Name: התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנא סתר החיפושית, Dermestes maculatus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: למד שיטות RNAi עוברי והורי בחיפושית Dermestes maculatus לחקר פונקציית גנים. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניתוח פנוטיפים עובריים ופיתוח מודלים חדשים לבקרת מזיקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר אליסון הפפר ויונג לו על הקמת מנגנון המיקרו-הזרקה ושיתוף הידע והניסיון שלא יסולא בפז שלהם עם RNAi של חרקים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01GM113230 ל-L.P).

למחברים אין מה לחשוף.

בעוד מספר קטן של מערכות מודל משוכללות (עכברים, זבובים, תולעים) פותח במהלך המאה ה -20, המאה ה -21 התאפיינה בגל של מערכות חיה חדשות שמפתח במעבדות ברחבי העולם. מערכות החדשות אלה מאפשרים מדענים לעסוק בשאלות השוואתיות, אבולוציוני כי לא יכול להיות נחקרת אך ורק באמצעות מערכות מודל &quot;הרגילות&quot;. פריסה זו של דגמים חדשים דורשת ההתפתחות המהירה של שיטות culturing מעבדה, זיהוי גנים, וגישות תפקודיות מינים חדשים. הנה, נהלים לגידול ד maculatus במעבדה צעד-אחר-...

