Name: SorLA ו CLC: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα כפי שהוכח על ידי המערב סופג, עיכוב של ליזוזומלית אנזימים, ו Immunocytochemistry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: חקור את תפקידם של SorLA ו-CLC:CLF-1 בהורדת רמת קולטן CNTFRα ובניוותו הליזוזומלית באמצעות מערב סופג ואימונוציטוכימיה בתאי כליה אנושיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של מחזוריות חלבוני קרום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין אישורים.

1. המערבי סופג של CNTFRα Lysates <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין מהיר באורך מלא sorLA ו myc-tagged CNTFRα בונים בכליה עוברית אנושית 293 (HEK293) תאים באמצעות pcDNA3.1 / Zeo (-) ו pcDNA3.1 / מוצרי היגיינה (-), בהתאמה. Transfect התאים HEK293 עם המבנים באמצעות מגיב transfection מסחרי לפי פרוטוקול manufacturer&#39;s. בחר שיבוטים יציב במדיום המכיל 150 מיקרוגרם / מ&quot;ל Zeocin ו / או 500 מיקרוגרם / מ&quot;ל hygromycin B זהב 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר שווה זרע HEK293 transfectants להביע או CNTFRα-Myc או שיתוף להביע CNTFRα-Myc / sorLA בשתי צלחות 4-היטב כפי שמוצג באיור 1. התרבות התאים Dulbecco השתנה Eagle&#39;s בינוני (DMEM) בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS), 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין (בינוני מלא) בתוך חממה פחמן דו חמצני 5% ב 37 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתן עד שהתאים הם 50 - 80% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום מןבארות, ולשטוף פעם עם Dulbecco בופר פוספט (DPBS), ולהוסיף בינוני מלא טרי עם או בלי (שליטה) 10 ננומטר CLC: CLF-1 כמצוין באיור 1. דגירת התאים ב 37 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 0 ו -5 שעות של דגירה, לשחזר המדיום ולאחסן אותו ב 4 C ב 1.5 צינורות מ&quot;ל. לאחר מכן להוסיף 1% Triton X-100 חיץ תמוגה (20 mM Tris-HCl, 10 מ&quot;מ EDTA, pH 8.0) השלימו עם קוקטייל מעכב proteinase היטב כל (1 דק &#39;, 4 ג). בהמשך לכך, להעביר את lysates התא 1.5 צינורות מ&quot;ל (4 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינורות המכיל את lysate בינוני ותא (3,000 XG, 3 דקות, 4 ג) ולהעביר את supernatants 1.5 צינורות מ&quot;ל (4 ג). וזורק את הכדור. העברת 5 μL של כל supernatant התא lysate צינורות 1.5 מ&quot;ל חדש - להשתמש בהם כדי למדוד את תכולת החלבון מאוחר יותר (שלב 1.7). מיד, להוסיף למאגר מדגם LDS nonreducing לכל supernatants מערבולת הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב -5 aliquots μL למדוד את protתוכן ein ​​ב supernatants התא lysate באמצעות assay חלבון מסחרי על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את הדגימות ב 95 צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא כמות שווה של חלבון מכל מדגם לצמצום SDS-PAGE 13 ו המערבי סופג 13 ולדמיין את התוכן של sorLA, β-אקטין, ו CNTFRα-Myc בטווח הבינוני ב lysates התא באמצעות ארנבת אנטי sorLA 16 (5 מיקרוגרם / מיליליטר), אנטי-β-יקטין עכבר (0.4 מיקרוגרם / מיליליטר), ועכבר אנטי-Myc (1 מיקרוגרם / מיליליטר) נוגדנים ואת הנוגדנים משני HRP הצמוד המתאימים (1: 2,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הלהקות ידי צפיפות על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol> 2. Immunocytochemistry לשלב עם ליזוזומלית מעכבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע HEK293 transfected ביציבות עם CNTFRα-Myc / sorLA בשקופיות כיסוי בצלחת 4-היטב כפי שמוצג באיור 2. התרבות התאים בינוני מלא כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חכה עד מפגש תא הוא 20 - 40%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מבארות ולהוסיף בינוני מלא עם או בלי 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל של leupeptin ושל pepstatin (Leu / עידוד) (מעכב hydrolases ליזוזומלית) לתאי כמצוין באיור 2. דגירת התאים ב 37 ג. המדיום חייב להיות מוחלף כל 6 שעות במהלך דגירה 24 השעות של הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה, שוב להחליף את המדיום (עם או בלי Leu / עידוד) והפעם להוסיף 10 CLC ננומטר: CLF-1. דגירת התאים ב 37 צלזיוס למשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים פעם PBS ולתקן אותם paraformaldehyde 4%, pH 7 במשך 15 דקות ב RT. זהירות: Paraformaldehyde היא רעילה ביותר, להימנע ממגע עם עור, עיניים, רירי. כפפות ומשקפי בטיחות צריכים להיות משוחק ופתרונות עשו בתוך במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים פעם ב PBS permeabilize התאים למשך 5 דקות ב RT ב saponin מדולל PBS (saponin 0.5%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל עז נגד CNTFRα (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) (יש לצייןלא העכבר אנטי-Myc המשמש המערבי סופג) ועכבר אנטי-LAMP-1 (15 מיקרוגרם / מ&quot;ל) נוגדנים saponin 0.5% ו דגירה התאים עם נוגדנים עבור 2 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את 4x תאים (5 דק &#39;) ב saponin 0.5% ו דגירה התאים עם 488- וחמור נגד עז החמור Alexa נוגדנים משני אנטי עכבר Alexa 568 מצומדות (6 מיקרוגרם / מ&quot;ל) עבור 2 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים 4x (5 דק &#39;) ב saponin 0.5%, פעמיים מים ללא יונים (1 דקות), ואת הר שקופיות כיסוי על מיקרוסקופ שקופיות באמצעות התקשורת הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את מכתים נוגדן של תאים על ידי מיקרוסקופ confocal באמצעות מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה עם מטרה טבילה במים 63X C-Apochromat, NA 1.2. </li></ol> כתם איתור 3. המערבי של pSTAT3 רמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע HEK293-sorLA (המבטאים רמות אנדוגני של CNTFRα) בצלחת 4-היטב כפי שמוצג באיור 3. התרבות התאים בינוני מלא כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתן עדתאים הם 50 - 80% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מבארות, ולשטוף פעם PBS, ולהוסיף בינוני מלא טרי עם או בלי 10 ננומטר CLC: CLF-1 אל התאים כמצוין באיור 3. דגירת התאים ב 37 צלזיוס למשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, לשטוף את התאים פעמיים DMEM unsupplemented (בינוני ריק; ללא FBS ואנטיביוטיקה), ולאחר מכן reincubate התאים למשך 90 דק &#39;(37 ג) במדיום ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, להסיר את בינונית ומוסיפים בינוני ריק טרי עם או בלי 5 ננומטר CLC: CLF-1 (ליזום זירחון STAT3) כמצוין באיור 3. דגירה במשך 15 דקות ב 37 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות הבינוני lyse התאים (1 דק &#39;, 4 ג) על ידי הוספת חיץ תמוגה 1% Triton X-100 (20 mM Tris-HCl, 10 מ&quot;מ EDTA, pH 8.0) השלימו עם קוקטייל מעכב proteinase ו מעכב phosphatase קוקטייל זה טוב. בהמשך לכך, להעביר את lysates התא 1.5 צינורות מ&quot;ל (4 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 μL of כל supernatant לצינורות 1.5 מ&quot;ל חדש - להשתמש בהם כדי למדוד את תכולת החלבון מאוחר יותר (שלב 3.8). מיד, להוסיף למאגר מדגם LDS nonreducing לכל supernatants מערבולת הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את תכולת החלבון של 5 aliquots μL באמצעות assay חלבון מסחרי על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate מדגם ב RT עד שהם כבר לא צמיגות (כ 1 דקות) ולאחר מכן לחמם אותם ב 95 צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא כמות שווה של חלבון מכל מדגם כדי SDS-PAGE 13 ו המערבי סופג 13 ולדמיין את התוכן של pSTAT3 ו STAT3 סך lysates התא באמצעות ארנבת אנטי pSTAT3 (1: 2000) ועכבר אנטי STAT3 (1: 1,000 נוגדנים) לבין הנוגדנים משני עכבר ארנב המתאים צמוד HRP (1: 2,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הלהקות ידי צפיפות על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol>

