Name: הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: חקור דינמיקת microtubule בתאי סרטן שד עמידים ל-docetaxel באמצעות מיקרוסקופיית deconvolution ו-GFP-tubulin. שיטה זו מאפשרת הדמיה חיה של התנהגות מיקרוטובולים תחת טיפול תרופתי ומסייעת להבנת מנגנוני עמידות לסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מימון מ-CBCF (ל-ZW).

1. הכנת תאים עבור הדמיה חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות זריעת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תאי סרטן השד MCF-7 נבחרו להתנגדות docetaxel (MCF-7 TXT) וקו תא ההורים שאינם העמיד שלהם (CC MCF-7). תהליך הבחירה מפורט לאפיון שורות תאים שנבחרו אלה תוארו בעבר 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול כל תאים בצלחות תרבות 10 ס&quot;מ על 37 מעלות צלזיוס במדיום מורכב 90% של המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ו -10% בסרום שור העובר (FBS) שיושלם עם חומצות אמינו לא חיוניות. לשמור על המדיום באווירה 2 5% CO. שמור על תאי TXT MCF-7 ב 5 docetaxel ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על coverslips הדמיה לחיות. לעקר 24 מ&quot;מ coverslips זכוכית מצופה פולי- L- ליזין על ידי שטיפה אותם עם אלכוהול 70% ולאחר מכן לחשוף אותם UV למשך הלילה. מניחים את coverslips לתוך צלחת תרבות 6-גם של 35 מ&quot;מ. Plאס coverslip אחד בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום מצלחת התרבות של 10 ס&quot;מ לשטוף את התאים עם PBS. הוסף 0.5 מ&quot;ל של טריפסין-EDTA כדי בצלחת כדי לנתק את התאים מצלחת. הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות צלחת לנטרל את טריפסין בעקבות ניתוק של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים עם hemocytometer כדי לקבוע את מספר הסלולרי ליחידת נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כ 10 5 תאים לכל מבוסס היטב על המספר הנייד ליחידת נפח. אחרי שלחצתי אותו בעדינות, לשים צלחת בחזרה לתוך החממה כדי לאפשר לתאים לצרף את coverslips. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביטוי של טובולין α GFP-tagged <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי assay דינמיקת microtubule, transduce התאים עם GFP-tagged α-טובולין באמצעות שלט תמרת GFP המסחרי (למשל, BacMam) על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי הבאר במשך 36 שעות בתוך חממת תרבית תאי 37 ° C כדי לאפשר comהידבקות plete ו מפגש 60%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח המתאים של GFP-tagged α-טובולין להוסיף כל טוב, על פי המשוואה הבאה: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55027/55027eq1.jpg" /> מספר התאים הוא המספר הכולל המשוער של תאים היטב בעת תיוג ואת PPC הרצוי הוא מספר חלקיקים לכל תא. הערה: מתזמנת את תאי MCF-7 צריכה הכפילה את ספירת התאים מ 10 5 2 x 10 5 עם PPC רצוי של 20, נפח דרושים כל coverslip לכן 40 μL. עבור תאים שונים, היקף מחושב על בסיס הנוסחה לעיל לא יכול להיות הטוב ביותר. ההיקף המדויק צריך להיות מותאם בהתאם לרמת הביטוי בפועל של טובולין GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את פעמים טובולין-α GFP-tagged כמה על ידי היפוך כדי להבטיח פתרון הומוגני. לא מערבולת. הערה: לקבלת השליטה, Null (שליטה) מגיב חסר כל גנטי יונקיםאלמנטים וניתן להשתמש בו כדי לקבוע אפקטי קרינת רקע baculovirus בתיווך פוטנציאליים. פקד תמרת GFP הלא ממוקדת עשוי לשמש גם, אשר יאיר את התא כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום התרבות עם מדיום חדש. הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום חדש ו -40 μL של ה- GFP-tagged α-טובולין היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הצלחת בעדינות כדי לאפשר ערבוב מלא של טובולין-α GFP-tagged עם המדיום לתרבות. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור תרבות דגירה במשך 24 שעות כדי לאפשר את הביטוי של טובולין GFP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Treat עם docetaxel הערה: ניסוי זה היא לבדוק את ההשפעה של docetaxel על חוסר יציבות microtubule דינמי. לפיכך, תאי מטופלים עם הריכוז הרצוי של docetaxel. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני מורכב 90% של DMEM ו -10% של FBS שיושלם עם חומצות אמינו לא חיוניות. השתמש DMEM ללא פנול אדום בגלל פנול אדום עלולים להפריע fluorescence של טובולין GFP. מוסיפים את הריכוז הרצוי של docetaxel (הנעים בין 10 ננומטר ל -10 מיקרומטר). פתרון המניות של docetaxel הוא 10 מ&quot;מ ב sulfoxide דימתיל (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לחמם את המדיום המכיל docetaxel עד 37 ° C בחממה בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום התרבות הנורמלי עם המדיום המכיל docetaxel דגירה במשך 30 דקות ב בתרבית רקמת החממה. לא צריך להיות לפחות 3 coverslips לכל טוב עבור כל ריכוז docetaxel. </li></ol></li></ol> 2. הדמיה חיה לבדיקת חוסר יציבות microtubule דינמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת המערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניסויים בתא שמור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לרכוש תמונות קרינה על ידי זמן לשגות עם מערכת מיקרוסקופית מצויד בעדשה אובייקטיבית 60X, 1.42 NA שמן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תאי הדמיה לחיות. טרום חם הוא לבעל המדגםהמדיום ל -37 מעלות צלזיוס. בחר coverslip לבחון. הר coverslip ריבית על בעל מדגם דגירה זה עם 1 מ&quot;ל של מדיום המכיל-docetaxel מוכן בשלב 1.3.1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה חיה של חוסר יציבות microtubule דינמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את התאים אשר ישמשו הדמיה. הם