עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף
5 במרץ 2017
לגנים רבים בעלי חשיבות התפתחותית יש דפוסי ביטוי ספציפיים לתאים או לרקמות. מאמר זה מתאר ניסויי LM RNA-seq לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בגבול להב-נדן עלי התירס ובמוטציות lg1-R בהשוואה לסוג בר. השיקולים הניסיוניים שנדונו כאן חלים על ניתוחים טרנסקריפטומיים של תופעות התפתחותיות אחרות.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לכמת הצטברות תעתיק בתאים ספציפיים או בתחומים סלולריים כך שניתן יהיה לבצע השוואות בין תחומים שונים או בין תחומים שווים בדגימות מוטנטיות ופראיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית כגון כיצד מוגדרים תחומי איברים או כיצד מוטציות ספציפיות משפיעות על ביטוי גנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לכמת את הצטברות התעתיק בתחומים זעירים ומוגדרים במדויק שהם קטנים מכדי לנתח אותם ביד.
לפני תחילת הליך זה, גדל דירות של שתילי תירס בתנאים סטנדרטיים עד גיל שבועיים. כדי לנתח קודקודי יורה לקטעים רוחביים, תחילה כרתו שתיל ממש מתחת לקו האדמה. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח כדי להסיר פרוסות דקות מבסיס הגבעול עד שנראה אליפסה של רוגע מוקפת עלה בוגר אחד או שניים.
בצע חתך נוסף כ -10 מילימטרים מעל הבסיס. קטע זה של 10 מילימטר מכיל את המריסטם האפיקלי של היורה בפרימורדיה עלים צעירים. סובב את קטע ה-10 מילימטר כך שהבסיס פונה כלפי מעלה.
בצע שני חתכים במקביל לציר הרוחבי כדי לקבל שקופית של רקמה בעובי של שניים עד שלושה מילימטרים. השליכו את שני החלקים החיצוניים ושמרו על הפרוסה המרכזית לקיבוע ולהטמעה. טבלו את פרוסת הרקמה בכ -10 מיליליטר של חקלאים מקבעים בבקבוקון זכוכית על קרח.
לאחר ניתוח כל הדגימות, יש למרוח ואקום כדי להסיר בועות אוויר ולסייע בחדירת הקיבוע. החזק את הוואקום למשך 10 דקות, ולאחר מכן שחרר לאט את הוואקום. החלף את הקיבוע, ודגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה בניעור עדין.
למחרת, המשך לעבד את הרקמות להטמעה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי ליצוק גושי פרפין, הנח תבניות הטבעה על פלטה חמה של תחנת הטמעת הרקמות, והשתמש במלקחיים כדי להעביר את דגימות הרקמה לתבניות ההטבעה כשהמשטח החתוך פונה כלפי מטה. הנח את טבעת ההטבעה בחלק העליון של התבנית.
מלאו כל תבנית בפרפין מומס. מעבירים את התבניות לצלחת קרה עד שהפרפין מתמצק. אחסן את גושי הפרפין בכלי אטום עם סיליקה ג'ל בארבע מעלות צלזיוס.
קטעים נחתכים מגושי פרפין על מיקרוטום בהתאם לנהלים סטנדרטיים, וקטעים חציוניים הכוללים את המריסטם האפיקלי של היורה נבחרים להרכבה. כדי להרכיב את החלקים על שקופיות, הנח שקופיות נטולות RNase או אפויות על מחמם שקופיות של 42 מעלות צלזיוס. מרחו מספר טיפות של תמיסת אתנול 50% כדי לכסות כל שקופית.
הניחו בעדינות חלקים על השקף, וצפו את החלקים על תמיסת האתנול עד שהם מתרחבים. לאחר מכן, הטה את השקופית והסר עודפי תמיסת אתנול על ידי שאיפה עם פיפט העברה חד פעמי. השתמש במגבונים נטולי מוך כדי לנדף כל תמיסת אתנול נוספת.
