שתי טכניקות כדי ליצור עכברים Hypoparathyroid: Parathyroidectomy שימוש בלוטות GFP ודיפטריה-רעלן בתיווך יותרת התריס אבלציה
14 במרץ 2017
עכברים עם תת-פעילות נרכשת של בלוטת התריס יהיו שימושיים לחקר טיפולים תרופתיים חדשים לתת-פעילות של בלוטת התריס. מודגמים שני הליכים ליצירת עכברים כאלה. עכבר GFP-PTX נוצר על ידי כריתת בלוטת התריס כירורגית בהנחיית בלוטות יותרת התריס פלואורסצנטיות ירוקות. גישה שנייה, לא כירורגית, מבוססת על ביטוי ספציפי לבלוטת התריס של קולטן רעלן דיפתריה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור שני מודלים עכבריים של תת פעילות בלוטת התריס נרכשת שהם קלים לשימוש, מייצרים פנוטיפ יציב ומשאירים את תפקוד בלוטת התריס על כנו. היתרון העיקרי של שני המודלים הללו הוא שהם מאפשרים הסרה מדויקת של בלוטות יותרת התריס בעכברים, בין אם על ידי ניתוח מונחה פלואורסצנטי, או על ידי ביטוי ספציפי ל-PTH של קולטן רעלן דיפתריה, מה שמאפשר למקד ולהרוס את התאים באופן סלקטיבי מבלי להפריע לבלוטת התריס השכנה. אנו מקווים שהמודלים העכבריים שלנו יוכלו לענות על שאלות מפתח בתחום תת-פעילות בלוטת התריס.
לדוגמה, האם טיפולים אנלוגיים של PTH יכולים לעזור לשמור על רמות סידן תקינות בסרום מבלי להגביר את הפרשת הסידן בשתן? מודלים אלה יכולים לשמש גם לחקר שאלות קליניות אחרות בתת-פעילות של בלוטת התריס. לדוגמה, האם חוזק העצם מושפע מתת פעילות של בלוטת התריס והאם הוא משתנה עם הטיפול?
קשה לענות על שאלות כאלה אצל מטופלים, אך ניתן להשתמש במודלים אלה של עכברים כדי לענות עליהן. התחל בהרדמת עכברים בני שמונה עד 10 שבועות, המבטאים GFP במיוחד בבלוטת התריס על פי פרוטוקול מאושר. הנח את החיה במצב שכיבה והקפד על עומק הרדמה מתאים על ידי היעדר צביטה בבוהן, רפלקס נסיגה או אמצעים אחרים.
הרחיבו את אזור הצוואר הגחוני והתכוננו לניתוח על ידי גילוח הפרווה. חטאו את העור המגולח עם פד חיטוי יוד פובידון, ולאחר מכן הכינו את מקום החתך באמצעות פילינג כירורגי ושטיפת אלכוהול לפי הפרוטוקול המאושר שלכם. לאחר מכן, כסו את החיה בווילונות כירורגיים סטריליים כדי להפחית את זיהום אתר הניתוח.
לאחר חיתוך חתך אורכי של 2 ס"מ עם אזמל כירורגי, השתמש במלקחיים מעוקלים ומשוננים כדי לנתח את הפאשיה, ולדחוף את בלוטות הרוק הצידה. לאחר מכן, תוך כדי צפייה באתר הניתוח דרך מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בקצות המלקחיים החדים כדי לחתוך ולהפריד את שרירי קנה הנשימה ולחשוף את קנה הנשימה. זהה את האונות הימנית והשמאלית של בלוטת התריס הממוקמות ליד קנה הנשימה.
לאחר מכן העבר את מקור האור לאור פלואורסצנטי ודמיין את שתי בלוטות יותרת התריס הפלואורסצנטיות הירוקות. למכרסמים יש בדרך כלל רק שתי בלוטות פאראתירואיד. אם אינך יכול לזהות את שתי בלוטות יותרת התריס ליד בלוטת התריס מכל צד, יש לחשוד בבלוטות יותרת התריס הממוקמות חוץ רחמית, ולבצע חיפוש מדוקדק אחריהן לאורך קנה הנשימה.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים ובמספריים כירורגיים כדי להסיר בזהירות את בלוטות יותרת התריס הירוקות ובדוק היטב לאורך קנה הנשימה כדי לוודא שכל הרקמה הירוקה הוסרה. השתמש בגזה סטרילית להמוסטזיס. סגור את שרירי קנה הנשימה עם תפרים קטועים.
סגור את חתך העור עם תפרי הלסטד. הנח את החיה לאחר הניתוח בכלוב נפרד על כרית חימום להתאוששות טמפרטורת הגוף. לאחר שהעכבר ער, הניחו צ'או גלולה ומים עם מעט מזון ג'לטין על רצפת הכלוב.
