרחק עם שרשרת דמוית תולעת (WLC) מודל 44 רק לפני הקרע על מנת להשיג מגוון של שיעורי הטעינה, אשר משמשים להכנת היסטוגרמות של שיעורי ההעמסה לכאורה. לגזור את כוחות unbinding בין חומצות פפטידים / אמינו השטח מן הקפיצה בתוקף לאחר שנפרד השלוחה מן המצע. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שלבי 1.3, 1.4 ו -1.7 בפרוטוקול צריכות להתבצע בזהירות נרחבת ובאופן מאוד עדין. בשלב 1.3, קצה צריך לא להיות בקשר עם תערובת silane ותהליך silanization צריכה להתבצע באווירה אינרטי (לחות חינם). 45 הדבר נעשה על מנת למנוע היווצרות multilayer ובגלל מולקולות silane לעבור הידרוליזה בקלות בנוכחות של לחות. 45 בשלב 1.4, הטמפרטורה והזמן צריכים להישמר כראוי. לפני שתתחיל לבצע את השל...

האינטראקציה בין חלבונים ומינרלים אורגניים מובילה לבניית חומרים מרוכבים בעלי תכונות ייחודיות. זה כולל חומרים בעלי חוזק מכני גבוה או תכונות אופטיות ייחודיות. 1, 2 לדוגמה, שילוב של קולגן חלבון עם hydroxyapatite מינרליים מייצר או עצמות רכות או קשות עבור פונקציות שונות. 3 פפטידים קצרים יכול גם לאגד חומרים אורגניים עם סגוליות גבוהות. 4, 5, 6 הספציפיות של פפטידים אלה נעשה שימוש לעיצוב חומרים מגנטיים וחשמליים, 7, 8, 9 בודת חומרי nanostructured, גדל גבישים, חלקיקים 10 וסינתזה. 11 הבנת המנגנון שבבסיס יחסי גומלין בין פפטידים או חלבונים וחומרים אורגניים ולכן יהיה לאפשר לנו לתכנן חומרים מרוכבים חדשים בעלי תכונות ספיחה משופרות. בנוסף, מאז שלבי ביניים של שתלים עם תגובה חיסונית מתווכים על ידי חלבונים, הבנה טובה יותר של האינטראקציות של חלבונים עם חומרים אורגניים תשפר את יכולתנו לעצב שתלים. תחום חשוב נוסף כרוך חלבוני אינטראקציה עם משטחים אורגניים הוא הייצור של חומרי antifouling. 12, 13, 14, 15 Biofouling היא תהליך בלתי רצוי שבו אורגניזמים לצרף משטח. יש לה השלכות מזיקות רבות על חיינו. לדוגמא, biofouling של חיידקים על ומכשירים רפואיים גורר בעקבותיו זיהומי רכשה חולים. Biofouling של יצורים ימיים על סירות וספינות גדולות מגדיל את<html> צריכת הדלק. 12, 16, 17, 18 ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת (SMFS), באמצעות AFM, יכולה למדוד את האינטראקציות ישירות בין חומצת אמינו או פפטיד עם מצע. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 שיטות אחרות כגון תצוגה הפאג, 27, 28 microbalance קריסטל קוורץ (QCM) 29 או תהודה plasmon פני השטח (SPR) 29, 30, 31, 32,נ&quot;צ &quot;&gt; 33 מדד יחסי הגומלין של פפטידים וחלבונים למשטחים אורגניים בתפזורת. 34, 35, 36 משמעות הדבר היא כי התוצאות שהושגו על ידי שיטות אלה מתייחסים הרכבים של מולקולות או אגרגטים. בשנת SMFS, אחד או מעט מאוד מולקולות שתוקנו על קצה AFM ויחסי הגומלין שלהם עם המצע הרצוי נמדד. גישה זו ניתן להרחיב ללמוד קיפול חלבונים על ידי משיכת חלבון מפני השטח. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי למדוד אינטראקציות בין תאים וחלבונים הכריכה של נוגדנים הליגנדים שלהם. 37, 38, 39, 40 מאמר זה מתאר בפירוט כיצד לצרף פפטידים או או חומצות אמינו אל קצה AFM באמצעות כימית silanol. בנוסף, העיתון מסביר כיצד לבצע מדידות כוח וכיצד לנתח אתתוצאות.

