זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות באופן אמין נוירונים דופמינרגיים חיים בתרביות מוח אמצעי באמצעות ביטוי eGFP מונע טירוזין הידרוקסלאז, קצירת תאים בודדים ויצירת ספריית ריצוף RNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי מחלת הפרקינסון וההתמכרות לסמים, מכיוון שהיא מאפשרת לבצע ביטוי גנים ובדיקות אלקטרופיזיולוגיות על נוירונים דופמינרגיים חיים מזוהים בתרבית. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מספקת אמצעי לזיהוי אמין של נוירונים דופמינרגיים חיים ולא קבועים בתרביות מזנספליות גחוניות ראשוניות.

החלק הראשון של ההליך תדגים שרלין קים, טכנאית ממעבדתו של הנרי לסטר. התחל בייצוב ראש של עובר עכבר עם מלקחיים המונחים היטב על החוטם, כך שמשטח הגב יהיה נגיש. בעזרת מלקחיים המוחזקים ביד השנייה צובטים את שכבת העור והגולגולת ממש לפני רכס המזנספלון ומקלפים לאחור את העור ואת הזנב לאורך קו האמצע.

הניחו את המלקחיים סביב הרכס עם קצה אחד בין קליפת המוח למזונספלון והשני מעל המוח הקטן. צבטו והסירו את כל המוח האמצעי. הניחו את המוח התיכון בצלחת פטרי עם HBSS קר תחת מיקרוסקופ מנתח.

תחת המיקרוסקופ המנתח, הפוך את מקטע המוח כך שהצד הגחוני יהיה נגיש כעת. כעת נראים ארבעה רבעים. הסר את כל קרומי המוח וכלי הדם על ידי אחיזה עדינה של קרומי המוח עם מלקחיים ומשיכה כלפי מעלה מהמוח.

לאחר מכן, הניחו מלקחיים אחד לתוך החדר בערך במרכז הקטע. לאחר מכן כדי להפריד את המוח האמצעי, בצע צביטה בגב, ולאחר מכן צבט מדיאלית מכל צד. קח את שני הרבעים התחתונים על ידי ביצוע חתכים רוחביים משני הצדדים.

האזור הטגמנטלי הגחוני והחומר השחור נמצאים בחלק התחתון הגחוני, שנראה צפוף. הנח את הרקמה המנותחת המכילה גם את ה-VTA וגם את ה-SNC ב-HBSS טרי באזור נפרד של צלחת הפטרי. לאחר ניתוח כל מקטעי המוח, השתמש במלקחיים ובאזמל מספר 11 כדי לרבע כל חלק במוח האמצעי לחתיכות בגודל שווה בערך.

לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה P1000 רחב קדח כדי להעביר את כל מקטעי המוח התיכון המרובעים, לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מתן אפשרות לרקמה להתייצב והסרת ה-HBSS יש להוסיף 500 מיקרוליטר של תמיסת פפאין. דגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה, השתמש בקצה P1000 רחב קדח כדי להעביר רק את מקטעי המוח התיכון לתוך תמיסת מיליליטר אחד של DNase I ולאפשר למקטעים להתיישב בתחתית הצינור. לאחר מכן, העבירו רק את מקטעי המוח התיכון לצינור של 15 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של תמיסת עצירת קור. החלף את השטיפה השנייה במיליליטר אחד של תמיסת עצירה טרייה ופיפטה למעלה ולמטה שבע פעמים עם קצה פיפטה P1000 כדי לשבש את התאים.

לאחר מכן הניחו את מתלה התא על ידי פיפטינג איטי של 200 מיקרוליטר של תמיסת BSA של 4% לתחתית הצינור. לאחר צנטריפוגה ב-280 x גרם למשך שש דקות, שאפו את הסופרנטנט עם P1000 והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום ציפוי. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר ולאחר מכן דלל את תרחיף התאים ל-1000 תאים למיקרוליטר עם מדיום ציפוי.

צלחת 120 מיקרוליטר של תרחיף התא על כלי תרבית מצופים פולי-D-ליזין, פולי-L-אורניתין ולמינין מיד לאחר שאיבת הלמינין, כדי להבטיח שהציפוי לא יתייבש ויוצר משטח לא אחיד. לאחר מכן, לאחר שעה של דגירה, הוסף בזהירות שלושה מיליליטר של מדיום תרבית לאזור לא זרוע בצלחת התרבות כדי למזער את שיבוש התאים. לאחר שלושה שבועות של תרבית, שטפו את צלחת התרבות עם שני מיליליטר PBS של Dulbecco ללא RNase.

