Name: ייחסתי Gambiae אנופלס יתושים עם חרוזים כדי לעודד ו למדוד את התגובה החיסונית melanization (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: למד טכניקת הזרקת חרוזים לחקר תגובת החיסון melanization ביתושי Anopheles gambiae. שיטה זו מאפשרת מדידה כמותית של כיסוי המלנין ומספקת תובנות לתחום האימונולוגיה האקולוגית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה התאפשר הודות למימון מאוניברסיטת נוישאטל. ברצוננו להודות לכל התלמידים שעזרו בשיפור הטכניקה הזו, כלומר לעמיתנו קווין טיבנט. אנו גם רוצים להודות לחברי מעבדת תומס על שהפכו את המעבדה שלהם לזמינה. ברצוננו להודות לג'נט טיפל על עזרתה בגידול יתושים. ברצוננו גם להודות ל-Loyal Hall במעבדתו של פרופסור טום בייקר על עזרתו בהכנת צינורות הזכוכית המיקרו-נימיים.

1. תמיסת מלח עבור הזרקת Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תמיסת מלח על ידי הוספת NaCl, KCl, ו CaCl 2 למים מזוקקים כדי להשיג 1.3 מ&quot;מ NaCl, KCl 0.5 מ&quot;מ ו -0.2 מ&quot;מ CaCl 2 ב- pH = 6.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של פתרון ירוק מתיל 0.1% ל -99 מיליליטר של תמיסת מלח כדי לצבוע את החרוזים שקוף. זהו &quot;פתרון ההזרקה&quot; 0.001% מתיל הירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להוסיף 5 מ&quot;ל של תמיסת ירוק 0.1% מתיל ל -45 מ&quot;ל של תמיסת מלח. 0.01% מתיל ירוק זה &quot;פתרון לנתיחה&quot; הוא 10 פעמים יותר מרוכז בירוק מתיל כדי להקל על הצבעוניות של חרוזים לבין ההתבוננות בהן במהלך הניתוח. הערה: סנן לעקר את החיץ במידת הצורך. </li></ol> 2. הכנת נימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות זכוכית microcapillary חום המשיך כדי לקבל עצה טובה מאוד מעט גדולה יותר את החרוזים הקטנים (φ = 40 מיקרומטר) 42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתוחdjust כל נימים ידי שבירת הקצה עם פינצטה או בניסור את הקצה. </li></ol> 3. גידול נגד יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א gambiae אחורי ב 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% לחות יחסית, ואור hr 00:12: מחזור כהה. שמור לנשים בוגרות ולתת להם גישת פתרון סוכר 10%. </li></ol> 4. בחירות ביד עם הנימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 0.009 גרם של חרוזים טעונים שלילית (40-120 מיקרומטר קוטר) בצלחת 5 ס&quot;מ פטרי ולהוסיף 5 מ&quot;ל של 30 דקות פתרון הזרקת מראש. הערה: המטרה היא לתת צבע לצבוע את החרוזים כדי לבצע את הבחירה חרוז להזרקה קל. חיטוי חרוז אם הם לא באים בצנצנת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות נימי רכוב נורה פיפטה נימים, ויזואלית לבחור את החרוז הקטן 0.1 μl של תמיסת המלח תחת מיקרוסקופ משקפת. הערה: כאשר ייחסו כמה חרוזים בו זמנית, בחר שלושה חרוזים בנפח כולל של 0.1 μl.</li></ol> טיפול נגד יתושים 5. הרכבת חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש aspirator חרקים, למקם כל יתוש בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל כל יתוש בקצרה על ידי הנחת הצינור בקרח כתוש (2-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים יתוש על צידו הימני מתחת למיקרוסקופ המשקפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו, לחסן יתוש עם הנימים ידי פירסינג בחוזקה דרך הצד השמאלי של לציפורן חלל בית החזה ולאחר מכן הזרקת הנוזל ואת החרוז. הערה: יש להיזהר שלא לפגוע שרירי התעופה ידי החזקת הנימים כמו בניצב היתוש ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים אנטומולוגיה נוצה, במקום כל נקבה בנפרד בכוס פלסטיק 180 מ&quot;ל מכוסה בכילה נגד יתושים; לתת להם גישה פתרון סוכר 10%. הערה: שים לב נדרש עם תמיסת הסוכר, כמו היתוש עלול להיתקע על טיפות תמיסת סוכר. </li></ol> 6. נגד יתושיםDissection וצילום חרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו אם יש היתושים חיים 24 שעות לאחר החיסון. אם כן, לבדוק את מצבם ולשמור רק היתושים מסוגלים לעוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא יתושים אלה ב -20 ° C. הערה: הם יכולים להיות כל הזמן כמה ימים עד חודשים לפני לנתיחה, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכנפיים של היתושים באמצעות פינצטה תחת מיקרוסקופ המשקפת בהגדלה 32x. תקן את הכנפיים על גבי שקופיות זכוכית עם סרט שקוף. רשום את הקוד בשימוש עבור כל יתוש פרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את שקופיות הזכוכית בתוך סורק ולסרוק אותם 1,200 dpi. הערה: בדוק שהקוד קריא לכל יתוש פרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשקופית מיקרוסקופ זכוכית בתמיסה לנתיחה, להשתמש במלקחיים כדי להפריד את החזה מהראש והבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בית החזה עם מלקחיים כדי לאחזר את החרוזים. הערה: חרוזים כי לא לעבור הבטן, אינם באים במגע אחד עם השני ורובם לצוף בחופשיות tהוא hemolymph. היזהר שלא לשבור את החרוז עם מלקחיים, כמו חרוז הלא melanized עשוי להיות קשה למצוא. חכה 1 עד 5 דקות עבור חרוזים להשיג צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את חרוזי טיפה של פתרון לנתיחה בשקופית מיקרוסקופ זכוכית, לפני צילום התמונה. הערה: אין צורך לשטוף את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ מצויד במצלמת, לקחת תמונה דיגיטלית של כל חרוז בכל הגדרת תאורה סטנדרטית בהגדלת 400X. הערה: אין לשנות את התאורה בין התמונות האחרות על מנת לאפשר ההשוואה שלהם. </li></ol> 7. ניתוח תמונה: חרוז melanization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ניתוח תמונה. לחץ על &quot;קובץ&quot; ולאחר מכן על &quot;פתח&quot; כדי למצוא תמונת חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;לנתח&quot;. לחץ על &quot;מדידות להגדיר.