בשנת 1998, אש מלו דיווחו כי RNA פעמיים תקועים (dsRNA) יכול לגרום עיכוב של פונקציה גנים elegans Caenorhabditis 1. תגובה זו מופעלת על ידי dsRNA נקראה התערבות RNA (RNAi), ו להשתקת גנים RNAi בתיווך כזה נמסר ישומרו ב בעלי חיים, צמחים, ופטריות 2-7. בצמחים וכמה חיות, פונקציות RNAi מערכתית, כלומר ההשפעה יכולה להתפשט תאים / רקמות אחרות שבהן dsRNA לא הציג באופן ישיר (הנסקרת ב 8-10). מדענים עשו שימוש בתגובה RNAi הסלולר אנדוגני זאת על ידי תכנון dsRNAs למקד את הגנים של עניין, ובכך דריסה תפקוד הגן ללא מניפולציה של הגנום ישירות (הנסקרת ב 11-14). RNAi הוא כלי רב עצמה עבור מחקרים תפקודיים בשל היתרונות הבאים. ראשית, אפילו עם מידע רצף הגן מינימלי, גן יכול להיות ממוקד באמצעות RNAi. זה חשוב במיוחד עבור studies של אורגניזמים שאינם מודל חסר הנתונים הגנומי או transcriptomic. שנית, באורגניזמים שבו תגובת RNAi היא מערכתית וחסון, מציאת גן בתיווך RNAi ניתן לבצע כמעט בכל שלב התפתחותי. תכונה זו שימושית מאוד ללימוד הפונקציה של גני pleiotropic. שלישית, במקרים מסוימים, תופעות RNAi להתפשט אל בלוטות המין וצאצאים, כך פנוטיפים הם נצפו בצאצאים 15,16. תופעה זו, המכונית RNAi ההורי (pRNAi), יש יתרון במיוחד עבור גני ההשפיע התפתחות עוברית, כמו צאצאים רבים המיוצרים על ידי הורה מוזרק אחת יכולים להיבחן ללא מניפולציה ישירה של ביצים. מסיבות אלה, pRNAi היא השיטה של ​​בחירה. עם זאת, אם pRNAi אינו יעיל, למשל עבור הגנים הדרושים oogenesis, אז העוברי RNAi (eRNAi) חייב לשמש. הרביעית, RNAi יכול לשמש כדי ליצור את המקבילה של סדרת אללים ב שכמות dsRNA לגידולים יכולות להיות מגוונות על פני טווח לייצר חלש לפגמים חזקים. כזה הדרגתיות של פנוטיפים יכולה להיות מועילה להבנת תפקוד גן כאשר הגן מעורב תהליך מורכב ו / או אובדן מוחלט של פונקציה הוא קטלני. חמישי, מסירת dsRNA קלה בדרך כלל ריאלית, במיוחד בחיות מראות תגובות RNAi מערכתיות חזקות. dsRNA יכול להיות מוצג על ידי microinjection 1,5, האכלה / בליעה 17,18, השריה, 19,20 ו וירוס / מסירה בתיווך חיידקים 21,22. השישית, בניגוד לשיטות מיקוד / עריכה כמה גן, אין צורך למסך אורגניזמים נושא את המוטציה או לבצע צלבים גנטיים לייצר הומוזיגוטים בעת שימוש RNAi. לכן, לעומת טכניקות רבות אחרות לחקר תפקוד גן, RNAi הוא מהיר, זול, והוא יכול להיות מיושם על מסכים גדול בקנה מידה 23-25. השירות הרחב של RNAi מספק אמצעים לבצע מחקרים פונקציונליים במגוון רחב של אורגניזמים, הרחבת סל מינים לרשותנו בעבודה beyonד מערכות המודל המסורתי עבורו פותחו כלים גנטיים. לדוגמא, מחקרים באמצעות מערכות שאינם מודל נדרשים לתת תובנה על האבולוציה של גני רשתות גנים ידי השוואת הפונקציות של orthologs ממינים המייצגות מצבי פיתוח שונים או מפגין תכונות מורפולוגיות ברורות 26-29. אלו סוגים של מחקרים יספקו הבנה טובה יותר של מגוון ביולוגי, עם שפעות הוא למחקר יישומים ובסיסי. להיות קבוצת החיה הגדולה ביותר בכדור הארץ, חרקים מספקים הזדמנות מצוינת לחקור את המנגנונים מגוונים בסיסית. בנוסף, החרקים קטנים בדרך כלל, יש מחזור חיים קצר, פוריות גבוהה, והם קלים אחוריים במעבדה. בשני העשורים האחרונים, RNAi יושם בהצלחה חרקים פורש הזמנות, כולל Diptera (זבובים נכון) 5, פרפראים (פרפרים ועשים) 30, Coleoptera (חיפושיות) 16,31, דבוראים (sawfשקרים, צרעות, נמלים ודבורים) 32, פשפשאים (באגים נכון), Isoptera (טרמיטים) 34, Blattodea (ג'וקים) 35, חגבאים (צרצרים, חגבים, ארבה, ו katydids) 36 ו Phthiraptera (כינים) 37. יישום מוצלח של RNAi ספק נתונים תפקודיים ללימודים של דפוסים ב העובר מוקדם (posterior-קדמי ציר 32, ציר-גחון הגבה 28, פילוח 26,38), קביעת הזוויג 39,40, כיטין / לציפורן ביוסינתזה 41, ecdysone איתות 42, התנהגות חברתית 43, ועוד. שיטות RNAi שפותחו עבור מיני חרקים שונים עשויות להועיל נוסף כי הם צפויים להיות שימושיים עבור דברה (הנסקרת ב 44-46). תופעות RNAi תהיינה גן ספציפי כמו גם מינים ספציפיים, כל עוד אזורים שאינם שמורה נבחרים למיקוד. עבור מינים של חרקים מועילים כמו דבורי דבש תולעי משי, מיקוד גנים חיוניים להישרדותו שלוירוסים או טפילים לשלוט הזיהום עלול לספק אסטרטגיה חדשנית להגן על מינים אלה 47,48. Dermestes maculatus (ד maculatus), חיפושית להסתיר השם הנפוץ, מופץ ברחבי העולם למעט אנטארקטיקה. כמו חרק holometabolous, מחזור חי ד maculatus כולל עוברי, זחל, גלמים, ושלבי מבוגר (איור 1). כי זה נזון בשר, ד maculatus משמש במוזיאונים כדי skeletonize חיות מתות חוקרי חרקים משפטיים יכולים להשתמש בו כדי להעריך את זמן המוות 49,50. ד maculatus נזון מוצרים מן החי כוללים פגרים, בשר מיובש, גבינה, ואת הגלמים / פקעות של חרקים אחרים ובכך גורם לפגיעה במשקי בית, מזון מאוחסן, ואת המשי, גבינה, ותעשיות בשר 51,52. החלת RNAi ב חיפושית זו יכולה לספק דרך יעילה וידידותית לסביבה כדי למזער את ההשפעה הכלכלית שלה. המעבדה שלנו השתמשה ד maculatus כמו מ 'חדשחרק אודל ללמוד פילוח 53. בנוסף להיותו מקובל גידול במעבדה, ד maculatus הוא עניין למחקר בסיסי כמו זה הינה יזמית ביניים-נבט, מה שהופך אותו זן כדאי ללמוד את המעבר בין קצר ופיתוח-נבט ארוך. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg"> איור 1: מחזור החיים של ד maculatus. תצלומים של ד maculatus בשלבים שונים בחיים, כפי שצוין. מחזור החיים מביצה לבוגר לוקח שלושה שבועות על 30 מעלות צלזיוס אבל כבר בטמפרטורות נמוכות. (A, F) טרי עוברים הניח הם מלבן לצהוב סגלגל בהיר, כ 1.5 מ"מ אורך. העובר לוקח ~ 55 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. (B, C ו- G) זחלים יש פסי פיגמנט כהים מכוסים setae. הזחלים לעבור instars מספר בהתאם לסביבה ואורכם יכול להימשך עד מעל 1 ס"מ. (D, H) (E, I) זמן קצר לאחר eclosion, פיגמנטציה כהה מופיעה מעל גוף החיפושית המבוגרת. מבוגרים יכולים לחיות עד מספר חודשים ונקבה אפשר לגולל מאות עוברים במהלך חייה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בעבר, הראינו כי RNAi יעיל דריסת תפקוד גן ב ד maculatus 53. הנה הניסיון שלנו לגדל מושבות ד maculatus במעבדה משותף יחד עם צעד-אחר-צעד פרוטוקולים הן עובריים והורית RNAi הגדרת, זריקה, טיפול לאחר ההזרקה, וניתוח פנוטיפי. מציאת גן dsRNA בתיווך ושיטות ניתוח הציגו כאן לא רק לספק מידע מפורט לטיפול שאלות ב ד maculatus, אבל יש גם משמעות פוטנציאל FOr החלת RNAi ב חיפושית שאינם מודל אחר / מיני חרקים.