<ol><li>Elson, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLF+associates+with+CLC+to+form+a+functional+heteromeric+ligand+for+the+CNTF+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex.</a> Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).</li>
<li>Senaldi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+neurotrophin-1%2FB+cell-stimulating+factor-3%3A+a+cytokine+of+the+IL-6+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).</li>
<li>Elson, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-like+factor-1%2C+a+novel+soluble+protein%2C+shares+homology+with+members+of+the+cytokine+type+I+receptor+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family.</a> J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).</li>
<li>Lelievre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+recruited+by+the+cardiotrophin-like+cytokine%2Fcytokine-like+factor-1+composite+cytokine%3A+specific+requirement+of+the+membrane-bound+form+of+ciliary+neurotrophic+factor+receptor+alpha+component%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component.</a> J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).</li>
<li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Death+in+Mice+Lacking+Cardiotrophin-Like+Cytokine+%28CLC%29+is+Associated+with+Multifocal+Neuronal+Hypoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia.</a> Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).</li>
<li>Forger, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiotrophin-like+cytokine%2Fcytokine-like+factor+1+is+an+essential+trophic+factor+for+lumbar+and+facial+motoneurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo.</a> J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).</li>
<li>Alexander, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suckling+defect+in+mice+lacking+the+soluble+haemopoietin+receptor+NR6%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6.</a> Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).</li>
<li>DeChiara, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+lacking+the+CNTF+receptor%2C+unlike+mice+lacking+CNTF%2C+exhibit+profound+motor+neuron+deficits+at+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth.</a> Cell. 83 (2), 313-322 (1995).</li>
<li>Crisponi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crisponi+syndrome+is+caused+by+mutations+in+the+CRLF1+gene+and+is+allelic+to+cold-induced+sweating+syndrome+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1.</a> Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).</li>
<li>Crisponi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+recessive+disorder+with+muscle+contractions+resembling+neonatal+tetanus%2C+characteristic+face%2C+camptodactyly%2C+hyperthermia%2C+and+sudden+death%3A+a+new+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome.</a> Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).</li>
<li>Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-induced+profuse+sweating+on+back+and+chest.+A+new+genetic+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity.</a> Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).</li>
<li>Guillet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+active+fusion+protein+of+the+novel+composite+cytokine+CLC%2Fsoluble+CNTF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor.</a> Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).</li>
<li>Larsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-Like+Factor+1%2C+an+Essential+Facilitator+of+Cardiotrophin-Like+Cytokine%3ACiliary+Neurotrophic+Factor+Receptor+alpha+Signaling+and+sorLA-Mediated+Turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Jacobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+a+novel+human+hybrid-type+receptor+that+binds+the+alpha2-macroglobulin+receptor-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein.</a> J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+by+the+cytoplasmic+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+binding+receptor+SorLA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA.</a> Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).</li>
<li>Jacobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sorLA+cytoplasmic+domain+interacts+with+GGA1+and+-2+and+defines+minimum+requirements+for+GGA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding.</a> FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).</li>
<li>Klinger, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SorLA+regulates+the+activity+of+lipoprotein+lipase+by+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking.</a> J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).</li>
<li>Kitago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+amyloidogenic+peptide+recognition+by+sorLA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).</li>
<li>Quistgaard, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+bind+to+Sortilin+in+the+tunnel+of+a+ten-bladed+beta-propeller+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain.</a> Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).</li>
<li>Larsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sorCS1+binds+sortilin+and+hampers+its+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions.</a> Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).</li>
<li>Larsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+facilitates+signaling+of+ciliary+neurotrophic+factor+and+related+helical+type+1+cytokines+targeting+the+gp130%2Fleukemia+inhibitory+factor+receptor+beta+heterodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer.</a> Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש במיוחד כדי להדגים את CLC בתיווך sorLA: CLF-1-תלוי downregulation ו ליזוזומלית מיקוד של CNTFRα, כמו גם התגובה נחלש המצורפים CLC: גירוי CLF-1. שורת תא HEK293 היא מתאימה היטב בפרוטוקול זה, כפי שעשה רק ביטוי אנדוגני קטין של CNTFRα ו sorLA, קלים transfect, מפורשת gp130 / LIFRβ, ויש לי גוף תא גדול, אשר מתאים עבור immunocytochemistry. עם זאת, בתאוריה כל שורת תאים בעלי תכונות דומות אמורה לעבוד גם כן. יש הפרוטוקול שני שלבים קריטיים. הראשונה נוגעת לשלב 2.3, שבו המדיום Leu / עידוד חייב להיות מוחלף בערך כל 6 שעות במשך 24 שעות. אי ביצוע הוראה זו עלולה לגרום אנזימים ליזוזומלית פעילים ופחות או לא הצטברות לגילוי חלבון lysosomes. השלב הקריטי השני (3.4) חששות שטיפת אפון-הדגירה מראש עם CLC: CLF-1. זה important כדי להסיר כל ליגנד מאוגד, ולאפשר זמן לתאים להתאושש (הימנעות גירוי המשך) ב DMEM unsupplemented (בינוני ריק). פעולה זו תבטיח רמת רקע נמוכה של pSTAT3 במהלך מחדש הגירוי לאחר מכן עם CLC: CLF-1 (שלב 3.5). יש לציין, איור 6 מראה כי התגובה התאית (pSTAT3) יורדת במקביל downregulation sorLA בתיווך של CNTFRα. יודגש עם זאת, כי למרות תגובה מופחתת בהתאם (וכדי לצפות על) הפחתה של ברכת CNTFRα, שהוא אינו מוכיח כי ביטוי CNTFRα הנמוך לבד מסביר את התגובה התאית המופחתת. לפיכך, שינויים - נובע גירוי מראש או transfection - בכל האלמנטים הפונקציונליים של מסלול איתות זרם pSTAT3 אולי תרמו התגובה השונה. הרעיון הבסיסי של הפרוטוקול אינו מוגבל particu זהמערכת הקולטן Lar. (. כלומר עוד קו התא, נוגדנים אחרים, הליגנדים אחרים, וכו &#39;) על ידי שינוי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את downregulation המושרה ליגנד של קולטנים אחרים גם כן - ללא קשר למעורבות sorLA&#39;s. עם זאת, ראוי לציין כי ניתוח של-downregulation הקולטן על ידי מערבי סופג מתאים בעיקר עבור קולטנים, למשל, קולטנים מעוגני GPI, אשר תערוכת מחזור איטי על מידה נמוכה של סינתזה חדשה בתאי unstimulated. כך, קולטנים מראה רמה גבוהה של סינתזה חדשה, downregulation הנגרמת ליגנד ניתן יהיה לשלם עבור בסינתזה של קולטנים חדשים. בנסיבות אלה, downregulation של ברכת קולטן ניתן לקבוע במקום באמצעות ניסויי תיוג מטבולית ודופק-מרדף כמתואר 21. לחלופין, נוגדנים עם יוד (רצוי Fc-שברים) כי אינם מפריעים קולטן כריכה יכולים לשמש &quot;תג&quot; את ectodomain של receptאו, ואת downregulation הצפוי ניתן לקבוע מכן על ידי ספירת רדיואקטיבי של גלולה ו המדיום הסלולרי. מסיבות לוגיסטיות אנו transfected התאים שלנו עם CNTFRα לבנות נושאת תג Myc, ובסופו של הפרוטוקול הנוכחי נוגדן עכבר אנטי-Myc שימש כתם איתור המערבי של הקולטן. לעומת זאת, נוגדן עז נגד CNTFRα שמש immunocytochemistry וסימון כפול כמו LAMP-1 זוהה על ידי נוגדן עכבר - וכמובן להשתמש של שני נוגדני עכבר ראשיים יגרום מכתים נוקב (חופפים) עם נוגדנים משני. שים לב מאז העז נגד CNTFRα גם עובד במערב סופג (לא מוצג), הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה וכן להחיל תאי transfected עם CNTFRα מתויג. לבסוף, לאחרונה הוכח כי גם sortilin קולטן endocytic נקשר CLC: CLF-1 עם זיקה גבוהה 22. לכן, לא מן הנמנע כי sortilin, כמוsorLA, חיבורים כדי CLC: CNTFRα באמצעות CLF-1 והוא מסוגל לתווך אנדוציטוזה ו ליזוזומלית מיקוד של CNTFRα גם כן. שימוש sortilin במקום sorLA, בפרוטוקול הנוכחי ניתן להשתמש כדי להבהיר את השאלה הזאת.