&quot; סמן את התיבה &quot;אומר ערך אפור&quot; בחלון &quot;מדידות סט&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על סמל כלי הבחירה מעגל. בחר את ההיקף החרוז; להשאר בלצד החרוז ולהימנע ההילה זוהרת סביבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקישו על תפריט &quot;לנתח&quot;. לחץ על &quot;קנה מידה.&quot; השג את הערך אפור הממוצע וגודל שטח החתך של החרוז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל את ערכן melanization של כל חרוז, לבצע את הפעולה הבאה באמצעות תוכנת מחשבון או מחשבון: &quot;256 - כלומר ערך אפור.&quot; מדד melanization הוא ערך בין 0 ל 256, עם 0 מייצג תמונה לבנה לגמרי. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+immune+responses+to+human+and+rodent+Plasmodium+parasite+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species.</a> PLoS pathog. 2 (6), e52(2006).</li>
<li>Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERSPECTIVE%3A+Principles+of+ecological+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Appl%22%5BJournal%5D)">PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology.</a> Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).</li>
<li>Crompton, P. D., Moebius, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Immunity+in+Man+and+Mosquito%3A+Insights+into+Unsolved+Mysteries+of+a+Deadly+Infectious+Disease%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*.</a> Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).</li>
<li>Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EVOLUTIONARY+ECOLOGY+OF+INSECT+IMMUNE+DEFENSES%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES.</a> Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).</li>
<li>Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+phagocytosis+and+melanization+of+bacteria+and+Plasmodium+sporozoites+by+hemocytes+of+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22J+parasito%22%5BJournal%5D)">Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti.</a> J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).</li>
<li>Carissimo, G., Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+immunity+of+Anopheles+gambiae+is+highly+compartmentalized%2C+with+distinct+roles+for+RNA+interference+and+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota.</a> PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).</li>
<li>Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -C., Nappi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanization+immune+responses+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+parasito%22%5BJournal%5D)">Melanization immune responses in mosquito vectors.</a> Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).</li>
<li>Collins, F., Sakai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+of+a+Plasmodium-refractory+strain+of+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Science. 234 (4776), 607-610 (1986).</li>
<li>Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+immune+responses+to+Sephadex+beads%3A+Involvement+of+anti-Plasmodium+factors+in+regulating+melanization%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization.</a> Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).</li>
<li>Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine+metabolism+regulates+reproduction+and+parasite+melanization+in+the+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito.</a> PloS one. 9 (1), e84865(2014).</li>
<li>Cerenius, L., Söderhäll, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophenoloxidase-activating+system+in+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno+Rev%22%5BJournal%5D)">The prophenoloxidase-activating system in invertebrates.</a> Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).</li>
