בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

פרוטוקול זה פורסם במקור על ידי ד"ר Gary Bunker ועמתו, והוא מאפשר גידול של נוירונים של ההיפוקמפוס מעובריים בצפיפות נמוכה ובדרגת טוהר גבוהה, על ידי השעיית הנוירונים מעל שכבת סינון גליאלית. תוצאה זו היא מהיתרון המרכזי של תוצאות ההיפוקמפוס שלנו, מכיוון שהיא מאפשרת לנוירונים לצמוח בצפיפויות נמוכות עם מעט תאי גליה מזוהמים. לפיכך, תוצאה זו היא אידיאלית עבור דימות ברזולוציה גבוהה ובדיקות תפקודיות של נוירונים בוגרים בתרבית.

שלב הבשלת העודף של פרוטוקול זה נועד להאיץ את ההסתגלות של המבצעים החדשים, כיוון שישנם מספר מצבים מרכזיים במהלך ההליך שקשה לתאר במילים, ולכן הוא מלווה אתכם צעד אחר צעד. פרוטוקול זה מורכב משלושה אוכלוסיות עצמאיות הנדרשות לתרבית של נוירונים ראשוניים באיכות גבוהה. תהליכים אלו כוללים תרבית תאי גליה, יצירה וציפוי של למיקיס (cover slips), והכנת תאי עצב מההיפוקמפוס.

כדי להתחיל, יש להשיג רקמה קורטיקלית של חולדה בשלב מוקדם לאחר הלידה, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. למרות שאינם מוצגים כאן באופן ישיר, שימו לב ששלבי ההפרדה המוצגים בהמשך פרוטוקול זה כמעט זהים לאלו המשמשים להפרדה קורטיקלית. מהסיבה זו, שלבים רלוונטיים יודגשו במהלך הליך הפרדת ההיפוקמפוס שיוצג בהמשך סרטון זה.

החל משלב שש של הפרוטוקול הכתוב, הסירו את ה-HBSS מרקמת הקורטקס שנאספה, ולאחר מכן קצצו את הרקמה כמה שניתן באמצעות מספריים. הוסיפו מספיק HBSS לרקמה הקצוצה כדי להעביר את חלקי הרקמה לשפופרת קונית של 50 מיליליטר, ולאחר מכן השלימו את הנפח הכולל ל-12 מיליליטר על ידי הוספת HBSS. הוסיפו 1.5 מיליליטר של trypsin בריכוז 2.5%, ו-1.5 מיליליטר של תמיסת DNA בריכוז 10 מיליגרם למיליליטר, הפכו את השפופרת לערבוב, ולאחר מכן הדגירו את התערובת שהתקבלה במקלח מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות.

העבירו את הרקמה תהליך של טריטורציה (Trituration) 10 עד 15 פעמים באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית, ולאחר מכן דגרו אותה באמבט המים למשך שלוש דקות נוספות. ודאו שכל חלקי הרקמה שקעו לתחתית המבחנה, ואז סננו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 5 מיליליטר של BGS. הוסיפו 13.5 מיליליטר של HBSS ו-1.5 מיליליטר של 2.5% trypsin למבחנה המכילה את שאריות הרקמה שלא עברה עיכול, הפכו את המבחנה כדי לערבב, ולאחר מכן דגרו אותה באמבט המים למשך 10 דקות נוספות.

לאחר הדגירה, יש למעוך את הרקמה שנותרה 10 עד 15 פעמים, ולאחר מכן לסנן אותה אל תוך הפ an-tube המכיל את התסנן הראשוני. לאחר מכן, יש לשטוף את המסנן על ידי העברה של 3 מיליליטרים נוספים של BGS דרכו. בשלב זה, ניתן לחלק את התסנן למספר מבחנות כדי להקל הן על האיזון והן על תליית התאים מהמשקע מחדש.

סובב את התרחיפים בצנטריפוגה למשך שש דקות ב-130 G. לאחר הצנטריפוגה, שים לב שחלקו התחתון של המשקע נראה אדמדם מעט, בשל נוכחות של רכיבי דם. הסר את העל-משקעים, ולאחר מכן הוסף 1 מיליליטר של מצע גליאלי (glial medium) לכל מבחנה, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע. העבר את חלקי המשקע שאינם בעלי מראה אדמדם למבחנה קונית נקייה בנפח של 50 מיליליטר.