לאחר תקופת תצפית לאחר הניתוח של שעתיים, החזירו את העכבר למתקן החיות. שלושה ימים לאחר כריתת בלוטת התריס, נתח 10 מיקרוליטר של דם זנב לסידן מיונן באמצעות מנתח כגון מערכת גזי הדם, מנתח סידן ו- pH. אם כריתת בלוטת התריס תצליח, סידן מיונן בדם יהיה שווה או פחות משתי סטיות תקן מזה של עכברי ביקורת שעברו ניתוח דמה.
התחל בהכנת תמיסת רעלן דיפתריה על ידי דילול אבקת רעלן דיפתריה במי מלח סטריליים לריכוז של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר. מסנן סטרילי את התמיסה ו-alloquot. הזרקו חמישה מיקרוגרם לק"ג רעלן דיפתריה במשקל גוף לעכברים בני שמונה עד 10 שבועות, המבטאים את קולטני רעלן הדיפתריה במיוחד בבלוטת התריס.
שלושה ימים לאחר הזרקה שנייה של רעלן דיפתריה, נתח 10 מיקרוליטר של דם זנב לסידן מיונן, כמו קודם. להלן תמונות מייצגות של המיקומים השונים של בלוטות יותרת התריס בעכברים המבטאים GFP במיוחד בפאראתירואיד. לעכברים היו שתיים או שלוש בלוטות ירוקות של בלוטת יותרת התריס.
רוב בלוטות יותרת התריס היו ממוקמות ליד הגבול העליון או ליד הגבול התחתון של בלוטת התריס. במקרים נדירים, חלק מבלוטות יותרת התריס היו ממוקמות באופן אקטופי. אחד היתרונות של מודל העכברים שלנו הוא שבלוטת התריס נשארת שלמה.
איור זה מראה רמות TSH של עכברי GFP-PTX שלושה חודשים לאחר כריתת בלוטת התריס. האיור הזה מראה מדידות T4. עכברי GFP-PTX מראים ריכוזי TSH וריכוזי T4 שלא היו שונים מעכברי הביקורת.
תמונה זו מציגה את רמות הסידן בדם ורמות PTH בעכברי GFP-PTX. תמונה זו מציגה את רמות הסידן בדם ורמות ה-PTH בעכברי PTHcre-iDTR שהוזרקו לרעלן דיפתריה. גם עכברי GFP-PTX וגם עכברי PTHcre-iDTR שהוזרקו DT הראו היפוקלצמיה יציבה ורמות PTH מופחתות במהלך תקופת תצפית של שלושה חודשים.
לאחר השליטה, ניתן לבצע כריתת בלוטת התריס בהנחיית GFP תוך כ-20 דקות לכל ההליך. זריקה אחת של רעלן דיפתריה אורכת לא יותר מדקה אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, עכברים אלה מפתחים תת-פעילות של בלוטת התריס ויכולים לשמש כמודל מחלה פרה-קלינית.
ניתן להתייחס לשאלות כגון היעילות של אנלוגים שונים של הורמוני PTH בטיפול בתת-פעילות של בלוטת התריס. אל תשכח שרעלן דיפתריה הוא מסוכן, ושהעובדים צריכים לקבל את החיסונים הרגילים נגד רעלן דיפתריה. יש ללבוש תמיד ציוד מגן אישי כגון מסכות וכפפות בעת ביצוע הליכים אלה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שני הליכים ליצירת מודלים של עכברים עם היפופרתהירואידיזם נרכש, החיוניים לבחינת טיפולים תרופתיים חדשים. המודלים מאפשרים הסרה מדויקת של בלוטות הפרתירואיד תוך שימור תפקוד בלוטת התריס, ובכך מקלים על חקר המצב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אנדוקרינולוגיה
- מודלים של בעלי חיים
רקע
- היפופרתורואידיזם נרכש הוא מצב שעלול להיות מאתגר למחקר בבני אדם.
- מודלים של עכברים מספקים סביבה מבוקרת למחקר.
- שיטות קיימות עשויות שלא לשמר ביעילות את תפקוד הבלוטה המגן במהלך הסרת בלוטות הפרתירואיד.
- הבנת ההיפופרתורואידיזם יכולה להוביל לאפשרויות טיפול טובות יותר.
מטרת המחקר
- ליצירת מודלים של עכברים המדמים היפופרתירואידיזם נרכש.
- לבחינת ההשפעות של טיפולים באנלוגים של PTH על רמות הסידן בנסיוב.
- לחקר ההשפעה של היפופרתירואידיזם על חוזק העצם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- כריתה כירורגית של בלוטת הפאראתירואיד המודרכת על ידי פלואורסצנציה לזיהוי בלוטות הפאראתירואיד.
- הזרקה של רעלן דיפתריה כדי להכווין באופן סלקטיבי לתאי הפאראתירואיד.