<li>Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proPO-system%3A+pros+and+cons+for+its+role+in+invertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Immuno%22%5BJournal%5D)">The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity.</a> Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).</li>
<li>Moret, Y., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoret%2C+Y+%22Survival+for+immunity%3A+the+price+of+immune+system+activation+for+bumblebee+workers%22">Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers</a>. , Science. New York, N.Y. 1166-1168 (2000).</li>
<li>Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Larval+Nutrition%2C+Adult+Body+Size%2C+and+Adult+Temperature+on+the+Ability+of+Anopheles+gambiae%28Diptera%3A+Culicidae%29+to+Melanize+Sephadex+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads.</a> J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).</li>
<li>Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Mosquito+Age+and+Reproductive+Status+on+Melanization+of+Sephadex+Beads+in+Plasmodium-Refractory+and+-Susceptible+Strains+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae.</a> J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).</li>
<li>Schwartz, A., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanization+of+Plasmodium+falciparum+and+C-25+Sephadex+Beads+by+Field-Caught+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+from+Southern+Tanzania%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania.</a> J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).</li>
<li>Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+and+melanization+responses+of+Armigeres+subalbatus+against+inoculated+Sephadex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads.</a> J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).</li>
<li>Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+immune+responses+in+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22J+insect+physiol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.</a> J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).</li>
<li>Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overloading+the+immunity+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae+with+multiple+immune+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Vector%22%5BJournal%5D)">Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges.</a> Parasite Vector. 9 (1), 210(2016).</li>
<li>Lazzaro, B. P., Rolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danger%2C+Microbes%2C+and+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Danger, Microbes, and Homeostasis.</a> Science. 332 (6025), 43-44 (2011).</li>
<li>Arrighi, R. B. G., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+GPI+toxin%3A+a+common+foe+for+man+and+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+trop%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito.</a> Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).</li>
<li>Michel, K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+immunity+against+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">Mosquito immunity against Plasmodium.</a> Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).</li>
<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%3A+comparative+and+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics.</a> J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).</li>
<li>Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+and+functional+genomics+of+the+innate+immune+system+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).</li>
<li>Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+RNAi+is+the+major+innate+immune+pathway+controlling+arbovirus+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Future+microbiol%22%5BJournal%5D)">Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission.</a> Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).</li>
<li>Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+dissecting+mosquito+innate+immune+responses+to+arbovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection.</a> J Gen Virol. , (2009).</li>
<li>Schwartz, A., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cost+of+immunity+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti+depends+on+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+evol+biol%22%5BJournal%5D)">The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation.</a> J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).</li>