הסר את ה-DPBS. לאחר מכן החלף במיליליטר אחד של DPBS טרי לקטיף. השתמש בערכת מסנני GFP ובמטרה 40X במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך כדי לזהות נוירונים חיוביים TH פלואורסצנטיים בתרבויות.

השתמש במיקרומניפולטור לפיפטה מעל סומת התא. לאחר מכן השתמש בצינורות פלסטיק המחוברים ליציאת הצד של מחזיק המיקרופיפטה כדי להפעיל יניקה עדינה על מנת לשאוב את הנוירון לתוך המיקרופיפטה מזכוכית. הסר מיד את המיקרופיפטה המכילה את התא מתמיסת הרחצה והנח את הקצה בתוך אוסף צינורות PCR של 0.2 מיליליטר המכיל מאגר תגובה.

שוברים את הקצה בצד הצינור ליד התחתית. לאחר מכן הנח מחט מזרק סטרילית בקוטר 21 בחלק האחורי של המיקוריפטה והפעל לחץ כדי להוציא את הנוזל שנותר מהקצה השבור של המיקרופיפטה. צנטריפוגה של צינור האיסוף למשך חמש שניות באמצעות מיקרו-צנטריפוגה שולחנית ולאחר מכן הקפיאו אותה בקרח יבש.

תוך כדי עבודה בארון ה-PCR עם ריאגנטים על קרח, או על בלוק צ'ילר, הכינו את תערובת המתח הראשונה בתוספת 10% נפח נוסף בטמפרטורת החדר. ומיקרוליטר אחד של שלושה פריימר ראשוני אחד ומיקרוליטר אחד של קוצי RNA מכומתים לדגימה. לאחר מכן דגרו את הדגימה בתרמוסייקלר למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הניחו את הדגימות ישירות על מתלה הקירור PCR.

לאחר מכן, הוסף 5.5 מיקרוליטר מתערובת המאסטר המוכנה לצינור התגובה במתלה קירור PCR וערבב על ידי פיפטינג בעדינות. לאחר צנטריפוגה של הצינור למשך חמש שניות, דגרו בתרמו-סייקלר המוגדר לפרמטרים המוצגים כעת על המסך. כדי לטהר את ה-cDNA של הגדיל הראשון, הוסף לדגימה 25 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים בטמפרטורת החדר המערבולת.

מערבבים על ידי פיפטינג של כל הנפח למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. לאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר למשך שמונה דקות כדי לאפשר ל-cDNA להיקשר לחרוזים. לאחר מכן הניחו את הדגימות והחרוזים המגנטיים על מכשיר ההפרדה המגנטית עד שהנוזל נראה צלול לחלוטין ולא נשארו חרוזים בסופרנטנט.

שאפו והשליכו את הסופרנטנט. סובב את הדגימה למשך חמש שניות כדי לאסוף את הנוזל מצד הצינור. הנח את הדגימות על מכשיר ההפרדה המגנטי למשך 30 שניות.

לאחר מכן הסר את כל הסופרנטנט שנותר עם מקטרת P10 כדי להשאיר רק את החרוזים עם DNA קשור. הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת המאסטר ds-cDNA PCR ולאחר מכן הפעל את תוכנית ה-PCR לסינתזה של הגדיל השני כדי להשיג את ה-cDNA הכפול. היסטוגרמה זו מציגה את מספר הגנים המקודדים לחלבון שזוהו בספריות ריצוף RNA דופמינרגי של תא בודד שנוצרו מתאים חיוביים TH-eGFP בשברים לכל קילו-בסיס של תעתיק למיליון קריאות ממופות.

6,000 עד 8,000 גנים חלבונים זוהו בספריות התאים הבודדים. לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע תוך ארבעה עד חמישה שבועות, כולל זמן להפקת התאים, לאפשר את הבשלת התאים בתרבית, קצירת התאים ושלבי יצירת הספרייה, ריצוף הספריות והניתוח הראשוני. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על סביבת עבודה נטולת RNAse עבור יצירת ספריית RNA וקצירת תאים, לשמור על טכניקות סטריליות באמצעות תרבית התא וליצור פיפטות בגודל מתאים לקצירת תאים בודדים.

אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש במכסה אדים, הימנעות ממגע עור ועיניים, התרחקות מחום ולהבות פתוחות ולבישת ביגוד מגן אישי מתאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ביטוי גנים וניתוח רשת גנים על מנת לענות על שאלות נוספות כגון כיצד טיפולים תרופתיים משפיעים על ביטוי חלבון בתאים דופמינרגיים.