<table><tbody><tr><td>Dermestes maculatus חיפושיות חיות המעבדה</td><td>שלנו או האספקה הביולוגית של קרוליינה</td> <td>#144168</td><td>זן המעבדה שלנו אומת על ידי ברקוד COI; לא ניתן לשלול וריאציה של זן מקרולינה</td></tr> מזון <tr><td>חתולים רטוב</td> נתחי בשר <td>מפוארים</td><td></td><td>עם רוטב. יכול לקנות ברוב חנויות המזון לחיות מחמד והמכולת</td></tr><tr><td>מזון יבש לכלבים</td><td>פורינה גור צ'או</td><td></td><td>יכול לקנות ברוב חנויות המזון לחיות מחמד והמכולת</td></tr><tr><td>כלוב חרקים (גודל בינוני, 30.5 x 19 x 20.3 ס"מ)</td> <td>Exo Terra</td><td>PT2260</td><td>לתחזוקת המושבה. יכול להשתמש בכלוב גדול יותר במידת הצורך</td></tr><tr><td>כלוב חרקים (גודל מיני, 17.8 x 10.2 x 12.7 ס"מ)</td> <td>Exo Terra</td><td>PT2250</td><td>לאיסוף עוברים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>צמר גפן כדור</td><td>פישר</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תמלול Megascript T7</td><td>פישר</td><td>AM1334</td><td>ל -40 תגובות</td></tr><tr><td>משאבה פנאומטית</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק נימי</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון שחור (90&nbsp; מ"מ)</td> <td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>צבעי מאכל (ירוק)</td> <td>נימי זכוכית מקורמיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט</td><td>הילגנברג</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מחט (חולץ מיקרופיפטה)</td> <td>Sutter Instrument Co.</td><td>שקופית זכוכית מיקרוסקופ P-97</td><td></td></tr><tr><td></td><td>חטיבת מדעי החיים ברחבי העולם</td><td>41351157</td><td></td></tr><tr><td>סרט איטום (Parafilm M)</td> <td>מזרק פישר</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>דגם 801 (10&nbsp; ומיקרו; l)</td> מחט <td>המילטון</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>(מד 32)&nbsp;</td><td>המילטון</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>פתרון קיבוע (Pampel's)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>רעיל, צריך לטפל במלקחיים של מכסה המנוע</td></tr><tr><td>(DUMONT #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>תלוש כיסוי (24 x 50 מ"מ, מס' 1.5)</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader קצה פיפטה</td><td>פישר</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>חיתוך מיקרוסקופיה להזרקת עוברים</td><td>Leica</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופיה להדמיה פנוטיפית של זחלים</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover. V12</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה DIC</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager. M1</td><td></td></tr></tbody></table>

