הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא למדוד חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות בתאי סרטן שד עמידים לדוסטקסל. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא על אי יציבות דינמית של מיקרו-צינוריות בתנאים פיזיולוגיים, ובעקבות טיפולים תרופתיים שונים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם בכך שהיא מספקת פרוטוקול פשוט, אמין וישים מבחינה פיזיולוגית לחקר דינמיקת מיקרו-צינורות בתאים חיים.

לפני תחילת ההליך, גדל את תאי סרטן השד במדיום תרבית שלם בכלי תרבית של 10 סנטימטר ב-37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו חמצני לדרגת המפגש המתאימה. יום לפני הניסוי יש לשטוף את החלקות הזכוכית המצופות 24 מילימטר פולי ליזין עם 70% אלכוהול ולחשוף את ההחלקות לאור UV למשך הלילה. למחרת בבוקר, הניחו פתק כיסוי אחד לכל באר של צלחת שש בארות.

לאחר מכן שטפו את התרביות עם PBS, ונתקו את התאים בכל מנה עם 0.5 מיליליטר טריפסין EDTA. כאשר התאים החלו להתרומם מתחתית הצלחת, נטרלו את הטריפסין עם חמישה מיליליטר של מדיום תרבית טרי וספרו את התאים. לאחר מכן הוסף בערך פעם אחת 10 את התאים החמישיים לכל החלקת כיסוי, נער את הצלחת בעדינות והחזיר את התאים לחממה למשך 36 שעות לפחות.

כדי לבחון את הדינמיקה של המיקרו-צינוריות של התאים, תמיסת מלאי אלפא טובולין מתויגת GFP מספר פעמים על ידי היפוך כדי להבטיח תמיסה הומוגנית ללא מערבולת. לאחר מכן החלף את מדיום התרבות בכל באר בשני מיליליטר של מדיום טרי המכיל 40 מיקרוליטר של התג טובולין. יש לנער את הצלחת בעדינות כדי לאפשר ערבוב מוחלט של הסמן עם מדיום התרבות ולהחזיר את הצלחת לחממה למשך 24 שעות נוספות.

למחרת, החלף את מדיום התרבות במדיום טרי המכיל דוסטקסל והחזיר את הצלחת לחממה למשך 30 דקות. בזמן שהתאים מעוכבים, הפעל את המיקרוסקופ הקרינה ההפוך, וחמם מראש את מחזיק הדגימה ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן בחר את עדשת אובייקט השמן 60X 1.42 NA והרכיב את החלקת הכיסוי הראשונה על מחזיק המדגם.

כסו את הדגימה במיליליטר אחד של דוסטקסל טרי של 37 מעלות צלזיוס המכיל מדיום ואתרו מקבץ של תאים שטוחים המציגים עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה של אלפא טובולין מתויג GFP עם מבני מיקרו-צינורות גלויים בבירור. התמקדו באזור ההיקפי של אחד התאים באשכול, והגדירו את זמן החשיפה המתאים בתדר קליטת התמונה. בדיוק 50 דקות לאחר הוספת המנה הראשונה של דוסטקסל, התחילו לתעד את הדינמיקה של המיקרו-צינוריות במשך שתי דקות, וקבלו תמונה כל שתי שניות.

לאחר שכל התמונות נרכשו, דמו את התא הבא כפי שהודגם זה עתה, עד שנלכדו תמונות של חמישה תאים בסך הכל מכל שלושת הבארות של כל ריכוז דוסטקסל. לאחר שכל התמונות נרכשו עבור כל ריכוז מעכב, פתח את תוכנית הדה-קונבולוציה, בתוך מערכת המיקרוסקופ ולחץ על תהליך. לאחר מכן, בחר deconvolve וגרור את קובץ התמונה לחלון הקלט.

לחץ על do כדי לבטל את הפיתול של התמונה, ופתח את קובץ התמונה המפותל בתוך תוכנת המיקרוסקופ. לחץ על קובץ ושמור כסרט. הגדר את פורמט הסרט כ-AV ואת סגנון ההנפשה כקדימה.

הגדר את איכות הדחיסה ל-100% ואת קצב הפריימים לחמישה לשנייה. לאחר מכן סמן את התיבה הנפשה דרך הזמן ולחץ על עשה זאת כדי ליצור את הסרטון. בניסוי מייצג זה, תאי סרטן שד רגילים ועמידים לדוסטקסל טופלו בדוסטקסל וצולמו כפי שהודגם זה עתה, אך השפעות הטיפול על צמיחת המיקרו-צינוריות והתקצרותן, ניכרות ביותר בתאים שאינם עמידים לדוסטקסל.

ואכן, מדידת קצב הצמיחה והקיצור של מיקרו-צינוריות בתנאי טיפול דוסטקסל מיקרו-מולאריים של 0.5 מגלה עיכוב חזק של דינמיקת הטובולין של תאים הוריים אך לא עמידים לדוסטקסל. לאחר השליטה, ניתן להשלים את התהליך כולו תוך 60 שעות אם הטכניקות מבוצעות כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור תאים שטוחים, עם עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה של GFP tubulin, ולהפחית הן את עוצמת הקרינה העירור והן את משך החשיפה כדי למנוע דהייה של הקרינה GFP.

מאז פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה של התא והסרטן להעריך את ההשפעות של חומרים מכוונים שונים למיקרו-צינורות על תאים נורמליים וסרטניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות בתאים חיים במגוון תנאים.