<table><tbody><tr><td>סיליקון ניטריד (Si3N4) שלוחות-AFM עם קצות סיליקון</td><td>Bruker (Camarilo, CA, USA)</td><td></td><td>MSNL10, רדיוס נומינלי של שלוחים ~ 2 ננומטר&nbsp;</td></tr><tr><td>מתילטריאתוקסיסילן&nbsp;</td><td>אקרוס אורגניקס (ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td></td><td>לסילילציה של קצה AFM&nbsp;</td></tr><tr><td>3-(אמינופרופיל) triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich (ירושלים, ישראל)</td><td></td><td>לסילציה של קצה AFM</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma-Aldrich (ירושלים, ישראל)</td><td></td><td>משמש להגנה מפני פפטידים</td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine</td><td>Alfa-Aesar (לנקשייר, בריטניה)</td><td></td><td>משמש לשינוי קצה</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Alfa-Aesar (לנקשייר, בריטניה)</td><td></td><td>משמש לקצה שינוי</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Alfa-Aesar (לנקשייר, בריטניה)</td><td></td><td>משמש להגנה מפני Fmoc בקצה</td></tr><tr><td>Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide&nbsp; (Fmoc-PEG-NHS)</td><td>Iris Biotech GmbH (גרמניה, גרמניה)</td><td></td><td>משמש כמקשר הגמיש הקוולנטי&nbsp; (MW = 5,000 Da)</td></tr><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)</td><td>Alfa Aser (Heysham, אנגליה)</td><td></td><td>משמש כמגיב צימוד.&nbsp;</td></tr><tr><td>N-מתיל-2-פירולידון (NMP)</td><td>אקרוס אורגניקס (ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td></td><td>משמש כממס בהליך שינוי קצה</td></tr><tr><td>DMF (דימתילפורממיד)</td><td>מרק (דרמשטדט, גרמניה)</td><td></td><td>משמש כממס בהליך שינוי קצה</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>ביו-מעבדה (ירושלים, ישראל)</td><td></td><td>משמש כממס בהליך שינוי קצה</td></tr><tr><td>אתנול (נטול מים)</td><td>גדות (נתניה, ישראל)</td><td></td><td>משמש כממס בהליך שינוי קצה</td></tr><tr><td>חומצה אצטית טריפלואורו (TFA</td><td>) Merck (דרמשטדט, גרמניה)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אנהידריד אצטי</td><td>Merck (דרמשטדט, גרמניה)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>פפטידים</td><td>GL Biochem (שנחאי, סין).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פנילאלנין וטירוזין&nbsp;</td><td>Biochem (דרמשטדט, גרמניה)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיזור של 30% TiO2 בתערובת של ממס 2-(2-מתוקסיאתוקסי) אתנול (DEGME) ואתיל 3-אתוקסיפרופיונאט (EEP)</td> <td>Applied Vision Laboratories (ירושלים, ישראל)</td><td></td> <td>(30%) בתערובת של ממס 2-(2 מתוקסיאתוקסי) אתנול (DEGME) ואתיל-3-אתוקסיפרופיונאט (EEP). משמש להכנת מצע TiO2</td></tr><tr><td>מצעי נציץ</td><td>TED PELLA, INC. (רדינג, קליפורניה, ארה"ב)</td><td></td><td>קוטר 9.9 מ"מ</td></tr></tbody></table>

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

האינטראקציות בין חלבונים או פפטידים וחומרים אורגניים להוביל כמה תהליכים מעניינים. לדוגמה, שילוב חלבונים עם מינרלים מוביל להיווצרות של חומרים מרוכבים עם מאפיינים ייחודיים. בנוסף, תהליך בלתי רצוי של biofouling הוא שיזם ספיחה של מולקולות ביולוגיות, בעיקר חלבונים, על משטחים. שכבה אורגנית זוהי שכבת הדבקה לחיידקים ומאפשרת להם לקיים אינטראקציה עם פני השטח. הבנת כוחות היסוד השולטים אינטראקציות בממשק האורגני-אורגני לכן חשובה בתחומים רבים של מחקר עלול להוביל העיצוב של חומרים חדשים עבור יישומים אופטיים, מכאניים ביו. מסמך זה מדגים טכניקת ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת כי מנצלת AFM למדוד את כוח ההדבקה בין אם פפטידים או חומצות אמינו ומשטחים אורגניים מוגדרים היטב. טכניקה זו כרוכה פרוטוקול הצמדת biomolecule אל AFMלהטות באמצעות מקשר קוולנטי גמיש ומדידות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. בנוסף, ניתוח מדידות אלה כלול.