את CLC ו CLF-1 מהווים שתי יחידות משנה של CLC ציטוקינים heterodimeric: CLF-1 1-3. לזירוז האות הסלולרי, CLC: המטרות הראשונות CLF-1 CNTFRα, הקולטן העיקרי ו GPI מעוגני שלה, להקים קומפלקס trimeric קרום הנכנס. את CLC: CLF-1: מורכבים CNTFRα ובהמשך מגייס gp130 / LIFRβ אשר מתווכת הטרנסממברני איתות באמצעות מתמרים יאנוס קינאז / אותות מטהרי 3 תמלול (JAK / STAT3) מסלול 4. עכברים לקוי בכל אחת משלוש יחידות משנה להציג היינו הך פנוטיפ ולמות תוך 24 שעות לאחר הלידה בשל מספר מופחת של נוירונים פנים 5-8 יונק מספיק. ממצאים בבני האדם גם מדגישים את הלכידות התפקודית של שלוש יחידות המשנה. לפיכך, מוטציות אנושיות (הומוזיגוטי או תרכובת) גרימת תפקוד לקוי של CLC: CLF-1 או CNTFRα, כל תוצאה של תסמונת שמכונה קר הנגרמת הזעה / Crisponi, מצב המאופיין בתסמינים כגון impaiיונק אדום ובליעה, תכונות dysmorphic שונות, דוקרנים טמפרטורה, פרדוקסלית Perfuse מזיעים בטמפרטורות נמוכות 9-11. במבחנה, השילוב של CLC ו CNTFRα הוא גם הכרחי ומספיק אינטראקציה עם gp130 / LIFRβ ואת האינדוקציה של איתות תא 12. תפקידו של CLF-1 מצד שני הוא פחות ברור. הוא לא מעורב ישירות איתות, והפך זה מכבר נחשב כנספח שבעיקר משמש כדי להקל על הפרשת הסלולר של CLC 1. עם זאת, הממצאים אחרונים מראים כי יש CLF-1 פונקציות נוספות ועוד חשובות להפליל הוא איתות המחזור של CLC ו CNTFRα. לפיכך, נראה כי CLF-1 מכיל שלושה אתרי קישור תלויים זה בזה: על הידידות שלה ידוע קשירת CLC; ובכך הוא מתווך ישיר מחייב את CNTFRα; ואתר שלישי (גבוהה זיקה) לאינטראקציה עם קולטן endocytic sorLA. כפי שניהם CLC ו CLF-1 נראה &amp; #160; למקד CNTFRα עם קירבה רבה נמוך CLC: מורכבים CLF-1, ניתן לשער כי CLF-1 (דרך האתר שלה CNTFRα מחייבת) מקדם איחוד CLC ו CNTFRα ובכך מקלה איתות 13. אינטראקציה של CLF-1 עם sorLA, הסוגיה העיקרית של ההצגה הנוכחית, ממלא תפקיד שונה לחלוטין. SorLA הוא אחד מחמשת סוג 1 קולטנים המהווים את המשפחה הקולטן Vps10p-מושלם 14. היא באה לידי ביטוי במגוון של רקמות אך בפרט במוח וברקמות עצביות 15. בדומה לשאר בני המשפחה sorLA נושאת ליגנד N-terminal מחייב Vps10p-מושלם, אבל בנוסף, הוא גם כולל סוגים תחום אחרים כולל אלמנטים ליגנד מחייב למצוא בני משפחת קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה 15. הזנב ציטופלסמית שלה אינטראקציה עם חלבוני מתאם כמה, למשל, מתאם חלבון-1 ו -2, ו sorLA מעבירה endocytos ביותרגם הוא כמו מיון תאי והובלה של חלבונים מאוגדים 16-18. Vps10p-התחום מורכב β-מדחף גדול עשר להב 19,20, אשר נקשר סדרה של הליגנדים קשורים כולל CLF-1 (אך באופן בולט, לא CLC) 13. האתר מחייב CLF-1 הוא נגיש גם לאחר היווצרות מורכבת עם CLC ו CNTFRα כלומר sorLA נקשר לא רק חינם CLF-1, אבל גם CLC: CLF-1 ואת CLC מורכב trimeric: CLF-1: CNTFRα 13. SorLA מעבירה אנדוציטוזה המהירה של CLF-1 ו CLC: CLF-1, אבל אלה הם חלבונים מסיסים ואילו CNTFRα מקובע קרום פני השטח על ידי א-עוגן GPI. השאלה היא אפוא אם עקדת CLC: CLF-1: CNTFRα מאפשר sorLA להפנים את המתחם כולו ובכך לשנות את הביטוי קרום פני CNTFRα (ואת הרגישות הסלולר לאחר CLC: אינדוקציה אות CLF-1), ו / או מחזור של CNTFRα. הניסויים שתוארו בהווהדו&quot;ח נועד להבהיר את השאלות הבאות: האם sorLA לתווך CLC: downregulation CLF-1-תלוי של משטח-קרום CNTFRα? כדי לברר זאת, שזה היה בהתחלה ניסה לקבוע את המחזור של CNTFRα (בהיעדר ונוכחות של sorLA) באמצעות תיוג מטבולית וניסויים הדופק מרדף כמתואר 21. עם זאת, ניסיונות לתייג CNTFRα באמצעות תערובת של [S 35] ציסטאין [S 35] מתיונין הראה התאגדות עניה של רדיואקטיביות. זה הציע תואר נמוך מאוד של סינתזה חדשה, אשר ככל הנראה לא יוכל לפצות על אובדן פתאומי ומשמעותי של קולטנים. כדי לקבוע אם CNTFRα היה downregulated כאשר ביניהם באמצעות CLC: CLF-1 עד sorLA, ולכן הוחלט פשוט למדוד (באמצעות המערבי סופג) בבריכה הסלולר הכולל של CNTFRα לפני ואחרי החשיפה CLC: CLF-1 - ולהשוות תוצאות בתאים transfected או לא טרנספקציה עםsorLA. האם sorLA למקד CNTFRα כדי lysosomes? כדי לענות על שאלה זו, הלוקליזציה של CNTFRα - הפנים באמצעות CLC שלה: CLF-1 בתיווך קשירת sorLA - נבדק באמצעות immunocytochemistry, וסימון עם נוגדנים המכוונים כלפי CNTFRα ואת אנדוזום-מאוחר / ליזוזום סמן ליזוזומלית הקשורים חלבוני ממברנה 1 (LAMP-1). הניסוי בוצע על תאים שטופלו כמו גם מטופלים עם מעכבי אנזימים ליזוזומלית. הרעיון היה כמובן שאם CNTFRα היה מושפל lysosomes, בתאים שטופלו מעכבי אנזים יציגו CNTFRα מכתים המצטבר LAMP-1 שלפוחית ​​חיובית, ואילו בתאים שלא טופלו נראים מעט או ללא מכתים עבור CNTFRα. האם downregulation CNTFRα להפחית את תגובת התאים CLC: CLF-1 גירוי? המתחם trimeric המורכב CLC, CLF-1, ואותות CNTFRα באמצעות heterodimer gp130 / LIFRβ באמצעות STAT3 JAK /נָתִיב. בהתאם לכך, את היכולת של התאים להגיב CLC: CLF-1 איתות על downregulation של CNTFRα שנחקר על ידי זיהוי כתם המערבי ו quantitation של phospho-STAT3 (pSTAT3) / רמת STAT3 סך transfectants sorLA.