<li>Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+correlation+between+melanization+and+antibaterial+immune+responses+in+a+natural+population+of+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Evolution. 58 (10), 2377(2004).</li>
<li>Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+immunosuppression+by+a+malaria+parasite+in+its+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).</li>
<li>Sacks, D., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+innate+immunity+by+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+immunol%22%5BJournal%5D)">Evasion of innate immunity by parasitic protozoa.</a> Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).</li>
<li>Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+protozoan+parasites+evade+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Parasito%22%5BJournal%5D)">How protozoan parasites evade the immune response.</a> Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).</li>
<li>Damian, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+immune+evasion+and+exploitation%3A+reflections+and+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections.</a> Parasitology. 115, S169-S175 (1997).</li>
<li>Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+immune+evasion%3A+a+momentous+molecular+war%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+ecol+evol%22%5BJournal%5D)">Parasite immune evasion: a momentous molecular war.</a> Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).</li>
<li>Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+defence%2C+parasite+evasion+strategies+and+their+relevance+for+%26%2334%3Bmacroscopic+phenomena%26%2334%3B+such+as+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for &#34;macroscopic phenomena&#34; such as virulence.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).</li>
<li>Stearns, S. C., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+phenotypic+plasticity+in+life+history+traits-+predictions+of+reaction+norms+for+age+and+size+at+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity.</a> Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).</li>
<li>Stearns, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-history+tactics%3A+a+review+of+the+ideas%5BTitle%5D)+AND+%22Q+rev+biol%22%5BJournal%5D)">Life-history tactics: a review of the ideas.</a> Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).</li>
<li>Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+Reveals+Maintenance+Cost+of+Humoral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity.</a> Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).</li>
<li>Sheldon, B. C., Verhulst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+immunology%3A+costly+parasite+defences+and+trade-offs+in+evolutionary+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Ecol+Evo%22%5BJournal%5D)">Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology.</a> Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).</li>
<li>Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+causes+and+consequences+of+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Ecol+Evol+S%22%5BJournal%5D)">Evolutionary causes and consequences of immunopathology.</a> Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).</li>
<li>Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implications+of+immunopathology+for+parasite+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The implications of immunopathology for parasite evolution.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).</li>
<li>Cator, L. J., George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BManipulation%26%2334%3B+without+the+parasite%3A+altered+feeding+behaviour+of+mosquitoes+is+not+dependent+on+infection+with+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">34;Manipulation&#34; without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711(2013).</li>
<li>Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+maternal+effects+after+stimulation+of+the+melanization+response+in+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti.</a> Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).</li>
<li>Paskewitz, S., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Plasmodium+refractory+and+susceptible+strains+of+Anopheles+gambiae+to+inoculated+Sephadex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+comp+immunol%22%5BJournal%5D)">Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads.</a> Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