הוסיפו עד 2 מיליליטר של מצע גליאלי לכל גוריל (pup) כדי להשעות מחדש את הרקמה המשולבת, והעבירו כל 2 מיליליטר מהתשעיה ל-18 מיליליטר של מצע גליאלי שחומם מראש בבקבוק תרבית של 75 סנטימטר רבוע. הדגרירו את הבקבוק באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. ביום שאחרי זריעת התאים, החליפו את המצע בכל בקבוק במצע גליאלי טרי.

שימו לב כי בשלב זה, התרבית תהיה תערובת של אסטרוציטים וסוגי תאים אחרים שאינם תאי המטרה. כדי להסיר סוגי תאים שאינם אסטרוציטים, יש לנער את הבקבוקים בעוצמה כארבעה ימים לאחר הזריעה. לצורך כך, שטפו את הבקבוקים ב-HBSS, לאחר מכן הוסיפו 10 milliliters של HBSS טרי לכל בקבוק ונערו כל אחד מהם בעוצמה 5 עד 10 פעמים.

שאבו את ה-HBSS, ושטפו פעמיים נוספות עם HBSS. לאחר מכן, הוסיפו 20 milliliters של מצע גליאלי (glial medium), והחזירו את הבקירות לאינקובטור כפי שנעשה קודם לכן. שימו לב כי למרות שהתהליך הוא נמרץ, האסטרוציטים הרצויים לתרבית יישארו דבוקים בחוזקה לפני השטח של הבקורה.

כדי לתחזק את תרביות האסטרוציטים, יש להחליף את המצע למצע גליאלי טרי פעמיים בשבוע עד להגעתן לשלב של התמזגות (confluence). לאחר ההתמזגות, ניתן להקפיא את התאים לשימוש עתידי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. יש לזרע את הגליות בצלחונות לפחות 14 ימים לפני תחילת תרבית הנוירונים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

טבול את לבישובים (cover slips) בחומצה חנקית רכזה ובצע סוניקציה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. היזהר, שכן חומצה חנקית רכזת היא קורוזיבית ביותר. ציין גם כי מעבדות מסוימות מעדיפות להשרות את הלבישובים בחומצה חנקית למשך לילה באמצעות מתקני צביעה קרמיים.

יש להשליך בזהירות את חומצה החנקתית בתוך מapay כימיים בהתאם להנחיות המוסדיות, ולאחר מכן לשטוף את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים במים דה-יוניים. השקיעו את כיסויי הזכוכית במים, והעבירו אותם שוב לסוניקציה למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסירו את המים ושטפו את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים נוספות.

טבול את כיסויות הזכוכית ב-50 milliliters של מים, ולאחר מכן עקר אותן באוטוקלאב. תחת מ पॉपुलर-פלאו (laminar flow hood) סטרילי, הסר את המים והוסף 20 עד 30 milliliters של אתנול לשטיפה. הוסף 20 עד 30 milliliters נוספים של אתנול, ולאחר מכן העבר את כיסויות הזכוכית ואת האתנול לצחנת פטרי בנפח 100 millimeter.

בעזרת פינצטה קהה, העבירו את כיסויי הזריקה לצלוחיות פטרי בנפח 60 מיליליטר, ארבעה עד חמישה לכל צלוחית, ולאחר מכן הניחו להם להתייבש באוויר על ידי השענת הכיסויים לדופן הצלוחית. לאחר התאיידות האתנול, החזירו את כיסויי הזריקה למצב אופקי. המסו 10 גרם פאראפין בבקבוק זכוכית עמיד לחום, ושמרו אותו בטמפרטורה של כ-150 עד 200 מעלות צלזיוס.

ייתכן שיהיה צורך בכיול של הטמפרטורה האידיאלית, שכן טמפרטורות שגויות עלולות להוביל לקושי ביצירת "רגלי" פאראפין בגודל הנכון. טבלו פיפט פסטור (Pasteur pipette) בתוך הפאראפין, ולאחר מכן הקישו אותו במהירות בשלוש נקודות סביב השוליים של כל זכוכית כיסוי. טיפות הפאראפין יתגבשו לכדורים בגובה של כ-3 עד 5 מילימטרים ובקוטר של 1 עד 2 מילימטרים, אשר ישמשו ליצירת מרווח בין הנוירונים שעל זכוכית הכיסוי לבין השכבה הגליאלית הבודדת (glial-mono layer) שמתחתיהם.