<table><tbody><tr><td>Zeocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-zn-1</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B זהב</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 מגיב טרנספקציה&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 815 091 001</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 4 בארות (משטח דלתא Nunclon)Thermo</td> <td>Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle&acute; s בינוני (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F/U1</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco פוספט מי מלח בופר&nbsp; (DPBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>CLC:CLF-1</td><td>R& D Systems</td><td>1151-CL/CF</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד LAMP-1&nbsp;</td><td>DSHP</td><td>H4A3</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-סורLA</td><td></td><td></td><td>התייחסות 16</td></tr><tr><td>עכבר נגד b-actin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-Myc</td><td>Genscript</td><td>A00704</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי-CNTFRa&nbsp;</td><td>מו"פ D Systems</td><td>AF-303</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-pSTAT3&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות סלולרי</td><td>9145s</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-STAT3&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9139s</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מקושר HRP נגד עכבר</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>7076s</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מקושר HRP נגד ארנב</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>7074s</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מקושר HRP נגד עזים</td><td>Dako</td><td>P0160</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד עזים, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד עכברים לחמור, Alexa Fluor 568 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L8511-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Merck</td><td>1,082,191,000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA:Titriplex III</td><td>Merck</td><td>1,084,180,250</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini EDTA-free</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>04 906 837 001</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דגימת LDS (4x)</td><td>Novex</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>VWR</td><td>97,135,000</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>מדיית הרכבה</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr></tbody></table>