טכניקת ההזרקה זו שימושית כדי לעורר וללמוד את התגובה melanization יתושים. לדוגמא, כאן אנו בחנו את ההשפעה של עומס הגירויים החיסוני. השלב הקריטי בהליך זה הוא לחסן היתוש כראוי. כל נזק מוגזם לשרירים הטיסה או היתוש עצמו עשוי למנוע את היתושים מן האכלה או עלול להרוג אותו לפני הניתוח. צעד מרכזי שני הוא כדי להרחיק את היתושים על קרח מספיק זמן כדי לדפוק אותם בלי להרוג אותם. מכל קטן יקל ולהאיץ את התהליך, שכן הוא מאפשר מגע הדו...

חרקים להסתמך על המערכת החיסונית כדי להגן על עצמם מפני טפילים ופתוגנים 1 - 3 המפרות דרך לציפורן שלהם או midgut שלהם האפיתל 4. בשנת יתושים, התגובות הללו הם יעילים כנגד חיידקים 5, וירוסים 6, נמטודות filarial 7, ו טפילי מלריה 1,8,9. בשנת יתושים, תגובה חיסונית מפתח היא אנקפסולציה של חלקיקים זרים עם מלנין 10 - 12. אנקפסולציה זה עשוי לקרות midgut או ב hemolymph במחזור מערכת 10 - 12. בתגובה melanization זוהי תוצאה של-phenoloxidase פרו מפל 10 - 12, וזה יכול לגרום למוות של טפילים או phagocytosis שלהם. בשנת יתושים בוגרים, שבו מספר תאי hemocytes מוגבל, melanization היא תגובת לחות, כמו נגד טפילי Plasmodium או נמטודות filarial 7.בחלק וחרקים אחרים, זה ישירות התאים hemocytes כי להתאסף סביב הטפיל כדי melanize אותם 7. חוץ מזה, מלנין חיוני גם כמה תהליך פיסיולוגי אחר כמו ייצור ביצים ופצעים לציפורן ריפוי 7. הגירוי של מערכת חיסונית משמש ככלי ללמוד חסינויות חרקים בכמה מערכות מודל בריאות חקלאית וציבורי 13 - 18. הוא משמש אנופלס יתושי gambiae, הווקטור הגדול של במלריה באפריקה, כדי לחקור אינטראקציות מארח טפיל 14 - 16,19. טכניקות אלו מבוססות על הקיבולת של חרקים כדי לזהות טפילים עם קולטנים זיהוי דפוסים שלהם (PRR) 2. יתושים יכולים גם לזהות מולקולות אחרות מפריעות הביולוגיה שלהם כגון דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs), או לזהות תאים הפגומים שלהם עקב השחרור של קולגן וחומצות גרעין. תא היתושים החיסוניים כגון hemocytes משמש לגילוי 20 - 23. מסלולי האיתות החיסוניים העיקריים הם IMD, אגרה, JAK / STAT 24, והפרעת חומצה ריבונוקלאית (RNAi) 25,26. שניהם אגרה ושבילי IMD להשפיע על תגובת melanization ולתקשר עם-phenoloxidase פרו מפל 10 - 12. הכלי הסטנדרטי המשמש לעורר את תגובת melanization הוא החיסון של יתוש עם חרוז קטן לתוך hemolymph של חלל בית החזה. מידת אנקפסולציה מלנין לאחר מכן ניתן למדוד 19 לאחר אחזור חרוז באמצעות דיסקציה של היתוש. במרבית המחקרים, רק חרוז אחד שהוזרק לכל יתוש 15,16,27, אך הזרקת חרוזים יותר אפשרי על מנת ללמוד את גבולות התגובה melanization 19. חרוזים אלה מוזרקים באמצעות פתרון הזרקה (בסרום פיסיולוגי) להגביל הפרעה של פיזיולוגית היתושיםההתייבשות של היתוש 15,16,27. לצבוע מתווסף פתרון זה כדי להקל מבחר חרוז. זה אותו הדבר עבור הפתרון לנתיחה בשימוש כדי לאחזר את 15,16,27 חרוז. היתרון של יחסינו חרקים עם גירויים שאינם פתוגניים הוא היכולת להתמקד ההשפעה הישירה על התגובה החיסונית. אין תופעות סיבוך עקב פתוגניות טפילה 28, דיכוי חיסוני 29 - 31, או התחמקות חיסון 31 - 34. חוץ מזה, את ההשלכות של הגירויים על תכונות היסטורית חיים אחרות, כגון תוחלת חיים או פוריות, יכולות להיות גם למדו. לפיכך, חוקרים לומדים אקולוגיה אבולוציונית עשויים לדרוש כלים כגון 2,35,36. לדוגמא, דבורי מאותגרים חיסוניים יש תוחלת חיים מקוצרת תחת רעב. דומות השפעות שליליות של גירויים ופריסות חיסוניים נצפו דגמים חסרי חוליות שונים, ופעמים רבות תוצאה הוא קצראה תוחלת חיים או פחות רביית הצלחה 13,27,37. ניתן לבצע מחקרים כאלה בסביבות משתנות 2,4,38. גירוי החסינות היא גם לעניין את אלו מתמקדים ישירות על immunopathology 39,40. פרוטוקול זה מבוסס על החיסון של חרוזים עם יתושים כדי לעורר את תגובת melanization וישירות למדוד את כמות המלנין. זה מאפשר מחקר כמותי ואיכותי של התגובה melanization במסגרות ניסיוניות שונות. כלי כזה יכול להתארך עד הגירוי של תגובות חיסוניות אחרות, כגון תגובה אנטיבקטריאלי לחום-הרג חיידקים 41. זה גם יכול להתנהל במסגרות אקולוגית רבה.