צריכים להיות שטוחים, יש עוצמת קרינה גבוהה של GFP-טובולין באו לידי ביטוי, ויש מבני microtubule ברורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תא אחד מהקבוצה של חוליות מזוהות משלבים 2.2.1 לבחון תחילה. דגש על אזור הפריפריה של התא המזוהה. הגדר את התכנית עבור זמן חשיפה ואת תדירות רכישה של תמונה. ככל שזמן חשיפה הוא בדרך כלל 0.5 s, התמונות תירכשנה כל שתי שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 20 דקות נוספות עבור צעדים מן 1.33 ל 2.2.3. לכן, בדיוק 50 דקות לאחר תוספת של docetaxel, כמתואר בשלב 1.3.3, להתחיל הדמיה (זה סטנדרטיזציה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ד microtubuleynamics למשך 2 דקות, מצלם כל 2 שניות. בסך הכל, לרכוש 60 תמונות עבור התא המזוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר אל התא הבא מזוהה וחזור על שלבים 2.2.2 עד 2.2.4. חזור על התהליך עד 5 תאים כבר צילמו. זה הכרחי כדי לעשות זאת לפני הזמן מגיע 70 דקות לאחר התוספת של docetaxel, כמתואר בשלב 1.3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תנאי הטיפול, חזור על שלבים 2.2.1 עד 2.2.5 3 coverslips שונים. בסך הכל, תאי 15 תמונה, וזה מספיק נתונים כדי למדוד חוסר יציבות microtubule דינמי. </li></ol></li></ol> 3. עיבוד תמונה וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolution של תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolve התמונות רכשו להשיג באיכות גבוהה. פתח את תכנית deconvolution מצוידת במערכת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;תהליך&quot; ובחר &quot;deconvolve.&quot; גרור את קובץ התמונה אל החלון &quot;קלט&quot; ולחץ על &quot;Do.&quot; קובץ התמונה יהיה deconvolved, ואתקובץ deconvolved יישמר כקובץ חדש באופן אוטומטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דור של קטעי וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על קובץ תמונת deconvolved לפתוח עם תוכנה מאובזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;קובץ&quot; ובחר &quot;שמירה בשם הסרט.&quot; בחר &quot;פורמט הסרט&quot; כמו &quot;AV&quot; ואת &quot;סגנון האנימציה&quot; כמו &quot;קדימה&quot;. בחר את &quot;איכות הדחיסה&quot; ל &quot;100%&quot; ואת &quot;קצב הפריימים&quot; ל &quot;5 / שני.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבה של &quot;הנפשת בזמן&quot; ולחץ על &quot;עשה זאת.&quot; הקליפ יופק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת קיצור microtubule ושיעור הצמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את microtubules אשר ישמש למדידה. עבור כל תא, רק כמה microtubules תוכל להיות הקיצור או הצמיחה שלהם בעקבות ברור ומלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון כל מסגרת של וידאו כדי לזהות את המסגרת המציגה את אורך ההתחלה של א microtubulend המסגרת עם microtubule המורחבת ביותר או מקוצר. מודד את השינוי באורך בין שני microtubules ואת הזמן שחלף בין שתי המסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את קצב צמיחה או קיצור ידי חלוקת השינוי באורך ידי זמן (היחיד הוא מיקרומטר / s). עבור כל תנאי הטיפול, אחרי לפחות 10 תאים ולמדוד לפחות 20 microtubules. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הממוצע ואת סטיית התקן עבור כל תנאי הטיפול. נתח את הבדל סטטיסטי בין תנאי שימוש במבחן הסטודנטים. דווח על הנתונים בטבלה ו / או בתרשים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+cancer+incidence%2C+mortality%2C+and+prevalence+across+five+continents%3A+defining+priorities+to+reduce+cancer+disparities+in+different+geographic+regions+of+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world.</a> J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).</li>
<li>Yardley, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+and+the+role+of+combination+chemotherapy+in+improving+patient+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes.</a> Int J Breast Cancer. 2013, 137414(2013).</li>
<li>Jassem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+and+paclitaxel+versus+fluorouracil%2C+doxorubicin%2C+and+cyclophosphamide+as+first-line+therapy+for+women+with+metastatic+breast+cancer%3A+final+results+of+a+randomized+phase+III+multicenter+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial.</a> J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).</li>
<li>Nabholtz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docetaxel+and+doxorubicin+compared+with+doxorubicin+and+cyclophosphamide+as+first-line+chemotherapy+for+metastatic+breast+cancer%3A+results+of+a+randomized%2C+multicenter%2C+phase+III+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial.</a> J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).</li>
<li>Zelnak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+taxane+and+anthracycline+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Overcoming taxane and anthracycline resistance.</a> Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).</li>
<li>Rivera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+anthracycline-resistant+and+taxane-resistant+metastatic+breast+cancer+and+new+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options.</a> Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).</li>
<li>Longley, D. B., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15641020">Molecular mechanisms of drug resistance.</a> J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).</li>