sorla ו clc: downregulation clf-1-תלוי של cntfrα כפי שהוכח על ידי המערב סופג, עיכוב של ליזוזומלית אנזימים, ו immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

ציטוקינים heterodimeric ציטוקין Cardiotrophin דמוי: ציטוקין דמוי Factor-1 (CLC: CLF-1) מטרות glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored CNTFRα להקים קומפלקס trimeric כי לאחר מכן הטירונים גליקופרוטאין 130 / לוקמיה מעכבות פקטור קולטן β (gp130 / LIFRβ) לאיתות. שניהם CLC ו CNTFRα נחוצים איתות אך עד כה CLF-1 כבר ידוע רק כמנחה משוערת של הפרשת CLC. עם זאת, לאחרונה הוכח כי CLF-1 מכיל שלושה אתרי קישור: אחד עבור CLC; אחד עבור CNTFRα (שעשוי לקדם הרכבה של מתחם trimeric); ואחד עבור קולטן endocytic sorLA. האתר האחרון מספק זיקה גבוהה המחייבת של CLF-1, CLC: CLF-1, כמו גם את trimeric (CLC: CLF-1: CNTFRα) המורכב sorLA, ובשנת sorLA להביע תאי הליגנדים המסיסים CLF-1 ו CLC : CLF-1 במהירות נלקח והפנים. בתאים שיתוף להביע CNTFRα ו sorLA, CNTFRα הראשון נקשר CLC: CLF-1 כדי ליצורקומפלקס trimeric קרום קשור, אבל זה גם מתחבר sorLA באמצעות האתר בחינם מחייב sorLA ב CLF-1. כתוצאה מכך, CNTFRα, אשר לא ניתן להכניס אנדוציטוזה בכוחות עצמו, הוא נמשך לאורך התפרים והפנימו על ידי אנדוציטוזה בתיווך sorLA של CLC: CLF-1. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הפרוצדורות משמשות כדי להדגים i) sorLA בתיווך CLC: CLF-1-תלוי downregulation ביטוי CNTFRα משטח-קרום; ii) sorLA בתיווך אנדוציטוזה ו ליזוזומלית מיקוד של CNTFRα; ו- III) את תגובת התאים הוריד ל CLC: CLF-1-גירוי על downregulation בתיווך sorLA של CNTFRα.