- ניטור רמות הסידן בנסיוב ורמות PTH לאחר הניתוח.
- שימוש בטכניקות דימות להדמיית מיקומי בלוטות הפאראתירואיד.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של מודלי עכברים יציבים עם היפופרתהירואידיזם.
- שימור תפקוד בלוטת התריס במהלך הסרת בלוטות הפרתירואיד.
- הדגמה של היפוקלצמיה ורמות PTH מופחתות במודלים.
- ניתן להשתמש במודלים להערכת היעילות של אנלוגים להורמון PTH.
מסקנות
- מודלי העכברים שפותחו בעלי ערך לחקר היפופאראתירואידיזם.
- הם מאפשרים מחקר של טיפולים פוטנציאליים מבלי להשפיע על תפקוד בלוטת התריס.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש במודלים אלה כדי לענות על שאלות קליניות קריטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מודלים פרה-קליניים מהימנים של היפופרתהירואידיזם נרכש הם חיוניים להערכת טיפולים באנלוגים של PTH ולהבנת הומיאוסטזיס של סידן ללא שיבושים הנובעים מתפקוד לקוי של בלוטת התריס. מודלים כפולים אלו מאפשרים תיקוף של מטרה והפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת פנוטיפים יציבים וניתנים לשחזור המשמרים את תפקוד בלוטת התריס, ובכך תומכים בקבלת החלטות מושכלות של go/no-go בשלבי הגילוי המוקדמים. היכולת למדל פתופיזיולוגיה של מחלה אנושית בעכברים משפרת את הרצף התרגומי ואת הרלוונטיות של פורטפוליו התרופות האנדוקריניות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מסלולים תלויי-PTH ובחינה של היפותזות טיפוליות במערכת שניתן לניפולציה גנטית.
- ערך תפעולי: מספק פנוטיפ היפוקלצמי יציב לקבלת תוצאות פרמקולוגיות עקביות בין קבוצות מחקר.
- ערך חיזוי: תומך בהערכת מעורבות המטרה (target engagement) ונאמנות האותות במורד המסלול עבור מודולטורים של קולטן PTH.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: יוצר מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עם נקודות קצה מדידות של סידן בנסיוב ו-PTH לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות.
- ערך תפעולי: מספק אבלציה הניתנת לשחזור, המונחית פלואורסצנציה או מושרית רעלים, המוכנה לסריקת תרכובות בסביבה של תפוקה גבוהה.
- יכולת הרחבה: תומכת בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מודליות טיפוליות מרובות המכוונות לוויסות סידן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: המודלים משקפים את הפתופיזיולוגיה של היפופאראתירואידיזם אנושי, ובכך מאפשרים בדיקה של מערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: מקל על ניטור אורך של מדדי תחלופת עצם וויסות סידן.
- ביטחון חיזוי: מאפשר קבלת החלטות על התקדמות מותאמת סיכון בהתבסס על יציבות פנוטיפית מתמשכת לאורך שלושה חודשים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
המודלים משתלבים ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לבחינת יעילות פרה-קלינית, ובכך מספקים מערכת רלוונטית למחלה לצורך הערכת תרופות אנדוקריניות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי יעילות של אנלוגים של PTH על סידן בנסיוב ללא השפעות מבלבלות של בלוטת התריס.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של הבדיקה באמצעות פנוטיפים היפוקלצמיים יציבים וכמותיים המתאימים להערכת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות של רמות סידן מיונן ו-PTH המסייעות לצוותים להשוות השפעות טיפול ומודולציה של מטרה.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות תחזוקת פנוטיפ יציב ויכולת להערכת חוזק העצם.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצג יכולת ניתנת לשימוש חוזר עבור פרויקטים מרובים החוקרים אגוניסטים של קולטן סידן, אנלוגים של PTH או תרופות אנבוליות לעצם.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הפחתת סיכונים מכניסטית של התערבויות במסלול ה-PTH.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות ניתוח מודרך פלואורסצנציה או אבלציה של רעל הניתן להשראה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות להומאוסטזיס של סידן.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המבוסס על נאמנות פנוטיפית ניתנת לתרגום ועיצוב שחוסך את בלוטת התריס.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחי עכברים, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וטיפול ברעלים.
- הצורך בציוד כולל מיקרוסקופי ניתוח עם יכולת פלואורסצנציה ומנתחי סידן.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת פרוטוקולים עקביים להרדמה, ניטור לאחר ניתוח ומדידת סידן מיונן.
- שיקולי התאמה כוללים שונות בבלוטות אקטופיות ומינוני רעל ספציפיים למין.
- מגבלות מעשיות כוללות דרישות בטיחות ביולוגית עבור רעל דיפתריה ותלות במיומנות כירורגית עבור אבלציה מונחית GFP.