<li>Downing, K. H., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+structure+of+tubulin%3A+implications+for+dynamics+and+drug+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct.Funct%22%5BJournal%5D)">Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding.</a> Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).</li>
<li>McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxanes%2C+microtubules+and+chemoresistant+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.Biophys.Acta%22%5BJournal%5D)">Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer.</a> Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).</li>
<li>Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microtubule+dynamic+instability+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of microtubule dynamic instability in living cells.</a> Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).</li>
<li>Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+and+resistance+to+tubulin-binding+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules and resistance to tubulin-binding agents.</a> Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).</li>
<li>Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microtubule+protofilament+number+induced+by+Taxol+binding+to+an+easily+accessible+site.+Internal+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics.</a> J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).</li>
<li>Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxanes%3A+microtubule+and+centrosome+targets%2C+and+cell+cycle+dependent+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action.</a> Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+underlying+acquired+resistance+to+taxanes+in+selected+docetaxel-resistant+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 14 (37), (2014).</li>
<li>Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetics+of+target+genes+across+doxorubicin+disposition+pathway%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review.</a> Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).</li>
<li>Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxane+resistance+in+breast+cancer%3A+mechanisms%2C+predictive+biomarkers+and+circumvention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat.Rev%22%5BJournal%5D)">Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies.</a> Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).</li>
<li>Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BetaIII-tubulin+induces+paclitaxel+resistance+in+association+with+reduced+effects+on+microtubule+dynamic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability.</a> J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).</li>
<li>Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+tyrosinated+alpha-%2C+beta%28III%29-%2C+and+beta%28IV%29-tubulin+isotypes+in+paclitaxel-resistant+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).</li>
<li>Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+class+I+beta-tubulin+sensitizes+Taxol-resistant+breast+adenocarcinoma+cells+harboring+a+beta-tubulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation.</a> Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).</li>
<li>Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+of+drug-resistant+MCF-7+cells%3A+implications+for+relation+to+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother.Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins.</a> Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).</li>
<li>Hembruff, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+drug+transporters+and+drug+accumulation+in+the+temporal+acquisition+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance.</a> BMC.Cancer. 8, 318(2008).</li>
<li>Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dynamic+instability+of+steady-state+microtubules+in+vitro+by+video-enhanced+differential+interference+contrast+microscopy+with+an+appendix+by+Emin+Oroudjev%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev.</a> Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).</li>
<li>Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+in+vivo%3A+a+test+of+mechanisms+of+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover.</a> J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).</li>
<li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy%3A+rate+constants+and+transition+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li>
<li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polymerization+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).</li>
<li>Walczak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+and+tubulin+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ישנן שתי שיטות עיקריות למדידת חוסר יציבות microtubule דינמי: במבחנה in vivo. בשיטה במבחנה, טובולין מטוהר משמש למדידת חוסר יציבות microtubule דינמית עם מיקרוסקופיה מחשב משופר זמן לשגות הפרש התערבות ניגודיות. בשיטת in vivo, microinjected טובולין ניאון, או הביע GFP-טובולין, הוא שולב microtubules. הדינמיקה (צמיחה וקיצור) של microtubules נרשמת לאחר מכן על ידי זמן לשגות באמצעות מצלמה רגישה באזור הפריפריה של תאים שלב 10,</s...