איור 1 מציג ייצוג סכמטי של זריעת התא CLC: הדגירה CLF-1 בפרוטוקול 1. איור 2 מראה ייצוג סכמטי של זריעת התא Leu / עידוד ו CLC: הדגירה CLF-1 בפרוטוקול 2. איור 3 מראה ייצוג סכמטי של זריעת התא CLC: הדגירה CLF-1 וגירוי באיור 4 פרוטוקול 3. מראה את CLC בתיווך sorLA: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα. איור 5 מראה את ליזוזומלית אנדוציטוזה ו בתיווך sorLA מיקוד של CNTFRα. איור 6 מציג את התגובה הנמוכה כדי CLC: גירוי CLF-1 לאחר downregulation CNTFRα. שים לב להקות מסמל CNTFRα-Myc יש צפיפות דומה בזמן אפס, בעוד downregulation של CNTFRα-Myc מודגם על ידי הלהקה החלשה sorLA transfectants after 5 שעות (איור 4). איור 5 מראה כי CNTFRα-Myc שהצטבר LAMP-1 שלפוחית חיובית של תאים שטופלו Leu / עידוד. בניגוד לכך, לא הצטברות של CNTFRα-Myc נתפסת בתאים לא ליחס Leu / עידוד. מכך ניתן להסיק כי CNTFRα-Myc ממוינת כדי lysosomes והשפילו. כפי שניתן לראות באיור 6, רמת pSTAT3 מצטמצם משמעותית בתאים טרום מגורה לעומת הרמה הממוצעת תאים שלא נחשפו CLC: CLF-1. זהו בהתאם downregulation sorLA בתיווך הנצפה של CNTFRα בתאים טרום מגורה (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig1.jpg" /> איור 1: ייצוג סכמטי של זריעת התא CLC: CLF-1 הדגירה בפרוטוקול 1. זרע HEK293-CNTFRα-Myc ו HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA תאים בשני 4-גם צלחות (0 ו -5 ח) דגירה תאים עם CLC: CLF-1 כמצוין. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig2.jpg" /> איור 2: ייצוג סכמטי של זריעת התא Leu / עידוד ו CLC: CLF-1 הדגירה זרע פרוטוקול 2. HEK293-CNTFRα-Myc / תאים sorLA בשקופיות כיסוי בצלחת 4-היטב דגירה תאים עם או בלי Leu / עידוד ו CLC: CLF-1 כמצוין. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig3.jpg" /> איור 3: </sטרונג&gt; ייצוג סכמטי של זריעת התא CLC: הדגירה CLF וגירוי ב זרע פרוטוקול 3. HEK293 תאים-sorLA בצלחת אחת 4-היטב דגירה תאים עם או בלי CLC: (.-exp מראש) CLF-1 עד downregulate CNTFRα ואחריו CLC: גירוי CLF-1 (. Stim) ליזום זירחון STAT3 כמצוין. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig4.jpg" /> איור 4: תוצאות שהראו כי SorLA מתווכת CLC: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα. (א) HEK293-CNTFRα-Myc ו (ב) HEK293-CNTFRα-Myc / תאי sorLA הודגרו בהעדר (עמודים לבנים) או נוכחות (עמודות אפורות) של CLC 10 ננומטר: CLF-1. אחרי 0 ו5 שעות, הדגירה הופסקו והתוכן של CNTFRα-Myc המדיום (מ &#39;) וב lysates התא (L) זוהתה על ידי מערבי סופג לכמת ידי צפיפות. הפנלים העליונים להראות תוצאות כתם מערביות מניסויים יציגים ונוגעים הפנלים התחתונים מראים את הרמות המזוהות של CNTFRα-Myc נמצאות lysates התא. הרמות מוצגות ביחס לרמת CNTFRα-Myc ב transfectants היחיד והכפול ב 0 h. כל טור מייצג SEM ± הממוצע (n = 3). p-ערכים מחושבים באמצעות מבחן t. לשכפל לאחר נתון מקורי 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig5.jpg" /> איור 5:תוצאות מראה כי SorLA מתווכת אנדוציטוזה ו ליזוזומלית מיקוד של CNTFRα. HEK293-CNTFRα-Myc / תאים sorLA טופלו עם או בלי Leu / עידוד, מודגרות עם 10 CLC ננומטר: CLF-1 עבור 5 שעות, קבוע, ולבסוף מוכתמים באמצעות-CNTFRα אנטי ואנטי-LAMP-1 נוגדנים כמתואר בפרוטוקול 2. ברי סולם: 5 מיקרומטר. לשכפל לאחר נתון מקורי 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig6.jpg" /> איור 6: downregulation בתיווך SorLA של CNTFRα מלווה תגובה תאית הורידה ל CLC: גירוי CLF-1. HEK293 תאים-sorLA מולאו מראש וטופחו על ידי העדר או נוכחות של CLC 10 ננומטר: (.-exp מראש) CLF-1 עבור 5 שעות, מורעבים ב blanבינוני k עבור 90 דקות, ולאחר מגורה עם 5 ננומטר CLC: (. Stim) CLF-1 במשך 15 דקות. (משמאל) העמודות מראות את הרמות היחסיות של pSTAT3 בתאים. כל עמודה מייצגת ממוצע ± SEM (n = 3) ביחס לרמת pSTAT3 בתאים preincubated בהעדר CLC: CLF-1 אך מגורה עם CLC: CLF-1. p-value מחושב באמצעות מבחן t. (מימין) את הכתם המערבי מציגה את התגובה של pSTAT3 ו STAT3 שהושגה בניסוי נציג. לשכפל לאחר נתון מקורי 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד המערבי סופג ו immunocytochemistry בשילוב עם עיכוב של אנזימים ליזוזומלית ניתן להשתמש כדי להדגים את downregulation של פקטור ריסי נוירוטרופי קולטן α (CNTFRα), והיא מועברת על ידי האינטראקציה בין ציטוקין דמוי Factor-1 (CLF-1 ) לבין הקולטן endocytic sorLA.

SorLA ו CLC: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα כפי שהוכח על ידי המערב סופג, עיכוב של ליזוזומלית אנזימים, ו Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