השיגו צלחים המכילים זכוכיות כיסוי שהוכנו מראש עם רגלי פאראפין. הוסיפו 200 µL של poly-l-lysine ובופר בוראט למשטח של כל זכוכית כיסוי, והשאירו את התמיסה על זכוכיות הכיסוי למשך הלילה, תחת כיסוי ובטמפרטורת החדר. המשטח שיש לציפוי הוא אותו משטח שבו ממוקמים פיתוחי הפאראפין.

אם הניקוי בוצע כהלכה, ה-poly-l-lysine אמור להתפשט בקלות ולכסות את פני השטח של כיסוי הזריקה. למחרת בבוקר, שטפו את כיסויי הזריקה פעמיים על ידי השריה במים סטריליים למשך שעתיים בכל פעם. לאחר השטיפה האחרונה, החליפו את המים ב-4 milliliters של מצע זריעה לכל צלחון.

שימו לב כי חשוב להקפיד שפני השטח של זכוכית הכיסוי לא יתייבשו לאחר הציפוי ב-poly-l-lysine. הניחו את צלוחיות זכוכית הכיסוי באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. יש להדגיר את זכוכית הכיסוי המצופה למשך 24 שעות לפחות לפני תחילת תרבית הנוירונים.

השג חולדה עגורה ביום 18 או 19 להריון, ובצע המתת חסד בשיטה מאושרת. רסס את חלקו התחתון של גוף החולדה ב-70% ethanol, ולאחר מכן בצע חתך בקו האמצע מאזור הפוביס ועד לקץ חלל הבטן. כדי למנוע זיהום, הקפד לחתוך רק את העור בשלב זה.

עקרו את מכשירי הניתוח באמצעות 70% ethanol, ולאחר מכן חתכו את דופן הבטן כדי לחשוף את הרחם. הסירו את שתי קרני הרחם והניחו אותן בצלחת סטרילית. תחת מ(('flow hood)) למינרי סטרילי, הסירו את קרומי הרחם העוטפים את העוברים, לאחר מכן בצעו דקפיטציה (ניתוק ראשים) והניחו את הראשים בצלחת פטרית של 100 millimeter המכילה 20 milliliters של HBSS.

הוצאו את המוחות באמצעות דיסקציה, והניחו אותם מיד בצלחת פטרי של 60 מילימטר המכילה 2 מיליליטר של HBSS על קרח. אספו רק שני עד שלושה מוחות לכל צלחת כדי לאפשר מרחב מספיק לשלב הבא. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסירו את הקרומים (meninges) מקו האמצע של חצאי המוח.

בשלב הבא, הוציאו את ההיפוקמפוסים (hippocampi) באמצעות דיסקציה. שימו לב שניתן לזהות את ההיפוקמפוס כמבנה בצורת חילון במשטח המדיאלי של ההמיספרה הקורטיקלית, וקל להסירו מכיוון שהוא גובל לטרלית בצדו הלטרלי. לאחר השחרור, העבירו את ההיפוקמפוסים לצלחית פטרי בנפח 60 מילימטר המכילה 4.5 מיליליטר של HBSS ושמרו על קרח.

שימו לב כי השלבים שבוצעו עד כה תקפים גם עבור הדיסקציה של הקורטקס, למעט בכך ששומרים את הקורטקסים במקום את ההיפוקמפוסים. עבור הדיסקציה של הקורטקס, השלב הבא יהיה להפריד את הקורטקס משאר המוח, כפי שמוצג כאן, ולאחר מכן לאסוף את הקורטקסים לתוך HBSS כפי שהוצג קודם לכן. ברגע שכל רקמת ההיפוקמפוס נאספה לתוך HBSS, העבירו אותה למבחנה קונית של 15 milliliter.

הוסיפו 5 milliliters של 2.5% trypsin, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. הסירו בעדינות את תמיסת ה-trypsin באמצעות פיפט פסטור, תוך שמירה על רקמת ההיפוקמפוס ללא הפרעה בתחתית המבחנה. שטפו את הרקמה פעמיים על ידי הוספה עדינה של 5 milliliters של HBSS, דגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות, והסרה חוזרת של הנוזל באמצעות פיפט פסטור, תוך הקפדה לא להפריע לרקמה בתחתית.