<html> הגורם המוביל לתמותה מסרטן השד הוא באמצעות גרורות 1, 2. Taxanes, כגון docetaxel ו- paclitaxel, משמש כיום כקו ראשון משטר לטיפול בסרטן השד גרורתי 2, 3, 4, 5, 6. הם חלק מהקבוצה של סוכני מיקוד-microtubule (MTAs) משבשי דינמיקת microtubule. עם זאת, אחד האתגרים הגדולים ביותר באמצעות taxanes בטיפול מרפא הוא הפיתוח של התנגדות taxane בתאים סרטניים, אשר מובילה למחלות ישנות 7. עמידות לתרופות אחראית ליותר מ -90% מכלל מקרי המוות בקרב חולי סרטן שד גרורתי 7. Microtubules נוצרות על ידי פילמור של heterodimers α- ו β טובוליןclass = &quot;Xref&quot;&gt; 8, 9. ההתקנה המדויקת של דינמיקת microtubule חשובה תפקודים תאיים רבים, כולל קיטוב תא, התקדמות מחזור התא, תחבורה תאית, ואיתות תא. חוסר וויסות של microtubules והדינמיקה שלהם ישבש תפקוד התא לגרום מוות של תאים 10, 11. תלוי איך הם לגרום חוסר וויסות זה, תרופות MTA ניתן לסווג גם כסוכני ייצוב microtubule (כלומר, taxanes) או סוכני microtubule-destabalizing (כלומר, אלקלואידים וינקה או באתר קולכיצין סוכנים מחייב) 20. למרות ההשפעות שלהם הפוכות על מונית microtubule, במינון מספיק, כיתות שניהם יכולות להרוג תאים סרטניים באמצעות השפיע על דינמיקת microtubule 21. Taxanes לתפקד בעיקר על ידי ייצוב microtubule ציר 12, המובילחוסר תיאום כרומוזומליות. ההפעלה התמידית הבאה של מחסום הרכבת ציר (SAC), עוצרת את תא מיטוזה. מעצר mitotic ממושך ואז גורם לאפופטוזיס 13, 14. Taxane אינטראקציה עם microtubules דרך האתר taxane מחייב על β טובולין 8, 15, אשר שוהה רק טובולין התאספו 16. מנגנונים מרובים להתנגדות taxane הוצעו 9, 17. מנגנונים אלה כוללים הן התנגדות multidrug כללית בשל ביטוי יתר של חלבונים-בזרימת סמים taxane ספציפי התנגדות 5, 9, 18, 19. לדוגמא, תאים סרטניים עמיד taxane יש בו כדי לשנות ביטוי ותפקוד של β-גיגית מסוימתulin isotypes 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. באמצעות שיטה in vivo למדוד חוסר יציבות microtubule דינמי, אנו מראים כי, כאשר בהשוואה ללא-עמיד, תאי CC MCF-7 הוריה 17, דינמיקת microtubule של תאי docetaxel העמיד MCF-7 TXT הן רגישה לטיפול docetaxel. כדי להבין טוב יותר את הפונקציה של MTAs ואת המנגנון המדויק של התנגדות taxane בתאים סרטניים, זה הכרחי למדוד דינמיקת microtubule. כאן אנו מדווחים שיטה in vivo לעשות זאת. באמצעות הדמיה חיה בשילוב עם ביטוי של טובולין-tagged GFP בתאים, אנו יכולים למדוד את הדינמיקה microtubule של TXT MCF-7 ותאי CC MCF-7 עם ואינטרנטthout טיפול docetaxel. התוצאות יכולות לעזור לנו לעצב תרופות יעילות יותר שיכול להתגבר על התנגדות taxane.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100x)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>docetaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01885-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM פנול ללא אדום</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10613</td><td>מגיב מפתח לביטוי GFP tubulin בתאים</td></tr><tr><td>מגיב CellLight *BacMam 2.0* GFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B10383</td><td>בקרת</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'+B9:AA9</td><td>472301</td><td>להסרת decetaxel</td></tr><tr><td>22 מ"מ זכוכית coveslip</td><td>Fisher Scientifics</td><td>12-545-101</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 6 בארות</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>6 Well Celi Culture Plate</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision Microscopy Imaging Systems</td><td>GE Health</td><td></td><td>מערכת זו מצוידת בתחנת מזג אוויר לבקרת טמפרטורה ו-CO2. הוא מצויד גם בתוכנת Worx לדה-קונבולוציה ובקרת זמן-lapse.</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>סט המציטומטר בקו בהיר, Hausser Scientific</td><td>Hausser Scientific, מופץ על ידי VWR</td><td>מס' ספק: 1492 VWR מס': 15170-172</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