מטרת מצגת זו היא להראות כיצד ניתן להשתמש בכתמים מערביים ואימונוציטוכימיה כדי להדגים את הפחתת הרגולציה וההשפלה הליזוזומלית בתיווך SorLA ו-CLC:CLF-1 של קולטן CNTF בטרנספקטנטים של תאים אנושיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתחלופה של קולטן CNTF המעוגן GPI עם ביטויו המשותף עם הקולטן האנדוציטי SorLA וחשיפה ל-CLC:CLF המחבר בין השניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה מערבת רדיואקטיביות ומתאימה לחלבוני ממברנה המציגים רק מידה קטנה של פירוק ומשתמשים בסינתזה בתאים לא מגורים.השתמש בשיבוטים יציבים של כליה עוברית אנושית 293 טרנספקטנטים המבטאים קולטן CNTF מתויג Myc או קולטן CNTF מתויג Myc ו-SorLA. זרע מספר שווה של תאים בשתי צלחות של ארבע בארות. תרבית התאים במדיום מלא שהוא DMEM בתוספת 10% FBS, פניצילין וסטרפטומיצין באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס.ברגע שהתאים הם 50 עד 80% מתלכדים, הסר את המדיום מהבארות. לאחר שטיפה פעם אחת עם Dulbecco PBS, הוסף מדיום מלא טרי עם או בלי 10 ננו-מולרי CLC:CLF-1 לכל סוג תא בשתי הצלחות. לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר אפס וחמש שעות דגירה, שחזר את המדיום ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצינורות של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסף 1% Triton X-100 lysis buffer בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז לכל באר. לאחר מכן העבירו את התא ליזטים לצינורות של 1.5 מיליליטר.לאחר מכן, סובב את הצינורות המכילים את המדיום ואת התא ליזאט. בסיום, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות של 1.5 מיליליטר והשליכו את הכדורים. העבירו חמישה מיקרוליטרים מכל תא ליזאט סופרנטנט לצינור של 1.5 מיליליטר שישמש למדידת תכולת החלבון.לאחר מכן הוסף מיד מאגר דגימת LDS שאינו מפחית לכל הסופרנטנטים ומערבל את הדגימות. מדוד את תכולת החלבון בסופרנטנטים של ליזאט התא באמצעות בדיקת חלבון מסחרית על פי פרוטוקול היצרן. לאחר מכן, מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.הכניסו כמות שווה של חלבון מכל דגימה להפחתת דף SDS וכתמים מערביים והדמיינו את התוכן של קולטן SorLA, בטא-אקטין וקולטן CNTF מתויג Myc במדיום ובליזטים של התא. כמת את הרצועות הבודדות לפי צפיפות לפי פרוטוקול היצרן. זרע כליה עוברית אנושית 293 תאים שהועברו ביציבות עם קולטן CNTF מתויג Myc ו-SorLA על שקופיות כיסוי בצלחת של ארבע בארות.אפשר לתאים להיצמד למגלשות הכיסוי על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. תרבית התאים במדיום מלא כפי שתואר קודם לכן. ברגע שהתאים מתכנסים ב-20 עד 40%, הוציאו את המדיום מהבארות והוסיפו לתאים, מדיום מלא עם או בלי 50 מיקרוגרם למיליליטר של לופפטין ופפסטין A.לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש להחליף את מדיום הלופפטין והפפסטין A בערך כל שש שעות למשך 24 שעות. כישלון לעשות זאת עלול לגרום לאנזימים ליזוזומליים פעילים ולהצטברות פחות או ללא זיהוי של חלבונים בליזוזומים.לאחר 24 שעות של דגירה, החלף את המדיום והוסף 10 ננו-מולר של CLC:CLF-1. לאחר דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות, שטפו אותם פעם אחת ב-PBS וקבעו אותם ב-4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים פעם אחת ב-PBS, יש לחלחל אותם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ב-0.5% ספונין ב-PBS.לאחר מכן, יש לדלל את הקולטן נגד CNTF של עזים ונוגדנים נגד LAMP-1 של עכברים ב-0.5% ספונין ב-PBS ולדגור על התאים עם הנוגדנים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים ארבע פעמים ב-0.5% ספונין ב-PBS, דגרו אותם עם שישה מיקרוגרם למיליליטר כל אחד של חמור נגד עזים אלקסה 488 וחמור נגד עכבר אלקסה 568 נוגדנים משניים מצומדים ודגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, שטפו את התאים ארבע פעמים ב-0.5% ספונין ב-PBS ופעמיים במים נטולי יונים.לאחר מכן הרכיבו את שקופיות הכיסוי על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות אמצעי הרכבה. לנתח את צביעת הנוגדנים של התאים במיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. זרע תאי SorLA של כליה עוברית אנושית בצלחת של ארבע בארות.תרבית התאים במדיום מלא כפי שתואר קודם לכן. ברגע שהתאים הם 50 עד 80% מתלכדים, הסר את המדיום מהבארות. יש לשטוף פעם אחת ב-PBS ולהוסיף מדיום מלא טרי עם או בלי 10 ננו-מולרי של CLC:CLF-1 לתאים.לאחר דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות, הסר את המדיום. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים במדיום ריק שהוא DMEM ללא תוספת. לאחר הדגירה מחדש למשך 90 דקות, הסר את המדיום והוסף מדיום ריק טרי עם או בלי חמישה ננו-מולרים של CLC:CLF-1.לאחר מכן יש לדגור למשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר במהירות את המדיום ולייז את התאים על ידי הוספת 1% Triton X-100 lysis buffer בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז וקוקטייל מעכב פוספטאז לכל באר. לאחר מכן, העבירו את התא ליזטים לצינורות של 1.5 מיליליטר.לאחר מכן, העבירו חמישה מיקרוליטרים של כל סופרנטנט לצינור של 1.5 מיליליטר שישמש למדידת תכולת החלבון. לאחר מכן הוסף מיד מאגר דגימת LDS שאינו מפחית לכל הסופרנטנטים ומערבל את הדגימות. הוספה מיידית של מאגר הדגימה חשובה כדי לעצור את התגובה ולמנוע דה-פוספורילציה.מדוד את תכולת החלבון של הסופרנטנטים של התא באמצעות בדיקת חלבון מסחרית על פי פרוטוקול היצרן. כעת סוניקציה של כל דגימה בטמפרטורת החדר עד שהם כבר לא צמיגים. לאחר מכן מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.הכניסו כמות שווה של חלבון מכל דגימה לדף SDS ולכתמים מערביים והדמיינו את התוכן של STAT3 זרחני ו-STAT3 הכולל בליזאטים של התא באמצעות הנוגדנים המתאימים נגד STAT3 ונוגדנים משניים המקושרים ל-HRP. הוויסות התלוי ב-CLC:CLF-1 בתיווך SorLA של קולטן CNTF מוצג כאן. שימו לב שהרצועות המייצגות קולטן CNTF מתויג Myc וטרנספקטנטים בודדים מגורים ובלתי מגורים CLC:CLF-1 דומים בשתי נקודות הזמן.לעומת זאת, ויסות נמוך של קולטן CNTF מתויג Myc משתקף על ידי הרצועה החלשה יחסית בטרנספקטנטים כפולים מגורים לאחר חמש שעות. האנדוציטוזיס בתיווך SorLA והמיקוד הליזוזומלי של קולטן CNTF מראים כי קולטן CNTF מתויג Myc הצטבר בשלפוחיות חיוביות LAMP-1 של תאים שטופלו בלויפפטין ופפסטין A. לעומת זאת, לא נראית הצטברות של קולטן CNTF מתויג Myc בתאים שאינם נתונים לטיפול, מה שמדגים כי קולטן CNTF מתויג Myc ממוין לליזוזומים ומתפרק.רמת ה-pSTAT3 מופחתת באופן משמעותי בתאים שעברו גירוי מראש בהשוואה לרמה בתאים שלא נחשפו מראש ל-CLC:CLF-1. זאת בהתאם לוויסות הנמוך שנצפה בתיווך SorLA של קולטן CNTF בתאים המגורים מראש כפי שהוצג קודם לכן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בכתמים מערביים ובאימונוציטוכימיה על מנת להראות את הפחתת הרגולציה והפירוק הליזוזומלי בתיווך SorLA ותלויה ב-CLC:CLF-1 של קולטן CNTF.