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

ההתקדמות בגנומיקה העלתה את האפשרות לחקור את המגוון הביולוגי בקנה מידה חסר תקדים. עם זאת, רצף לבדו לא יהיה אינפורמטיבי ללא כלים לחקר תפקוד הגנים. פיתוח ושיתוף של פרוטוקולים מפורטים להקמת מערכות מודל חדשות במעבדות, ולכלים לביצוע מחקרים פונקציונליים, הוא אפוא חיוני למינוף כוחה של הגנומיקה. Coleoptera (חיפושיות) הן קבוצת החרקים הגדולה ביותר ותופסות כמעט את כל סוגי בתי הגידול על פני כדור הארץ. בנוסף למתן מודלים אידיאליים למחקר בסיסי, למחקרים על חיפושיות יכולות להיות השפעות על הדברת מזיקים מכיוון שלעתים קרובות הן מזיקים של משקי בית, חקלאות ותעשיות מזון. מוצגים פרוטוקולים מפורטים לגידול ותחזוקה של מושבות מעבדה של D. maculatus ולביצוע הפרעות בתיווך dsRNA ב-D. maculatus. מתוארים הליכי RNAi עובריים והורים - כולל התקנת מכשירים, הכנה, הזרקה והתאוששות לאחר ההזרקה. כמו כן מוצגות שיטות לניתוח פנוטיפים עובריים, כולל כדאיות, פגמים בדפוס בזחלים שבקעו והכנת ציפורן לזחלים שלא בקעו. בדיקות אלה, יחד עם הכלאה באתרה וצביעה חיסונית לסמנים מולקולריים, הופכים את D. maculatus למערכת מודל נגישה למחקר בסיסי ויישומי. הם מספקים מידע שימושי לקביעת נהלים במערכות מודל חרקים מתפתחות אחרות.

המעבדה של המחברים השתמשה בטכנולוגית RNAi בחקר האבולוציה התפקודית של גני ויסות פילוח בחרקים 53,55. בעוד כל החרקים מפולחים, הגנים המסדירים את התהליך הזה נראה שיש לך התפצלו במהלך וקרינה חרקים 26,38,56-63. מסך גנטי תסיסנית זיהה קבוצה של תשעה גני פילוח זוג-כלל אחראים לקידום ההיווצרות של מגזרי גוף 64-70. כאן, ortholog של אחד הגנים האלה, לזווג (PRD), משמש לתעד את התועלת של RNAi לחקר תפקוד הגנים <...