<table><tbody><tr><td>צינורות זכוכית מיקרו-נימיים GB120TF-10</td><td>science-products.com</td><td>GB120TF-10</td><td></td></tr><tr><td>http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html Microcaps נורת פיפטה נימית</td><td>Drumond</td><td>1-000-9000</td><td></td></tr><tr><td>טעון שלילי Sephadex CM C-25 חרוזים</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, גרמניה</td><td>C25120 SIGMA</td><td>צריך מעט כדי להתחיל</td></tr><tr><td>מתיל ירוק</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>323829-ALDRICH</td><td>זקוקים למעטים כדי להפעיל</td></tr><tr><td>את תוכנה ImageJ</td><td>בקוד</td><td></td> פתוח <td>גרסה 1.47f7 ואילך</td></tr></tbody></table>

ייחסתי<em&gt; gambiae אנופלס</em&gt; יתושים עם חרוזים כדי לעודד ו למדוד את התגובה החיסונית melanization

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

הגירוי של המערכת החיסונית הוא כלי נפוץ מחקרים חסרי חוליות לבחון את היעילות ואת מנגנוני חסינות. גירוי זה מבוסס על הזרקת חלקיקים שאינם פתוגניים לתוך חרקים, שכן חלקיקי יזוהו על ידי המערכת החיסונית יניעו את הייצור של effectors החיסונית. אנו מתמקדים כאן על גירוי של התגובה melanization של היתוש אנופלס gambiae. התוצאות בתגובה melanization ב אנקפסולציה של חלקיקים זרים וטפילים בשכבה כהה של מלנין. כדי לעורר את התגובה הזאת, יתושים הם מחוסנים עם חרוזים את חלל בית החזה באמצעות צינורות זכוכית microcapillary. ואז, לאחר 24 שעות, היתושים הם גזורים כדי לאחזר את החרוזים. מידת melanization של החרוז נמדדת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. חרוזים לא צריכים את ההשפעות פתוגניים של טפילים, או יכולתי להתחמק או לדכא את התגובה החיסונית. זריקות אלו הן דרך צפחותמחדש יעילות חיסון ואת ההשפעה של גירויים חיסוניים על תכונות היסטורית חיים אחרות, כגון פוריות או אריכות ימים. זה לא בדיוק אותו דבר כמו ללמוד ישירות אינטראקציות המארח טפיל, אבל זה כלי מעניין ללמוד חסינות אקולוגיה אבולוציונית שלה.

<html> יתושים לא כל melanize חרוזים באותה דרך, כמו כמה חרוזים היו פחות מכוסה המלנין יותר מאחרים (איור 1). ואכן, כמה חרוזים נשאר כחולים בגלל חוסר melanization, בעוד שאחרים היו חושך מוחלט (איור 1). השווי melanization היה טופל על ידי אינטרפולציה ליניארית לערך בין 0 (אשר תואם חרוז כחול unmelanized) ו -100 (המקביל ל חרוז כהה בכבדות melanized) (איור 2 א ו -2 ב). ערכים אלה מציינים את מידת ...

באמצעות חיסון בחרוזים, הטכניקה המתוארת מאפשרת גירוי של תגובת המלניזציה של היתושים במערכת המחזור של המולימפה. ניתן למדוד את כמות המלנין המכסה את החרוזים לאחר דיסקציה כמדד לתגובה החיסונית.

ייחסתי<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; יתושים עם חרוזים כדי לעודד ו למדוד את התגובה החיסונית melanization

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

המטרה הכוללת של טכניקת חיסון זו היא לעורר את התגובה החיסונית של היתושים ולמדוד את תגובת המלניזציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום האימונולוגיה האקולוגית, כולל הבסיס הגנטי לעלות התגובה האנושית והשפעת גורמים סביבתיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תגובת החיסון, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון תגובה אנטי-ויראלית או אנטי-בקטריאלית במערכות חסרי חוליות אחרות.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל נזקי החרקים שהזריקה עלולה לגרום. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת מתיל ירוקה 0.1% ל-99 מיליליטר של תמיסת המלח כדי לצבוע את החרוזים השקופים. זהו תמיסת ההזרקה הירוקה של 0.001%.לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת מתיל ירוקה של 0.1% ל -45 מיליליטר מתמיסת המלח. תמיסת דיסקציה זו של 0.01% מתיל ירוק מרוכזת פי 10 במתיל ירוק כדי להקל על צביעת החרוזים והתבוננות בהם במהלך הדיסקציה. חיטוי התמיסות ב-110 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות.כדי להכין את הנימים, משוך בחום צינורות זכוכית מיקרו-נימיים כדי לקבל קצה דק מאוד, מעט גדול יותר מהחרוזים הקטנים ביותר. פתח והתאם כל נימי על ידי שבירת הקצה בפינצטה או על ידי ניסור הקצה. לבחירת חרוזים עם נימי, שפכו 0.009 גרם חרוזים טעונים שלילית בצלחת פטרי של חמישה סנטימטרים.לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת הזרקה 30 דקות מראש. זה צובע את החרוזים כדי להקל על

inoculating-anopheles-gambiae-mosquitoes-with-beads-to-induce-measure

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנופלס יתושים stephensi הם וקטורים עבור מלריה בהודו המאכלסים וברחבי אסיה. וידאו זה מדגים את הטכניקה לביצוע microinjections של מין זה עם transgenes כי יעניק התנגדות מלריה אל היתוש. הרבה המתודולוגיה הפגינו וידאו זה הוא ישים טכניקות microinjection של מינים יתושים אחרים.