sorla-clcclf-1-dependent-downregulation-cntfr-as-demonstrated-western

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Clathrin בתיווך אנדוציטוזה תלוי חלבונים מתאם לתאם מבחר מטען הרכבה מעיל clathrin. כאן אנו מתארים את נוהלי ללמוד מתאם-clathrin אינטראקציה פיזית הדמיה תא חי באמצעות גישות כמודל מתאם endocytic שמרים Sla1p חלבון.

In vivo ו במבחנה של אינטראקציה מתאם-clathrin

כרומטין לולאה משחק תפקיד משמעותי הכונה; עם זאת, היו לא הפיתוחים הטכנולוגיים המאפשרים שינוי סלקטיבית ולא הפיכים של לולאות כרומטין. כאן נתאר מערכת חזקה לארגון מחדש של לולאה כרומטין באמצעות CRISPR-dCas9 (CLOuD9), הדגימו באופן סלקטיבי ובלתי הפיכה לווסת ביטוי גנים-ממוקד לוקוסים.

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לטיהור החלק הדנדריטי-עשיר של השבר הדנדריטים של הגביע phagocytic כמו מבנה בליטה על הנוירונים היפוקמאל תרבותי על ידי ניצול הזיקה הספציפית והחזקה בין מחוגה הדנדריטי מולקולת הדבקה, TLCN ומולקולת מטריקס בעלי מטריצה, vitronectin.

טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר

פרוטוקול זה מאפשר אופטימיזציה ולאחר מכן הדור יעיל של שברים גרעיניים ו cytoplasmic מתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשית. דגימות אלה משמשות כדי לקבוע לוקליזציה חלבונים, כמו גם שינויים בסחר בחלבונים המתרחשים בין התאים הגרעיניים cytoplasmic על גירוי התא וטיפול בסמים.

שבירה משנית של תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשונית לניטור גרעיני/Cytoplasmic סחר בחלבונים

במחקר הנוכחי, הביטוי מופל משני מרכיבי איתות במורד הזרם של מסלול PERK, הקלצינוירין הציטופרוטקטיבי וה- CHOP הפרו-אפופטוטי, באמצעות shRNA ספציפי. בדרכים הפוכות, אלה מווסתים את הרגישות של נוירונים קליפת המוח הראשוניים לניוון עצבי לאחר השראת מתח רשתית אנדופלסמית.

אפנון מולקולרי על ידי shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס בנוירונים סטרס ברשתית האנדופלסמית

מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה-רדיוליגנד ורקמה מטופלת (FACS-RTT) הוא כלי רב עוצמה לחקר תפקידו של חלבון טרנסלוקטור 18 kDa או ביטוי קולטן סרוטונין 5HT2A במחלת אלצהיימר בקנה מידה תאי. פרוטוקול זה מתאר את יישום ex-vivo של FACS-RTT במודל חולדות TgF344-AD.

מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה-רקמה מטופלת רדיוליגנד (FACS-RTT) כדי לקבוע את המקור התאי של אותות רדיואקטיביים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי הנישה הלימבליים האנושיים.

בידוד וזיהוי תאי נישה לימבליים

אלקטרופיזיולוגיה היא תקן הזהב לחקר פעילות תעלות היונים. עם זאת, ישנן גישות חלופיות רבות, כולל שיטות אופטיות. במאמר זה אנו מתארים שיטה לניטור הפעילות של תעלות אניון עשירות בלאוצין המכילות 8 ערוצי אניון (LRRC8) באמצעות שיטה מבוססת העברת אנרגיית תהודה בין תת-יחידות Förster (FRET).

ניטור פעילות חוזרת עשירה בלאוצין המכילה 8 ערוצים (LRRC8/VRAC) באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster עם פליטה רגישה (SE-FRET)

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

מאמר זה מתאר את זיהוי של חלבוני קושרי קרח מצמחי הקפאה-סובלנית דרך ההערכה של פעילות עיכוב-recrystallization הקרח והבידוד הבא של IBPs המקורית באמצעות טיהור זיקה-קרח.

זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה

חקור את תפקידם של SorLA ו-CLC:CLF-1 בהורדת רמת קולטן CNTFRα ובניוותו הליזוזומלית באמצעות מערב סופג ואימונוציטוכימיה בתאי כליה אנושיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של מחזוריות חלבוני קרום.

SorLA ו CLC: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα כפי שהוכח על ידי המערב סופג, עיכוב של ליזוזומלית אנזימים, ו Immunocytochemistry (וידאו) | JoVE Journal

SorLA ו CLC: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα כפי שהוכח על ידי המערב סופג, עיכוב של ליזוזומלית אנזימים, ו Immunocytochemistry

גלה סרטונים נוספים