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תפקוד הגנים ב-Dermestes maculatus, מערכת מודל חרקים חדשה, המייצגת את קבוצת החיפושיות המגוונת, ומקלה על חקר שאלות מחקר בסיסיות ויישומיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית, הביולוגיה האבולוציונית ועוד, על ידי כך שהיא מאפשרת לבחון את תפקוד הגנים בעוברים ובבוגרים של דרמסטס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בהפרעות RNA כדי למקד כל גן, על סמך מידע רצף בלבד, גם בהיעדר רצף גנום מלא.השיטות שהוצגו כאן לא רק מספקות גישה לחקר תפקוד הגנים בדרמסטס. ניתן ליישם אותם גם לפיתוח מערכות מודל חרקים חדשות, ואולי להדברת מזיקי חרקים. להכנת כלוב גידול ל- D.maculatus, מורחים תחילה שכבה דקה של שבבי עץ לכלוב חרקים בגודל בינוני.הכניסו קטע קלקר לכלוב כדי לאפשר לזחלים סביבה להתגלם. הוסף לכלוב עשרים עד חמישים חיפושיות בוגרות או זחלים מאוחרים. הניחו מזון רטוב לחתולים בצלחת פטרי או בסירת שקיל, כמקור מזון.מכסים את הכלוב בבד רשת ומכניסים אותו לחממה. לפני תחילת איסוף העוברים, בדוק תחילה את הכלוב היטב עבור כל העוברים הקיימים והסר אותם. לאחר שהכלוב פנוי, הניחו צמר גפן מתוח לתוך הכלוב ודגרו על המושבה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.לאחר חלון הזמן המתאים, אספו את כדור הצמר גפן, הוציאו את כל המבוגרים הנוכחים, והחזירו אותם לכלוב. מעל פיסת נייר בנייה שחורה, צבטו בעדינות את כדור הצמר גפן וקרעו אותו לאט לחוט דק, כך שכל הביצים הקיימות ייפלו על הנייר השחור. קח מכסה צלחת פטרי רגיל, והשתמש בפיסת נייר סינון שחור כדי לכסות את החלק הפנימי.הדביקו חתיכת סרט דו צדדי לאורך קצה שקופית מיקרוסקופ רגילה. הנח את שקופית המיקרוסקופ על נייר הסינון השחור במכסה צלחת הפטרי. לוקחים את הנייר המכיל את העוברים שנאספו, מקישים בעדינות כדי להעביר את העוברים למכסה צלחת הפטרי.בעזרת מכחול, יישר את העוברים על הסרט בניצב לשקופית, כשהקצה הקדמי או האחורי לכיוון הקצה. כדי להתחיל RNAi, קח תחילה 2-4 מיקרוליטר של dsRNA לקצה פיפטה של 20 מיקרו מעמיס. הכנס את הקצה לתוך נימי זכוכית שנמשכו מראש, המכונה המחט, והכניסו בעדינות את התמיסה לתוך המחט.תקן את המחט למחזיק נימי זכוכית ולאחר מכן הרכיב את מחזיק הנימים לתוך המיקרומניפולטור. לאחר מכן, העבירו בזהירות את השקופית עם עוברים המחוברים לשלב המיקרוסקופ המנתח. הזיזו את השקופית כדי להביא עובר אחד למרכז השדה ומקדו את המיקרוסקופ.תוך כדי הסתכלות לתוך טווח הניתוח, מקם את קצה הנימים עם המיקרומניפולטור. קרבו את הקצה לסוף העובר הראשון בשורה. הפעל את אספקת החנקן או האוויר, ולאחר מכן הגדר את מתג בורר כניסת הסולנואיד לוואקום.כוונן את ווסת לחץ הפליטה ל-10-15 psi, בהתאם למנגנון. פתח את הנימים, ותמיסת ה-dsRNA הצבעונית תמלא את הקצה, מוכן להזרקה. הזיזו את קצה הנימים קדימה, ונקבו בעדינות את העובר.בהגדרות לחץ אידיאליות, שום נוזל עוברי לא יזרום לנימים. צעד על מתג כף הרגל כדי להוציא dsRNA לתוך העובר, עד לחלוקת הכמות המתאימה. השאירו את הקצה בתוך העובר למשך כשתי שניות, ולאחר מכן הסירו אותו בזהירות.לאחר שכל העוברים הוזרקו, הניחו את השקופית בצלחת פטרי. הוסף כדור צמר גפן רטוב לתבשיל, הקפד לא לתת לו לבוא במגע עם המגלשה. מכסים את צלחת הפטרי ועוטפים אותה בניילון איטום.סמן אותו עם סוג ה-dsRNA, הריכוז, התאריך, השעה ומספר העוברים שהוזרקו. לבסוף, הכניסו את המנה לאינקובטור בחום של 30 מעלות צלזיוס עד שהעוברים בוקעים. כדי לבצע pRNAi, אסוף תחילה גלמים מהמושבה.מיין גלמים זכרים ונקבות לשני כלים נפרדים, ומניח אותם באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס. בדקו את הצלחות מדי יום לאיתור חיפושיות סגורות, והעבירו את הפרטים האלה לשתי צלחות פטרי נפרדות לזכרים ולנקבות בוגרים. האכילו את הבוגרים הללו ותחזקו את הצלחות כל יומיים, עד שמספיק בוגרים יסגרו כדי להתחיל בהזרקה.לאחר השלמת הבריכה הבוגרת, הרדימו חיפושית נקבה, והחזיקו את צד הגחון הבודד כלפי מעלה ביד אחת, והחזיקו את המזרק ביד השנייה. חודרים בעדינות לקרום הסגמקוריה בין סטרניטים 2 ו -3. בדוק את סולם המזרק והחלק לאט לאט כשני מיקרוליטר לנקבה.לאחר ההזרקה, החזק את המחט יציבה למשך 5 שניות לפחות ולאחר מכן משוך אותה בזהירות. העבירו נקבות מוזרקות לצלחת פטרי עם מזון לחתולים. סמן את המנה בהתאם.מניחים את המנה באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, העבירו את הנקבות שהוזרקו לכלוב מיני, והוסיפו מספר שווה של זכרים צעירים שלא הוזרקו. סמנו את הכלוב והוסיפו מזון לחתולים.הכניסו את הכלוב לאינקובטור של 30 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר הזדווגות. לאחר מכן ניתן לבחון את הצאצאים שנוצרו כדי לקבוע את ההשפעות של ה-pRNAi. תמונה זו מציגה צאצא של פרט pRNAi המוזרק עם DS GFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק כבקרה.כאן, כמו אצל פרטים מסוג בר, הצאצאים בקעו עם פס פיגמנטי אחד לכל מקטע. פסים פיגמנטיים שכנים הופרדו על ידי פער לא פיגמנטי. בעקבות pRNAi מזווג, צאצאים מושפעים בקעו עם פסים פיגמנטיים שכנים מאוחדים, מה שמעיד על גבולות סגמנטליים פגומים.חומרת הפנוטיפ הייתה משתנה, אך היתוך הופיע באופן עקבי באזורי גבול מסוימים, מה שמצביע על פגמים דמויי שלטון זוגי. באופן דומה, פנוטיפים של ציפורן של עוברים שלא בקעו לאחר נוקדאון זוגי הראו אובדן מקטעי בטן, כמו גם אורך גוף מקוצר. צביעה של עוברים מוקדמים עם נוגדן מוטבע לבחינת פגמים מולקולריים הראתה פסי ביטוי בעוצמה שווה בכל מקטע בקבוצת הביקורת.לעומת זאת, ביטוי מופחת זוהה בפסים חלופיים בצאצאים של נקבות שהוזרקו dsRNA מזווגות Dmac. דפוס זה של ביטוי מופחת עולה בקנה אחד עם דפוס הקוטיקולה הפגום שנצפה בזחלים שנבקעו. כאן, בפעם הראשונה, אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו להפלת גן מעניין, במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת ב-Dermestes maculatus, באמצעות הפרעות RNA.בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור להשתמש בעוברים או בנקבות בוגרות בשלב המתאים. לאחר השליטה, ניתן לבצע הזרקה של כ-100 עוברים או 10 נקבות בוגרות תוך חצי שעה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו צביעת עובר או PCR כמותי על מנת לענות על שאלות נוספות על מנגנוני ויסות גנים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים מושבת מעבדה של דרמסטס, ולבצע הפרעות RNA עובריות והוריות בחיפושית זו. נכון לעכשיו, רק מספר קטן של מודלים של חרקים זמינים למחקרים פונקציונליים. הטכניקות המוצגות כאן סוללות את הדרך לחוקרים להשתמש בדרמסטס כמערכת מודל, ומרחיבות את היקף החרקים הניתנים לניתוח גנטי מולקולרי.