הזרקת. עוברים stephensi ליצור מלריה עמידים יתושים

בסרטון זה, אנו מדגימים את העברת מבנה כונן הגן לעובר של יתוש אנופלס גמביה באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה עוברית. הליך זה מאפשר שילוב של מבנה DNA מועבר, באמצעות רקומבינציה הומולוגית, לתוך תאי הנבט כדי ליצור אוכלוסיית יתושים מותמרת.

מיקרו-הזרקה של עובר יתוש: טכניקה להעברת DNA אקסוגני לחלמון עובר של אנופלס גמביה ליצירת מוטציות בקו הנבט

סרטון זה מדגים בדיקה לחיסון מודל עכבר עם ספורוזואיטים חיים מוחלשים. הפלסמודיום ספורוזואיטים המוחלשים בקרינה מוזרקים לצד הגבי של אוזנו של העכבר. לאחר הזרקות במספר מקומות בשתי האוזניים, העכבר רשאי להתאושש.

חיסון תוך עורי עם ספורוזואיטים חיים מוחלשים במודל עכבר

קשה לשכפל הדבקה משותפת בבני אדם במבחנה. עם זאת, טפילי מלריה אנושיים ניתנים לתרבית בקלות במבחנה, כמו גם תאים חד-גרעיניים מבודדים מדם היקפי אנושי שנדבקו באופן טבעי ב-HIV. זה מספק מודל מצוין לחקר תגובות חיסוניות מוקדמות לטפילי מלריה בהקשר של הדבקה משותפת ב-HIV.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

RNA interference (RNAi) הוא כלי בעל ערך רב לחשיפת תפקוד הגנים. עם זאת, היכולת למקד גנים באמצעות RNAi בשלבים טרום-בוגרים מוגבלת בווקטור המלריה האנושי העיקרי Anopheles gambiae. אנו מתארים פרוטוקול RNAi להפחתת תפקוד הגנים באמצעות הזרקה ישירה במהלך התפתחות הגולם.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד תאים מיאלואידים מעור העכבר וניקוז בלוטות הלימפה לאחר הזרקה תוך עורית של Plasmodium sporozoites. ציטומטריית זרימה של תאים שנאספו מספקת בדיקה אמינה לאפיון העור וניקוז התגובה הדלקתית של בלוטות הלימפה לטפיל.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

הפרוטוקול מתאר כיצד להשיג שינויים מכווני אתר בגנום של יתושי מלריה אנופלס באמצעות מערכת φC31 . השינויים המתוארים כוללים הן את האינטגרציה והן את חילופי הקלטות מהונדסות בגנום של קווי עגינה נושאי attP.

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה חיוניות כדי להכניס גנים אקסוגניים לגנומים של יתושים. פרוטוקול זה מסביר שיטה המשמשת את מעבדת ג'יימס למיקרו-המצאת מבני DNA לעוברי אנופלס גמביה כדי ליצור יתושים שעברו טרנספורמציה.

שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

בדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA) נחשבת לתקן הזהב להערכה וזיהוי של תרכובות פוטנציאליות נגד מלריה. מערכת האכלה מלאכותית זו משמשת להדבקת יתושים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של תרכובות כאלה על העוצמה והשכיחות של טפיל פלסמודיום falciparum .

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

למד טכניקת הזרקת חרוזים לחקר תגובת החיסון melanization ביתושי Anopheles gambiae. שיטה זו מאפשרת מדידה כמותית של כיסוי המלנין ומספקת תובנות לתחום האימונולוגיה האקולוגית.

ייחסתי

גלה סרטונים נוספים