בדיקת היכולת פולשנית דם של תאים סרטניים דג הזברה (

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את ההתנהגות הממאירה והפולשנית של תאים סרטניים במודל עוברי דג זברה. שיטה זו מסייעת לחוקרים לקבוע אם תאים סרטניים יכולים לפלוש ממערכת דם פונקציונלית, ובכך לדגמן שלב מפתח במפל הגרורתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמודל העובר של דג הזברה מספק הערכה זו וזמן אספקה קצר יותר מאשר ניסויים דומים שנערכים לעתים קרובות בעכברים.

מי שידגים את ההליך יהיה דוקטור אריק גלזגו שמנהל את מתקן הליבה של דג הזברה באוניברסיטת ג'ורג'טאון. לאחר הכנת תאים סרטניים, ריאגנטים ועוברי דג זברה על פי פרוטוקול הטקסט, חבר את מערכת חלוקת המיקרו הזרקה למקור אוויר בלחץ, והפעל את מקור הכוח. בדוק את הלחץ על ידי לחיצה על דוושת הרגל.

דופק קצר של אוויר אמור לפלוט ממחזיק המחט. הוסף 20 מיליליטר של תמיסת טריקאין 2X לצלחת הזרקה, והנח את הצלחת על שייקר כדי לאזן אותה. לאחר מכן חזור על שיווי המשקל עם תוספת שנייה של 2X טריקאין.

לאחר מכן, השתמשו בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר קבוצת עוברים לצלחת קטנה, המכילה תמיסת טריקאין 2X. בעזרת קצה טעינת ג'ל, מלאו מחדש את מחט המיקרו-הזרקה בתאים סרטניים. הנח את המחט בצנצנת אחסון אלקטרודות כשהקצה המחודד פונה כלפי מטה כך שהתאים ישקעו ליד הקצה.

העבירו 20 עד 30 עוברים מורדמים לצלחת הזרקה על ידי איסוף עוברים עם הרבה 2X טריקאין בפיפטה מפלסטיק. אפשר לעוברים להתייצב על קצה הפיפטה ואז להוציא בעדינות את העוברים לתוך שוקת צלחת ההזרקה, ולפזר את העוברים לאורך השוקת. יישר את העוברים כשהראשים פונים כלפי מעלה והבטן פונה לדופן התלולה של השוקת.

חבר את המחט למחזיק המחט של המניפולטור המיקרו. לאחר מכן, מקם את לוחית ההזרקה מתחת לסטריאוסקופ עם הקיר של 60 מעלות משמאל והתמקד בעובר העליון בהגדלה של פי 25. מקם את המניפולטור המיקרו כך שכאשר הוא מורחב המחט תנקב את העובר.

לאחר מכן הושיטו את המחט בעין עד שהיא כמעט נוגעת בעובר. כעת, תוך כדי התבוננות מתחת למיקרוסקופ, יישר את המחט כלפי מעלה כנגד העובר. כדי להזריק את התאים, חודרים את שוקת העובר דרך שק החלמון.

לחץ על דוושת כף הרגל, הנח את הקצה בדיוק בסינוס הקדם-לבבי, אך לא בתוכו. כוח ההזרקה יוציא את התאים לסינוס הלב. לחלופין, הזרקת תאים לשק החלמון מאפשרת לחקור היבטים שונים של פלישת כלי דם כמתואר בכתב היד.

בעזרת יד ימין, הושט ומשוך את מחט ההזרקה. ביד שמאל, בצע התאמות עדינות כדי למקם את העובר הבא. כאשר מזריקים את הצלחת כולה, החזירו את המחט לצנצנת אחסון האלקטרודות.

כדי להעביר את העוברים לצלחת ההתאוששות, הטה את לוחית ההזרקה כדי למשוך את העוברים בתחתית, שטוף את כל העוברים מהשוקת והשתמש בפיפטה מפלסטיק כדי לאסוף אותם. הניחו לעוברים להתיישב בתחתית הפיפטה, ולאחר מכן העבירו את העוברים לצלחת ההתאוששות בכמות מינימלית של טריקאין. דגרו על צלחת ההתאוששות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך שעה, לפני הפרדת העוברים בני הקיימא מעוברים מתים ופסולת.

דוגרים את המנה בחום של 33 מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה להבקעה. לאחר הרדמת אצווה של עוברים שיקבלו ניקוד, על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו זחל מורדם על שקופית מיקרוסקופ דיכאון בטיפה של טריקאין. כוונו את הזחלים לרוחב להדמיה אופטימלית של אזור הזנב.

הנח את השקופית על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכב עם עדשת אובייקטיבית פי 10. ציין את הזחלים על ידי ספירת מספר התאים הסרטניים שפלשו בהצלחה אל מחוץ לכלי הדם על ידי התמקדות למעלה ולמטה דרך אזור הזנב כדי להבחין בבירור בתאים שלמים. ממיסים תמיסת טריקאין 1.5% אגרוז ומביאים אותה ל-37 מעלות צלזיוס.

לאחר הרדמת העוברים כמו קודם, העבירו עובר בטיפה של תמיסת טריקאין למשטח ההדמיה. השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להסיר את תמיסת הטריקאין העודפת השומרת על העובר על משטח ההדמיה. לאחר מכן שכבו טיפה אחת של תמיסת אגרוז מומסת על העובר.

בעבודה מהירה, לפני שהאגרוז מתפלמר השתמש בכלי עדין כמו מברשת ריסים כדי לכוון את העובר לרוחב להדמיה, תוך הקפדה יתרה על כך שהעובר שטוח לאורך משטח ההדמיה. כאשר טיפת האגרוז התפלמרה, טבלו אותה בתמיסת טריקאין. לבסוף, הכניסו את עובר דג הזברה החי להדמיה מיקרוסקופית.

מבין שבעת קווי התאים של סרטן השד שנבדקו ליכולתם הפולשנית לכלי הדם בעוברי דג הזברה, קו התאים MDA-MB-231 הראה את המספר הגדול ביותר של תאי סרטן מוזרמים לעובר כאשר הוערכ, 96 שעות לאחר ההזרקה. כמו כן, נצפה כי תאי BT-474 פלשו בקלות לאזור הזנב של העוברים בעוד שקווי תאים אחרים כגון תאי MCF-7, SK-BR-3 ו-T-47D היו זעיר פולשניים. בבדיקה מותאמת המשתמשת באתר הזרקה אחר, בוצע ניסוי תחרותי שבו שתי אוכלוסיות של תאי MDA-MB-231, הנבדלים זה מזה ביכולתם הפולשנית לכלי הדם, הוזרקו בו זמנית לשק החלמון של העוברים המתפתחים.

לאחר הניקוד, נקבע כי תאי MDA-MB-231 שהתפשטו בתנאי תרבית קונפלואנט לפני ההזרקה, הראו ירידה בכניסה למחזור הדם, ולכן הייתה להם נוכחות מופחתת באזור הזנב של העוברים. לאחר השליטה, ניתן לבצע את זריקות העובר של דג הזברה תוך ארבע שעות אם הן מבוצעות כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בקריטריונים קפדניים ועקביים בעת ניקוד אקסטרוואזציה של תאים סרטניים.

בעקבות הליך זה, ניתן לאמת את התוצאות עוד יותר במודל עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את הזריקות ולצבור אקסטרוואזציה, מה שמאפשר לבדוק את יכולת הפולשנית של כלי הדם של תאים סרטניים בעוברי דג הזברה.