טקסאנים כגון דוסטקסל שייכים לקבוצה של חומרים מכווני מיקרו-צינוריות (MTAs) שבדרך כלל מסתמכים עליהם לטיפול בסרטן. עם זאת, עמידות לטקסאן בתאים סרטניים מפחיתה באופן דרסטי את יעילות השימוש ארוך הטווח בתרופות. עדויות מצטברות מצביעות על כך שהמנגנונים העומדים בבסיס עמידות לטקסאן כוללים הן מנגנונים כלליים, כגון התפתחות עמידות לתרופות מרובות עקב ביטוי יתר של חלבוני פליטת תרופות, והן מנגנונים ספציפיים לטקסן, כגון אלה הכוללים דינמיקה של מיקרו-צינורות. 
מכיוון שטקסנים מכוונים למיקרו-צינורות תאים, מדידת חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות היא צעד חשוב בקביעת מנגנוני העמידות לטקסנים ומספקת תובנה כיצד להתגבר על עמידות זו. בניסוי נעשה שימוש בשיטת in vivo למדידת אי יציבות דינמית של מיקרו-צינורות. α-טובולין מתויג GFP בא לידי ביטוי ושולב במיקרו-צינורות בתאי MCF-7, מה שמאפשר הקלטה של דינמיקת המיקרו-צינורות על ידי קיטועי זמן באמצעות מצלמה רגישה. התוצאות הראו כי בניגוד לתאי MCF-7CC ההורים שאינם עמידים, הדינמיקה המיקרו-צינורית של תאי MCF-7TXT עמידים לדוסטקסל אינה רגישה לטיפול בדוסטקסל, מה שגורם לעמידות למעצר מיטוטי ואפופטוזיס המושרה על ידי דוסטקסל. מאמר זה יתאר את שיטת in vivo למדידת אי יציבות דינמית של מיקרו-צינורות.