יבש את המגלשות בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות או למשך הלילה. כאשר השקופיות יבשות, יש לאחסן אותן בכלי אטום עם סיליקה ג'ל בארבע מעלות צלזיוס. הסר את השקופיות ביום המיקרו-דיסקציה.
הכינו שלוש צנצנות קופלין מזכוכית, שתי צנצנות המכילות כ-50 מיליליטר 100% קסילנים וצנצנת אחת המכילה כ-50 מיליליטר 100% אתנול. טבלו את השקופיות בקסילנים אחד למשך שתי דקות, קסילנים שניים למשך שתי דקות ו-100% אתנול למשך דקה אחת. מסננים את השקופיות על מגבונים נטולי מוך ומייבשים אותם באוויר בטמפרטורת החדר.
כדי להתחיל בהליך זה, אבטח את השקופיות על הבמה של מיקרוסקופ המיקרודיסקציה בלייזר. גורם קריטי להצלחת מיקרו-דיסקציה בלייזר בניסויי RNasic הוא השימוש בסמנים מורפולוגיים ומולקולריים לבחירת תחומים מדויקים למיקרודיסקציה. בחן את השקופיות באמצעות מטרה של פי 5 וזהה את חמשת החלקים החציוניים ביותר בכל שקופית באמצעות קודקוד המריסטם האפיקלי של היורה כנקודת הייחוס המרכזית.
לאחר מכן, השתמש במטרה של 10X או 20X כדי לזהות את מיקום הליגולה על פרימורדיום שבעת העלים של הפלסטוכרון של כל קטע. הליגולה תהיה גלויה כבליטה הבולטת מהמשטח האדקסיאלי של פרימורדיום העלה. השתמש בכלי הציור של תוכנת המיקרו-דיסקציה בלייזר כדי לסמן מיקום זה.
בחר את סמל הציור ביד חופשית, הזז את הסמן למיקום המתאים ולחץ וגרור את העכבר כדי לצייר. השלב הבא הוא להשתמש בסרגל ובכלי הציור המלבני כדי למדוד מלבנים בגובה 100 מיקרומטר שבמרכזם ליגול של כל קטע כדגימות הליגולה. כדי להשתמש בכלי הסרגל, בחר בסמל הסרגל, הזז את הסמן לקצה אחד של האזור למדידה, ולאחר מכן לחץ וגרור למדידת האזור.
אורך הסרגל יוצג על המסך. השתמשו בכלי הסרגל כדי למדוד מקטע של 100 מיקרומטר שבמרכזו ליגולה. כדי לצייר מלבן, בחר בכלי ציור קו ישר וצייר ארבעה קווים ישרים.
באותו אופן, מדוד מלבנים של 100 מיקרומטר הממוקמים 50 מיקרומטר מעל ומתחת למלבן הליגולה. אלה יהיו דגימות הלהב והנדן. נתח את המלבנים הנמדדים באמצעות פונקציית חיתוך הלייזר כדי לחתוך את קטע הרקמה לאורך קווי המתאר של התחום הנבחר, ואת פונקציית הקטפולטה כדי להניע את מלבן הרקמה מהמגלשה למכסה הצינור.
אסוף דגימות ליגולה, להב ונדן בצינורות נפרדים. השתמש באותו הליך כדי לנתח דגימות אפידרמיס אדאקסיאליות של להב, ליגול ונדן מפרימורדיה של פלסטוכרון שבעה עלים. לבסוף, החל מאגר מיצוי RNA על הרקמה המיקרו-מנותחת והמשך במיצוי RNA, הגברת RNA, בניית ספרייה, ריצוף וניתוח ביואינפורמטיקה כמתואר בכתב היד.
כאשר נותחה הצטברות התעתיק וכל שכבות התאים של אזורי הלהב, הליגול והנדן, נמצאו 2,359 גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. באזורי להב האפידרמיס האדקסיאלי, הליגול והמעטפת, נמצאו 3,128 גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. מיקרו-דיסקציה בלייזר, RLM, ריצוף RNA וניתוחי הכלאה באתרם נתנו תוצאות עקביות כפי שמומחשות על ידי גנים מייצגים אלה.
