פרוטוקול הניסוי לזיהוי כחוליות בדגימות נוזלים ומוצקים עם צ'יפ Microarray נוגדן

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את נוכחותם של זנים ציאנובקטריאליים מרובים בדגימות נוזליות ומוצקות באמצעות בדיקה חיסונית מיקרו-פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הסביבה, הניטור וניהול המים, כגון נוכחות רעלנים המייצרים חיידקים המייצרים פרוטוקסינים לפני שהפריחה נראית לעין בלתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר מספר זנים ציאנובקטריאליים ומספר דגימות בו זמנית בפרק זמן של שלוש או ארבע שעות, הן באתרן והן במעבדה.

לכן, שיטות אלה יכולות לספק תובנה לגבי המגוון הביולוגי. ניתן ליישם אותו גם בתחומים אחרים, כגון ניטור מתקנים חקלאיים, זיהוי חיים בסביבות מתח או חקר כוכבי לכת. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו לא יתקשו.

בגלל הפשטות בעיבוד הדגימה והפרשנות הקלה יותר של התוצאות. לאחר ייצור וטיהור נוגדנים על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף 100 מיקרוליטר של DMSO לבקבוקון מסחרי המכיל צבע לתיוג, מיליגרם אחד של חלבון. לאחר המסת הצבע, סמנו את הנוגדנים המטוהרים על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של הצבע ל-50 מיקרוליטר מכל תכשיר נוגדנים.

שמור על תגובות התיוג בטמפרטורת הסביבה תחת תסיסה מתמשכת על פלטפורמה רוטטת למשך שעה. לאחר טיהור הנוגדנים המסומנים על פי פרוטוקול הטקסט, טען אליקוט קטן לספקטרופוטומטר ומדוד את הספיגה ב-280 ו-650 ננומטר. חשב את יעילות עיצוב התוויות על-ידי ביצוע המלצות הספקים.

כדי ליצור CYANOCHIP, הכינו 30 מיקרוליטר מכל נוגדן מטוהר על ידי ערבוב מיליגרם אחד למיליליטר של נוגדן במאגר הדפסת חלבון 1X עם 01% נפח לנפח של Tween 20. הכן 30 מיקרוליטר מפתרונות ההדפסה הבאים כבקרות. מאגר הדפסת חלבון 1X עם 01% נפח לנפח של Tween 20.

כל חלבון A סרום קדם-חיסוני מטוהר במיליגרם אחד למיליליטר במאגר הדפסת חלבון 1X עם 01% Tween 20 ו-1 מילגרם למיליליטר של BSA ומאגר הדפסת חלבון 1X עם 01% Tween 20. הוסף 30 מיקרוליטר לבאר של פתרונות ההדפסה המוכנים למיקרו-פלטות האיכותיות של 384 בארות. לאחר הגדרת רובוט ההדפסה ומצעי השקופיות בהתאם לפרוטוקול הטקסט, אתר את כל הנוגדנים והפקדים על השקופיות בתבנית נקודה משולשת בקוטר נקודה של כ-180 עד 200 מיקרון.

לדגימה בסביבה, השתמש במזרק סטרילי כדי לאסוף בין 1 ל-100 מיליליטר נוזלים ולרכז את התאים על ידי העברת הדגימה דרך מסנן בגודל נקבוביות של שלושה מיקרון. במידת הצורך, אספו דגימות מוצקות מסלעים או קרקעות ושמרו אותן בצינורות סטריליים. ניתן לבחון דגימות במעבדת שדה קטנה.

הוסף מיליליטר אחד של מאגר דגירה כדי לשחזר את הביומסה שנאספה במסנן והשתמש במרית כדי לגרד את המסנן לתוך צינור של 15 מיליליטר. עם מעבד קולי כף יד, או על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים, זה מצטבר והופך את הדגימה להומוגניזציה. בנוסף, שקלו עד 0.5 גרם מהדגימה המוצקה בצינור נפרד של 10 מיליליטר והוסיפו עד שני מיליליטר של מאגר מיצוי.

טבלו בדיקת סוניקטור לתוך הצינור וסוניקט עם מעבד קולי כף יד או מכשיר אולטרסאונד אחר. תוך שמירה על הדגימה על קרח, בצע לפחות חמישה מחזורים של 30 שניות ב-30 קילו-הרץ, ועצור למשך 30 שניות בין סוניקציות. כדי להכין תמצית פילטר לבדיקה החיסונית, השתמש במזרק של 10 מיליליטר המחובר למחזיק מסנן ניילון בגודל 5 עד 20 מיקרון כדי לסנן את התמיסה לתוך צינור של 1.5 מיליליטר כדי להסיר חול, חימר וחומר גס אחר.

כאשר כתמי המיקרו-מערך פונים כלפי מטה, הניחו את השקופית על טיפה של 100 עד 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה ודגרו למשך שלוש עד חמש דקות. השתמש במלקחיים עם קצה פלסטיק, והימנע מאזורי המיקרו-מערך, הרם בזהירות את המגלשה. טבלו את המגלשה בתמיסת חסימה טרייה ודגרו על המגלשה בתסיסה קלה למשך 30 דקות.