איור 1 מציג את הליך שינוי הקצה. בשלב הראשון, טיפול פלזמה משנה את פני השטח של קצה סיליקון ניטריד. הטיפ מציג קבוצות OH. קבוצות אלו מכן תגבנה עם silanes. בסוף שלב זה, פני השטח של קצה יכוסו על ידי -NH 2 קבוצות בחינם. אמינים חינם אלה אז יגיבו עם Fmoc -PEG-NHS, מקשר קוולנטי. קבוצת Fmoc של מקשר PEG הוסרה על ידי pipyridine, ריאגנט deprotecting. לבסוף, מולקולת הפפטיד או חומצת אמינו בחן מצמידים דרך קבוצת אמינית החופשית של PEG באמצ...

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדוד את הכח של אינטראקציות בין משטח אורגני מוגדר היטב או פפטידים או חומצות אמינו על ידי מדידות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). המידע המתקבל מהמדידה חשוב להבין טוב יותר את שלבי חומר פפטיד-אורגנית.

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

המטרה הכוללת של טכניקת ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה אחת היא לקבוע את כוח ההדבקה ואופי האינטראקציות בין חומצות אמינו או פפטידים עם משטחים שונים. עניין זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכימיה של פני השטח ולשמש לפיתוח חומרים מרוכבים ואקורדים חדשים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מידע על אינטראקציה בין המולקולה הרצויה למשטחים ברמת המולקולה הבודדת.כדי להתחיל, רכשו שלוחות-AFM סיליקון ניטריד המצוידות בקצות סיליקון ברדיוס שלוחה נומינלי של שני ננומטרים. הרכיב את הקצה על המחזיק. נקו כל אחד משלוחות-ה-AFM על ידי טבילתם באתנול למשך 20 דקות ולאחר מכן יבשו אותם בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הכניסו את הקצוות לתא פלזמה וטפלו בשלוחה על ידי חשיפתם לפלזמת חמצן למשך חמש דקות. הכן תמיסה המכילה 15 חלקים methyltriethoxysilane וחלק אחד שלושה אמינו פרופילtriethoxysilane ותלה את ה-canitlevers שלושה סנטימטרים מעל התמיסה באווירה אינרטית. חשוב שהטיפים והמחזיק לא ייגעו בתערובת הסילאן.בנוסף, הסילאן רגיש מאוד ללחות, ולכן טיפים אלה צריכים להתבצע באווירה אינרטית. לאחר האיטום, חבר את המייבש למשאבת ואקום והחל ואקום למשך שעתיים ליצירת שכבה אחת של שני סוגי תרכובות הסילאן המעורבות על פני השלוחות. הסר בזהירות את הקצוות והניח אותם על פלטה חמה שחוממת מראש ל -70 מעלות צלזיוס.השאירו את הטיפים לייבוש למשך 10 דקות. מצננים את הקצוות בטמפרטורת החדר לפני שטובלים אותם בתמיסה של Fmoc-PEG-NHS למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, טבלו את הקצוות בכלורופורם למשך חמש דקות ולאחר מכן ב-DMF למשך חמש דקות נוספות.לאחר הדגירה ב-DMF, הסר את ההגנה על קבוצות ה-Fmoc של מולקולות ה-PEG המצורפות על ידי טבילת הקצוות בתמיסת 20% פיפרידין ב-DMF למשך 30 דקות. שוב, טבלו את הקצוות ב-DMF למשך ארבע דקות ולאחר מכן ב-N-Methyl-2-pyrrolidone למשך ארבע דקות נוספות. כדי לחבר חומצות אמינו על הקצוות, טבלו למשך שעה וחצי בתמיסת צימוד חומצות אמינו בריכוז כולל של 30 מילי-מולרית וחמישה מיליליטר של N-Methyl-2-pyrrolidone.כדי להגן על שאריות ה-PEG החופשיות או הבלתי מגיבות שנותרו על ידי קבוצת האצטיל, טבלו את הקצוות למשך 30 דקות בתערובת מולרית של 0.65 מולרית של ארבעה חלקים אנהידריד אצטי וחלק אחד דיסופרופילאתילאמין ו-N-מתיל-2-פירולידון. לאחר מכן טבלו ברצף את הקצוות הפונקציונליים של חומצת האמינו הפפטידית למשך ארבע דקות כל אחד ב-NMP, כלורופורם, 50% אתנול ומים לפני שייבשו את הקצה באוויר. חבר את משטח הבדיקה הרצוי למחזיק מתכתי של ה-AFM עם אפוקסי זמין מסחרית.לאחר מכן, הנח את המחזיק המתכתי לתוך מחזיק הזכוכית של ה-AFM, המעוצב כצלחת פטרי קטנה. מלא את מחזיק הזכוכית במאגר TRIS. ולאחר מכן הנח את המחזיק המתכתי על AFM tagה מתחת למחזיק הקצה.לאחר מכן, התקן את קצה ה-AFM על הזכוכית האופטית של ה-AFM. הנח את גוש הזכוכית האופטי בראש ה-AFM. והניחו את ראש ה-AFM על הבמה.לאחר מכן, כייל את שלוחת ה-AFM עם קבועי קפיץ הנעים בין 10 ל-30 פיקונוטון לננומטר. מדידת כוח טיפוסית מביאה לעקומת מרחק כוח כמו אלה המוצגות כאן. ההצצה הראשונה מצביעה על אינטראקציות לא ספציפיות בין הקצה למשטח וההצצה השנייה מתייחסת לאירוע ההדבקה הספציפי.מכמה מאות עקומות מרחק כוח, ניתן לבנות היסטוגרמה על ידי התוויית מספר אירועי ההדבקה לעומת הכוח. החלת התאמה גאוס על היסטוגרמות אלה תקבע את הכוח הסביר ביותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשנות כימית קצות AFM עם חומצות אמינו או פפטידים וכיצד לבצע ספקטרוסקופיה של כוח מולקולה אחת באמצעות AFM.