באמצעות הפרוטוקול המובא כאן, חקרנו את ההשפעות של docetaxel על הדינמיקה microtubule של הנורמה (CC MCF-7) ו- docetaxel עמיד (MCF-7 TXT) תאי סרטן השד. שני סטים של תמונות להראות את ההשפעות של docetaxel (0.5 מיקרומטר) על צמיחה microtubule וקיצור ב CC MCF-7 ו MCF-7 תאים TXT (איור 1 א). אנחנו גם...

במאמר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול המתאר שיטה in vivo למדידת חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות בתאי סרטן שד עמידים לדוסטקסל (MCF-7TXT). בשיטה זו משתמשים במערכת הדמיה של מיקרוסקופיה דה-קונבולוציה כדי לזהות את הביטוי של GFP-tubulin בתאי מטרה.

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא למדוד חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות בתאי סרטן שד עמידים לדוסטקסל. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא על אי יציבות דינמית של מיקרו-צינוריות בתנאים פיזיולוגיים, ובעקבות טיפולים תרופתיים שונים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם בכך שהיא מספקת פרוטוקול פשוט, אמין וישים מבחינה פיזיולוגית לחקר דינמיקת מיקרו-צינורות בתאים חיים.לפני תחילת ההליך, גדל את תאי סרטן השד במדיום תרבית שלם בכלי תרבית של 10 סנטימטר ב-37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו חמצני לדרגת המפגש המתאימה. יום לפני הניסוי יש לשטוף את החלקות הזכוכית המצופות 24 מילימטר פולי ליזין עם 70% אלכוהול ולחשוף את ההחלקות לאור UV למשך הלילה. למחרת בבוקר, הניחו פתק כיסוי אחד לכל באר של צלחת שש בארות.לאחר מכן שטפו את התרביות עם PBS, ונתקו את התאים בכל מנה עם 0.5 מיליליטר טריפסין EDTA. כאשר התאים החלו להתרומם מתחתית הצלחת, נטרלו את הטריפסין עם חמישה מיליליטר של מדיום תרבית טרי וספרו את התאים. לאחר מכן הוסף בערך פעם אחת 10 את התאים החמישיים לכל החלקת כיסוי, נער את הצלחת בעדינות והחזיר את התאים לחממה למשך 36 שעות לפחות.כדי לבחון את הדינמיקה של המיקרו-צינוריות של התאים, תמיסת מלאי אלפא טובולין מתויגת GFP מספר פעמים על ידי היפוך כדי להבטיח תמיסה הומוגנית ללא מערבולת. לאחר מכן החלף את מדיום התרבות בכל באר בשני מיליליטר של מדיום טרי המכיל 40 מיקרוליטר של התג טובולין. יש לנער את הצלחת בעדינות כדי לאפשר ערבוב מוחלט של הסמן עם מדיום התרבות ולהחזיר את הצלחת לחממה למשך 24 שעות נוספות.למחרת, החלף את מדיום התרבות במדיום טרי המכיל דוסטקסל והחזיר את הצלחת לחממה למשך 30 דקות. בזמן שהתאים מעוכבים, הפעל את המיקרוסקופ הקרינה ההפוך, וחמם מראש את מחזיק הדגימה ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן בחר את עדשת אובייקט השמן 60X 1.42 NA והרכיב את החלקת הכיסוי הראשונה על מחזיק המדגם.כסו את הדגימה במיליליטר אחד של דוסטקסל טרי של 37 מעלות צלזיוס המכיל מדיום ואתרו מקבץ של תאים שטוחים המציגים עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה של אלפא טובולין מתויג GFP עם מבני מיקרו-צינורות גלויים בבירור. התמקדו באזור ההיקפי של אחד התאים באשכול, והגדירו את זמן החשיפה המתאים בתדר קליטת התמונה. בדיוק 50 דקות לאחר הוספת המנה הראשונה של דוסטקסל, התחילו לתעד את הדינמיקה של המיקרו-צינוריות במשך שתי דקות, וקבלו תמונה כל שתי שניות.לאחר שכל התמונות נרכשו, דמו את התא הבא כפי שהודגם זה עתה, עד שנלכדו תמונות של חמישה תאים בסך הכל מכל שלושת הבארות של כל ריכוז דוסטקסל. לאחר שכל התמונות נרכשו עבור כל ריכוז מעכב, פתח את תוכנית הדה-קונבולוציה, בתוך מערכת המיקרוסקופ ולחץ על תהליך. לאחר מכן, בחר deconvolve וגרור את קובץ התמונה לחלון הקלט.לחץ על do כדי לבטל את הפיתול של התמונה, ופתח את קובץ התמונה המפותל בתוך תוכנת המיקרוסקופ. לחץ על קובץ ושמור כסרט. הגדר את פורמט הסרט כ-AV ואת סגנון ההנפשה כקדימה.הגדר את איכות הדחיסה ל-100% ואת קצב הפריימים לחמישה לשנייה. לאחר מכן סמן את התיבה הנפשה דרך הזמן ולחץ על עשה זאת כדי ליצור את הסרטון. בניסוי מייצג זה, תאי סרטן שד רגילים ועמידים לדוסטקסל טופלו בדוסטקסל וצולמו כפי שהודגם זה עתה, אך השפעות הטיפול על צמיחת המיקרו-צינוריות והתקצרותן, ניכרות ביותר בתאים שאינם עמידים לדוסטקסל.ואכן, מדידת קצב הצמיחה והקיצור של מיקרו-צינוריות בתנאי טיפול דוסטקסל מיקרו-מולאריים של 0.5 מגלה עיכוב חזק של דינמיקת הטובולין של תאים הוריים אך לא עמידים לדוסטקסל. לאחר השליטה, ניתן להשלים את התהליך כולו תוך 60 שעות אם הטכניקות מבוצעות כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור תאים שטוחים, עם עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה של GFP tubulin, ולהפחית הן את עוצמת הקרינה העירור והן את משך החשיפה כדי למנוע דהייה של הקרינה GFP.מאז פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה של התא והסרטן להעריך את ההשפעות של חומרים מכוונים שונים למיקרו-צינורות על תאים נורמליים וסרטניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות בתאים חיים במגוון תנאים.

