התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תפקוד הגנים ב-Dermestes maculatus, מערכת מודל חרקים חדשה, המייצגת את קבוצת החיפושיות המגוונת, ומקלה על חקר שאלות מחקר בסיסיות ויישומיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית, הביולוגיה האבולוציונית ועוד, על ידי כך שהיא מאפשרת לבחון את תפקוד הגנים בעוברים ובבוגרים של דרמסטס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בהפרעות RNA כדי למקד כל גן, על סמך מידע רצף בלבד, גם בהיעדר רצף גנום מלא.

השיטות שהוצגו כאן לא רק מספקות גישה לחקר תפקוד הגנים בדרמסטס. ניתן ליישם אותם גם לפיתוח מערכות מודל חרקים חדשות, ואולי להדברת מזיקי חרקים. להכנת כלוב גידול ל- D.maculatus, מורחים תחילה שכבה דקה של שבבי עץ לכלוב חרקים בגודל בינוני.

הכניסו קטע קלקר לכלוב כדי לאפשר לזחלים סביבה להתגלם. הוסף לכלוב עשרים עד חמישים חיפושיות בוגרות או זחלים מאוחרים. הניחו מזון רטוב לחתולים בצלחת פטרי או בסירת שקיל, כמקור מזון.

מכסים את הכלוב בבד רשת ומכניסים אותו לחממה. לפני תחילת איסוף העוברים, בדוק תחילה את הכלוב היטב עבור כל העוברים הקיימים והסר אותם. לאחר שהכלוב פנוי, הניחו צמר גפן מתוח לתוך הכלוב ודגרו על המושבה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.

לאחר חלון הזמן המתאים, אספו את כדור הצמר גפן, הוציאו את כל המבוגרים הנוכחים, והחזירו אותם לכלוב. מעל פיסת נייר בנייה שחורה, צבטו בעדינות את כדור הצמר גפן וקרעו אותו לאט לחוט דק, כך שכל הביצים הקיימות ייפלו על הנייר השחור. קח מכסה צלחת פטרי רגיל, והשתמש בפיסת נייר סינון שחור כדי לכסות את החלק הפנימי.

הדביקו חתיכת סרט דו צדדי לאורך קצה שקופית מיקרוסקופ רגילה. הנח את שקופית המיקרוסקופ על נייר הסינון השחור במכסה צלחת הפטרי. לוקחים את הנייר המכיל את העוברים שנאספו, מקישים בעדינות כדי להעביר את העוברים למכסה צלחת הפטרי.

בעזרת מכחול, יישר את העוברים על הסרט בניצב לשקופית, כשהקצה הקדמי או האחורי לכיוון הקצה. כדי להתחיל RNAi, קח תחילה 2-4 מיקרוליטר של dsRNA לקצה פיפטה של 20 מיקרו מעמיס. הכנס את הקצה לתוך נימי זכוכית שנמשכו מראש, המכונה המחט, והכניסו בעדינות את התמיסה לתוך המחט.

תקן את המחט למחזיק נימי זכוכית ולאחר מכן הרכיב את מחזיק הנימים לתוך המיקרומניפולטור. לאחר מכן, העבירו בזהירות את השקופית עם עוברים המחוברים לשלב המיקרוסקופ המנתח. הזיזו את השקופית כדי להביא עובר אחד למרכז השדה ומקדו את המיקרוסקופ.

תוך כדי הסתכלות לתוך טווח הניתוח, מקם את קצה הנימים עם המיקרומניפולטור. קרבו את הקצה לסוף העובר הראשון בשורה. הפעל את אספקת החנקן או האוויר, ולאחר מכן הגדר את מתג בורר כניסת הסולנואיד לוואקום.

כוונן את ווסת לחץ הפליטה ל-10-15 psi, בהתאם למנגנון. פתח את הנימים, ותמיסת ה-dsRNA הצבעונית תמלא את הקצה, מוכן להזרקה. הזיזו את קצה הנימים קדימה, ונקבו בעדינות את העובר.

בהגדרות לחץ אידיאליות, שום נוזל עוברי לא יזרום לנימים. צעד על מתג כף הרגל כדי להוציא dsRNA לתוך העובר, עד לחלוקת הכמות המתאימה. השאירו את הקצה בתוך העובר למשך כשתי שניות, ולאחר מכן הסירו אותו בזהירות.