insights-into-interactions-amino-acids-peptides-with-inorganic

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים המיועדים לעיכול תאית. SMFS מבוסס AFM שימש לחקר התכונות המכניות ותצורת הקיפול של מכלולי חלבון הקשורים לתאית. אנו מציגים זרימת עבודה מלאה לקיבוע חלבונים, רכישת נתונים וניתוח נתונים כדי לחקור את האינטראקציות של קומפלקסים בודדים של קולטנים-ליגנדים המעורבים בהרכבת תאית.

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

אנו מתארים את היישום של ננו ספקטרוסקופית אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ כוח אטומי כדי להמחיש את תהליך של חלבון הרכבה עצמית לתוך אגרגטים oligomeric ו-עמילואיד fibrils, אשר קשורה היטב התחלתה ופיתוח של מגוון רחב של מחלות ניווניות אנושיות.

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) היא טכניקה חזקה לפתיחה מכנית וחישה בזמן אמת של מערך אנסמבל של מבנים ביומולקולריים בתחומים ביופיזיים וביו-סנסורים.

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה

פינצטה פלזמונית משתמשת בתהודה פלזמונית מקומית על פני השטח בננו-מבני זהב כדי ללכוד ננו-חלקיקים בודדים, כולל חלבונים, בתוך שדה אופטי בקנה מידה ננומטרי. שינויים באות המפוזר חושפים נוכחות חלבון ודינמיקה קונפורמטיבית, ומאפשרים ניטור ללא שינויים בפלואורופור או קשירת פני השטח.

ניטור דינמיקת קונפורמציה של חלבונים בודדים לא מותאמים באמצעות פינצטה פלזמונית

חקור את כוחות ההידבקות בין חומצות אמינו ופפטידים לשטחים אי-אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית כוח מולקולה בודדת עם מיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של אינטראקציות מולקולריות לפיתוח חומרים חדשים.

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

גלה סרטונים נוספים