בזמן ההמתנה לשלב הדגירה שהודגם קודם לכן, הכינו שני סוגים של פיפטות שעברו ליטוש בלהבה לצורך דיסוציאציית רקמה. לשם כך, חשפו לזמן קצר את קצה פיפטת פסטור מזכוכית ללהבה, ולאחר מכן בחנו את קצה הפיפטה. עבור הסוג הראשון, חזרו על שלב זה עד שקצוותיה של פיפטת הקצה יחלקו, אך הקוטר יישאר ללא שינוי.

בפעם השנייה, חזור על הפעולה עד שהקצוות יחלקו וקוטר הקצה יצטמצם בכשירות מחצית. חשוב לתרגל כדי למצוא את הקוטר האידיאלי, כדי להבטיח שהרקמה תעבור דיסוסיאציה לתאים בודדים מבלי לפגוע בתאים בתהליך. לאחר השטיפה השנייה, השלם את הנפח הכולל ל-5 milliliters על ידי הוספת נפח מספיק של HBSS לרקמה.

יש לבצע טריטורציה לרקמת ההיפוקמפוס תחילה על ידי כ-10 מעברים דרך פיפטה רגילה בעלת קצוות חלקים, ולאחר מכן חמישה עד 10 מעברים נוספים דרך פיפטה בעלת קוטר קצה מצומצם. המטרה היא לקבל תמיסה הומוגנית של תאים ללא גושי רקמה, או עם מעט מאוד גושים. קבעו את צפיפות התאים באמצעות המוציטומטר.

התנובות האופייניות הן כ-800,000 עד מיליון תאים לכל גוריל. העבירו נפח מספיק של תרחיף התאים לצלוחיות המכילות כיסויי זכוכית מצופים ב-poly-l-lysine ב-4 milliliters של מצע זריעה, כדי להשיג צפיפות זריעה של בין 100,000 ל-500,000 תאים לצלוחית של 60 millimeter, בהתאם לניסוי המתוכנן. הניחו את הצלוחיות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5%CO2.

לאחר שלוש עד ארבע שעות, העבירו את לוחות הזכוכית (cover slips) שעליהם צומחים הנוירונים לצלחונות המכילים תאי גליה ומדיום NBG. יש לבצע זאת כך שהצד שבו נזרעו הנוירונים פונה כלפי מטה לעבר שכבת תאי הגליה. הוסיפו סך כולל של ארבעה או חמישה לוחות זכוכית לכל צלחון גליה.

יומיים או שלושה ימים לאחר הזריעה, יש להוסיף את תמיסת ה-aerocele לריכוז סופי של 5 µM לכל צלחת כדי לעצור את צמיחת התאי הגליאלים. יש להזין את התאים פעם בשבוע על ידי החלפת 2 mL מהמצע הישן ב-2.5 mL של מצע טרי בכל הזנה. המצע הנוסף שמוסיפים נועד לפצות על אידוי לאורך זמן.

ורק חלק מהתווך מוחלף כדי להבטיח התניה עקבית של התווך על ידי תאי הגליאה. תרביות אלו נשארות בדרך כלל בריאות למשך חודש אחד לפחות. נוירונים קובעו ב-4% paraformaldehyde, ולאחר מכן הוכנסו לדגירה עם נוגדנים ראשוניים לצורך דימוי פלואורסצנטי.

כפי שנראה בצביעות האימונו-היסטוכימיות של Tau ו-MAP2, נוירונים אלו מפתחים ענפות נרחבת עם אקסונים ודנדריטים מפותחים היטב. נוירונים בוגרים מפתחים גם קוצי סינפסה, כפי שזוהו על ידי לוקליזציה סלקטיבית של Drebrin One, אשר ממוקמים סמוך להתמחותים פרה-סינפטיים, כפי שזוהו בצביעת סינפסה. נוירונים ראשוניים אלו מתאימים מאוד למחקרים פונקציונליים ומבניים של נוירונים וסינפסות, לרבות מחקרים על העברת אותות, קוטביות נוירונלית, תעתוע תת-תאי, והתפתחות ופלסטיות של סינפסות, בין היתר.

סרטון זה אמור לסייע בהבנה ובביצוע מדויק של מספר שלבים מרכזיים בפרוטוקול זה. הקפדה נאותה על השיטה המתוארת צריכה להוביל לתרבית נוירונים בריאה בעלת צפיפות גבוהה, עם ענפות נרחבת וסינפסות מפותחות היטב מבחינה מורפולוגית ותפקודית.