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בפרוטוקול זה אנו משלבים RNAi בתיווך להשתקת גנים...

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שתי אסטרטגיות שבו זמנית לדכא שני גנים (מציאה גן כפולה) בדבורי דבש. לאחר מכן אנו מציגים כיצד להשתמש בסיומת תגובת חוטם (PER) assay כדי לחקור את ההשפעה של מציאה גן כפולה על תפיסה התעוררה אצל דבורת דבש.

מציאה RNAi בתיווך זוגית ג&#39;ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (<em&gt; אפיס mellifera</em&gt;)

בעוד dsRNA ההאכלה בג elegans הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את תפקוד גן, פרוטוקולים הנוכחיים למסכי האכלה בקנה מידה גדולה יביאו ליעילות מציאה משתנה. אנו מתארים פרוטוקול משופר לביצוע מסכי האכלת RNAi בקנה מידה גדולה, כי תוצאות במציאה יעילה ולשעתקו מאוד של ביטוי גנים.

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח, Tribolium castaneum

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

RNA interference (RNAi) הוא כלי בעל ערך רב לחשיפת תפקוד הגנים. עם זאת, היכולת למקד גנים באמצעות RNAi בשלבים טרום-בוגרים מוגבלת בווקטור המלריה האנושי העיקרי Anopheles gambiae. אנו מתארים פרוטוקול RNAi להפחתת תפקוד הגנים באמצעות הזרקה ישירה במהלך התפתחות הגולם.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפרעת רנ"א מתווכת אלקטרופורציה בחרקים מסדר אודונטה (שפיריות וסכרים) באמצעות הסכר הכחול זנב (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) ואתשפירית הרחפן pied (פסאודותמיס זונאטה: Libellulidae: אניסופטרה).

שיטת הפרעות RNA בתתיווך אלקטרופולציה באודונה

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

הפרוטוקול הנוכחי מתאר קווים מנחים שלב אחר שלב לטכניקות הפעולה של RNAi ב - P. americana.

יישומים של הפרעות RNA במקק אמריקאי

למד שיטות RNAi עוברי והורי בחיפושית Dermestes maculatus לחקר פונקציית גנים. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניתוח פנוטיפים עובריים ופיתוח מודלים חדשים לבקרת מזיקים.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

גלה סרטונים נוספים