לייבוש המגלשה, הניחו אותה בצנטריפוגה המותאמת לשקופיות מיקרוסקופ וסובבו אותה בקצרה. הגדר את השקופית בקלטת היברידיזציה של שלוש על שמונה בארות מיקרו-מערך בהתאם להוראות הספק. לחלופין, לאחר שינוי דפוס הדפסת הנוגדנים, הגדר קלטת בהתאמה אישית, כמו זו המוצגת כאן, או פשוט השתמש בשקופיות כיסוי להגדרה.

לאחר הרכבת שקופיות וקלטות, פיפטה עד 50 מיקרוליטר מכל תמצית דגימה או דילול שלה במאגר דגירה מיצוי לכל באר של הקסטה. לחלופין, טען דגימות למכשירי דגירה אחרים או פשוט השתמש בשקופיות כיסוי. כבקרה ריקה, פיפטה 50 מיקרוליטר של מאגר TBSTRR לשתי בארות נפרדות לפחות של הקסטה.

דגרו את הדגימות בטמפרטורת הסביבה למשך שעה אחת וערבבו על ידי פיפטינג כל 15 דקות, או דגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. כדי לשטוף את המיקרו-מערכים, הנח את הקסטה כלפי מטה והקש אותה בזהירות על נייר סופג נקי. לאחר מכן שטפו את הבארות על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של מאגר דגירה מיצוי לכל אחת מהן והסירו את המאגר על ידי הקשה על נייר סופג כמו קודם.

חזור על הכביסה שלוש פעמים נוספות. לכל באר יש להוסיף 50 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים הפלואורסצנטיים המכילה את 17 הנוגדנים האנטי-ציאנובקטריאליים. דגרו את הדגימות בטמפרטורת הסביבה למשך שעה או בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.

כדי לשטוף את המיקרו-מערכים, הנח בזהירות את הקסטה כלפי מטה והקש עליה בעדינות על נייר סופג נקי. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר דגירה מיצוי לפני הסרתו על ידי הקשה על מגבת נייר. חזור על הכביסה שלוש פעמים.

לאחר מכן פרק את הקסטה וטבל את השקופית בתמיסת PBS 0.1X לשטיפה מהירה. צנטריפוגה מהירה כמו קודם לייבוש המגלשה. בעזרת סורק פלורסנט, סרוק את השקופית לאיתור פלואורסצנטיות בשיא הפליטה המקסימלי לאיתור צבע פלואורסצנטי אדום רחוק.

צלם מספר תמונות של המיקרו-מערכים בפרמטרי סריקה שונים על ידי שינוי ערך ההגברה. לבסוף, טען את הרשת, כמת ולאחר מכן עבד ונתח את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. הבדיקה החיסונית CYANOCHIP multiplex שהודגמה בסרטון זה, שימשה לבדיקת זיהוי בו-זמני של מיני הציאנובקטריאליות הרלוונטיים ביותר של מים מתוקים כמפורט בטבלה זו.

דגימות מים שנאספו בחוף מאגר מים מתוקים, נותחו באמצעות בדיקת מיקרו-מערך. התגובות החיסוניות החיוביות העיקריות תואמות נוגדנים למיני מיקרוציסטיס ציאנובקטריה פלנקטוניים ולמיני לפטולינגביה בנטיים. אותות פלואורסצנטיים נמוכים יותר התקבלו עבור מיני nostocales aphanizomenon פלנקטוניים, מיני anabaena, microcystis flos-aquae ומיני rivularia בנתיים.

המיקרו-מערך אומת גם על ידי בדיקת מחצלת מיקרוביאלית יבשה באנטארקטיקה כדי לבדוק נוכחות של סמנים ציאנובקטריאליים. תגובות חיוביות בנוגדנים נוצרו לציאנובקטריה, למיני אנבאנה ולמיני לפטולינגביה. תגובות חיסוניות חיוביות נוספות זוהו עם נוגדנים לציאנובקטריות פלנקטוניות, כגון מיני מיקרוציסטיס, מיני אפניזומנון ומיני פלנקטוטריקס רובסנס.

לבסוף, האותות הללו התקבלו מנוגדנים למינים אחרים בקרקעית, כולל מיני tolypothrix ומיני anabaena. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש-ארבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי, למעט ייצור נוגדנים ופילוס. על ידי דגירה בו זמנית של הדגימה, ונוגדנים פלואורסצנטיים, ניתן לחסוך שעה אחת.

בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור להכין את תערובת הנוגדנים הפלואורסצנטיים עם הנוגדן שלה בדילול העבודה האופטימלי שלה. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מיקרוסקופיה אופטית או מיצוי DNA והגברת PCR ספציפית, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו ריכוז הקרקע או לאשר את סוג הזן שזוהה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום הניטור הסביבתי לחקור גופי מים, בתהליכי ביקולטורה, ניהול מים מתוקים או מחקרי אקולוגיה מיקרוביאלית, ללא קשר לסוג הדגימה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג נוגדנים עם פלואורסצנטיות, לתפעל מיקרו-מערכי נוגדנים, לבצע בדיקה חיסונית מרובה ולנתח ולפרש את תוצאות הבדיקה החיסונית של מיקרו-מערך. אל תשכח שעבודה עם אולטרסאונד עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת התקני הגנה על האוזניים או אמצעי טיפול ספציפיים אחרים בעת ביצוע הליכים אלה.