live-imaging-to-study-microtubule-dynamic-instability-taxane

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מודל עכבר ניסיוני של גרורות בעצמות הוקמה בעקבות משלוח intracardiac של בלוציפראז להביע תאים סרטניים החלב. התפתחות הגידול נבע הנגע osteolytic נוטרו longitudinally עם פליטת אור מיקרו CT הדמיה.

ניטור גרורות סרטן ונגעים Osteolytic עם פליטת אור CT ו - Micro Imaging

אנו מתארים שיטה לתגובת הדמיה לטיפול נגד...

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

על ידי שימוש בעכברים מדווחים טרנסגניים ותוויות פלואורסצנטיות הניתנות להזרקה, מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב תוך-חיוני לטווח ארוך מאפשרת הדמיה ישירה של התנהגות התאים המיאלואידיים לאדנומה של המעי הגס במודל סרטן המעי הגס Apc Min/+.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת Apc מינימום / + מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

כאן, אנו מתארים שיטה של מיקרוסקופיה ארוכת טווח כדי לעקוב לאורך תאים בודדים בתגובה לטיפולים אנטי-סרטניים.

מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד Therapeutics אנטי-סרטניות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

כאן, אנו מציגים את ניטור בזמן אמת של נדידת תאים בשיטת ריפוי פצע באמצעות תאי האפיתל של השד מדולדל TIP60 MCF10A. היישום של טכניקות הדמיה לחיות תאים בפרוטוקול שלנו מאפשר לנו נתח והמחש תא בודד תנועה בזמן אמת ולאורך זמן.

הדמיה חיה של נדידת תאים אפיתל השד לאחר דלדול ארעית של TIP60

הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

אנו מדווחים על טכניקה המאפשרת הדמיה חיה של דינמיקה של מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה (GBM) הפולשים לרקמת מוח של בעלי חוליות. צימוד ההזרקה האורתוטופית של תאי GBM המתויגים באופן פלואורסצנטי למוח שקוף של דגי זברה עם הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה מאפשר מדידה של דינמיקת השלד הציטוסקולרי במהלך פלישת סרטן באתרו .

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

חקור דינמיקת microtubule בתאי סרטן שד עמידים ל-docetaxel באמצעות מיקרוסקופיית deconvolution ו-GFP-tubulin. שיטה זו מאפשרת הדמיה חיה של התנהגות מיקרוטובולים תחת טיפול תרופתי ומסייעת להבנת מנגנוני עמידות לסרטן.

הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

גלה סרטונים נוספים