הקריקטורות משמאל ממחישות LM של כל שכבות התאים, והקריקטורות מימין ממחישות LM של אפידרמיס אדקסיאלי בלבד. ראשי החצים בתמונות מצביעים על ליגולים מתהווים. הצטברות תעתיק אחד הייתה גבוהה משמעותית בליגולה הן בכל שכבות התאים והן ב-LM האפידרמיס.מעטפת צרה אחת הייתה מווסתת באופן משמעותי באזור הליגולה הן בכל שכבות התאים LM והן באפידרמיס האדקסיאלי LM, ומצטברת במיוחד בקצה הליגולה המתהווה.
לגן בעל תפקוד לא ידוע הייתה ספירה חוזרת ממוצעת גבוהה יותר ב-LM האפידרמיס של הליגולה מאשר בכל השכבות LM. תעתיק זה מצטבר בצורה החזקה ביותר בתאי האפידרמיס. הגן הרביעי, Zm PIN1a לא התבטא באופן דיפרנציאלי באופן משמעותי בניתוח כל שכבות התאים, אך היה מווסת משמעותית בליגול בניתוח האפידרמיס בלבד. הביטוי הגבוה שלו ברקמת כלי הדם עשוי לבלבל את ההבדלים בהצטברות התעתיק באפידרמיס כאשר כל שכבות התאים נאספו.
כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור שבחירת התחומים התאיים לניתוח מיקרו והשוואה, והדיוק של המיקרו-דיסקציות הם קריטיים להצלחת הניסויים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בכימות הצטברות תמלילים (transcripts) בדומיינים תאיים ספציפיים בתירס. הוא מדגיש את החשיבות של הבנת ההבדלים בביטוי גנים בגבול שבין הלהב לנשוף העלה ובמוטנסי lg1-R בהשוואה לסוג הפרא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה התפתחותית
- ביטוי גנים
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- גנים החשובים להתפתחות מראים דפוסי ביטוי ספציפיים לתאים או לרקמות.
- הבנת דפוסים אלה חיונית להשגת תובנות לגבי הגדרת תחומי האיברים.
- מוטציות עשויות להשפיע באופן משמעותי על ביטוי גנים, ובכך להשפיע על תהליכי התפתחות.
- ניתן לכמת הצטברות של תמלילים בתחומים קטנים ומוגדרים.
מטרת המחקר
- לזיהוי גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי בגבול שבין להב העלה לנרתיק בתירס.
- להשוואת ביטוי גנים במוטנטים של lg1-R מול דגימות של סוג בר.
- לספק שיטה לניתוח נתונים טרנסקריפטומיים בביולוגיה התפתחותית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניסויי LM RNA-seq לניתוח ביטוי גנים.
- ה disection של קודקודי נבטי תירס עבור חיתוך רוחבי.
- תנאי גידול סטנדרטיים לנבטי תירס לפני הניסוי.
- כימות הצטברות של transkriptים בתחומים תאיים ספציפיים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי גנים בעלי דפוסי ביטוי דיפרנציאליים בגבול שבין לובד העלה לנשוף.
- השוואת ביטוי גנים במוטציות lg1-R לעומת דגימות מסוג בר (wild-type).
- הדגמת יעילות השיטה בניתוח של מתחמים תאיים קטנים.
- תובנות לגבי האופן שבו מוטציות ספציפיות משפיעות על ביטוי גנים במהלך הפיתוח.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה בעלת ערך לניתוח טרנסקריפטומי בביולוגיה התפתחותית.
- הבנת דפוסי ביטוי גנים יכולה להוות מידע על התפתחות איברים והשפעות של מוטציות.