לאחר שכל העוברים הוזרקו, הניחו את השקופית בצלחת פטרי. הוסף כדור צמר גפן רטוב לתבשיל, הקפד לא לתת לו לבוא במגע עם המגלשה. מכסים את צלחת הפטרי ועוטפים אותה בניילון איטום.

סמן אותו עם סוג ה-dsRNA, הריכוז, התאריך, השעה ומספר העוברים שהוזרקו. לבסוף, הכניסו את המנה לאינקובטור בחום של 30 מעלות צלזיוס עד שהעוברים בוקעים. כדי לבצע pRNAi, אסוף תחילה גלמים מהמושבה.

מיין גלמים זכרים ונקבות לשני כלים נפרדים, ומניח אותם באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס. בדקו את הצלחות מדי יום לאיתור חיפושיות סגורות, והעבירו את הפרטים האלה לשתי צלחות פטרי נפרדות לזכרים ולנקבות בוגרים. האכילו את הבוגרים הללו ותחזקו את הצלחות כל יומיים, עד שמספיק בוגרים יסגרו כדי להתחיל בהזרקה.

לאחר השלמת הבריכה הבוגרת, הרדימו חיפושית נקבה, והחזיקו את צד הגחון הבודד כלפי מעלה ביד אחת, והחזיקו את המזרק ביד השנייה. חודרים בעדינות לקרום הסגמקוריה בין סטרניטים 2 ו -3. בדוק את סולם המזרק והחלק לאט לאט כשני מיקרוליטר לנקבה.

לאחר ההזרקה, החזק את המחט יציבה למשך 5 שניות לפחות ולאחר מכן משוך אותה בזהירות. העבירו נקבות מוזרקות לצלחת פטרי עם מזון לחתולים. סמן את המנה בהתאם.

מניחים את המנה באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, העבירו את הנקבות שהוזרקו לכלוב מיני, והוסיפו מספר שווה של זכרים צעירים שלא הוזרקו. סמנו את הכלוב והוסיפו מזון לחתולים.

הכניסו את הכלוב לאינקובטור של 30 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר הזדווגות. לאחר מכן ניתן לבחון את הצאצאים שנוצרו כדי לקבוע את ההשפעות של ה-pRNAi. תמונה זו מציגה צאצא של פרט pRNAi המוזרק עם DS GFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק כבקרה.

כאן, כמו אצל פרטים מסוג בר, הצאצאים בקעו עם פס פיגמנטי אחד לכל מקטע. פסים פיגמנטיים שכנים הופרדו על ידי פער לא פיגמנטי. בעקבות pRNAi מזווג, צאצאים מושפעים בקעו עם פסים פיגמנטיים שכנים מאוחדים, מה שמעיד על גבולות סגמנטליים פגומים.

חומרת הפנוטיפ הייתה משתנה, אך היתוך הופיע באופן עקבי באזורי גבול מסוימים, מה שמצביע על פגמים דמויי שלטון זוגי. באופן דומה, פנוטיפים של ציפורן של עוברים שלא בקעו לאחר נוקדאון זוגי הראו אובדן מקטעי בטן, כמו גם אורך גוף מקוצר. צביעה של עוברים מוקדמים עם נוגדן מוטבע לבחינת פגמים מולקולריים הראתה פסי ביטוי בעוצמה שווה בכל מקטע בקבוצת הביקורת.

לעומת זאת, ביטוי מופחת זוהה בפסים חלופיים בצאצאים של נקבות שהוזרקו dsRNA מזווגות Dmac. דפוס זה של ביטוי מופחת עולה בקנה אחד עם דפוס הקוטיקולה הפגום שנצפה בזחלים שנבקעו. כאן, בפעם הראשונה, אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו להפלת גן מעניין, במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת ב-Dermestes maculatus, באמצעות הפרעות RNA.

בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור להשתמש בעוברים או בנקבות בוגרות בשלב המתאים. לאחר השליטה, ניתן לבצע הזרקה של כ-100 עוברים או 10 נקבות בוגרות תוך חצי שעה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו צביעת עובר או PCR כמותי על מנת לענות על שאלות נוספות על מנגנוני ויסות גנים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים מושבת מעבדה של דרמסטס, ולבצע הפרעות RNA עובריות והוריות בחיפושית זו. נכון לעכשיו, רק מספר קטן של מודלים של חרקים זמינים למחקרים פונקציונליים. הטכניקות המוצגות כאן סוללות את הדרך לחוקרים להשתמש בדרמסטס כמערכת מודל, ומרחיבות את היקף החרקים הניתנים לניתוח גנטי מולקולרי.