- ניתן להחיל גישה זו על תופעות התפתחותיות אחרות מעבר לתירס.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ריצוף RNA באמצעות מיקרו-דיסקציה בלייזר (Laser Microdissection RNA-Seq) מאפשר כימות מדויק של הצטברות תמלילי RNA בתחומים מוגדרים של רקמות צמחים, ובכך פותר את האתגר של ביטוי גנים מוגבל מרחבית, אשר לרוב מוסתר בניתוחים של איברים שלמים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי באימות מטרות על ידי בידוד ההקשר הביולוגי של ויסות גנים, ותומכת בקבלת החלטות מותאמות סיכונים בשלבי הגילוי המוקדמים ובמסלולי גנומיקה פונקציונלית. בחירה מדויקת של התחומים ונאמנות המיקרו-דיסקציה הן קריטיות ליצירת נתונים טרנסקריפטומיים הדירים ובעלי ערך יישומי, המנחים את תעדוף הפורטפוליו ואת הפחתת הסיכונים המכניסטית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד גנים בתחומים התפתחותיים ספציפיים, ובכך מבהיר את תפקידי המסלולים.
- תומך בהסרת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד השפעותיהן של מוטציות או הפרעות על ביטוי גנים.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירת מטרות על ידי חשיפת ביטוי דיפרנציאלי מוגבל מרחבית.
- מקל על תיעוד וסינון תיקי הפרויקטים על ידי הבחנה בין פעילות גנים תלוית-הקשר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין דומיינים מאומתים של רקמה עבור תהליכי עבודה טרנסקריפטומיים המשכיים.
- מבצע סטנדרטיזציה של בחירת הדגימות באמצעות נקודות ציון מורפולוגיות ומולקולריות להבטחת השחזוריות.
- מפיק פלטים כמותיים של ביטוי גנים המתאימים לניתוח השוואתי.
- מאפשר הערכה מהימנה של גנים מועמדים או מסלולים בהקשרים ביולוגיים מוגדרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים טרנסקריפטומיים לסמנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה או להתפתחות, במידת הצורך.
- תומכת ברצף מהשלב של הגילוי ועד לאימות פרה-קליני על ידי אפשור ניתוחים מדויקים עבור תחומים ספציפיים.
- מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת ההקשר המרחבי של הבקרת גנים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמת ועד לזיהוי מובילים (leads), ובכך היא תומכת הן בתיקוף מטרות והן במחקרי מנגנונים בצמחים וייתכן שגם במערכות מודל אחרות.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת השערות והבהרת מסלולים באמצעות כימות תמלילים בדומיינים מוגדרים.
- סינון (Screening): מספקת נתונים כמותיים ושחזירים של ביטוי גנים לצורך פיתוח בדיקות ומוכנות לסינון.
- אנליטיקה: מספקת מדידות של ביטוי דיפרנציאלי המאפשרות השוואה חסונה בין תנאים או גנוטיפים.
- מחקר תרגומי: תומכת בסנכרון ביומרקרים ובהמשכיות פרה-קלינית כאשר ביטוי גנים מרחבי הוא רלוונטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית במודלים מגוונים של התפתחות או מחלה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליכי תיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של ניתוחים טרנסקריפטומיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרת ההקשר הביולוגי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף וקידום של מטרות בהתאם לסיכון, בהתבסס על נתוני ביטוי גנים מרחביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, מיקרודיסקציה וניתוח טרנסקריפטומי.
- דורש גישה לציוד מיקרודיסקציה בלייזר ולתשתית RNA-seq.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאיות בין צוותים לבחירת דגימות והגדרת תחומים.
- עשוי לדרוש התאמה לסוגי רקמות שונים או לשלבים התפתחותיים שונים.
- דיוק בבחירת התחום ובמיקרודיסקציה הוא קריטי לאיכות הנתונים וליכולת הפרשנות שלהם.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Tissue Fixation and Processing
3:03
Sectioning and Slide Preparation
4:57
Microdissection of Blade, Ligule, and Sheath Samples from Plastochron 7 Leaf Primordia
7:48
Results: Laser Microdissection RNA Sequencing Identifies Differentially Expressed Genes in Maize Leaf
9:38
Conclusion
