Name: הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: למד כיצד להקים תאים טטרפלואידיים פרוליפרטיביים מפיברובלסטים אנושיים לא ממומרים ללא אוכלוסייה דיפלואידית. השיטה משתמשת בדמקולצין ובשיטת shake-off לחקירת אי-יציבות כרומוזומלית ומנגנוני קרצינוגנזה מוקדמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לגברת מטסומוטו על הסיוע הטכני.

1. תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג את התאים כדי לגרום tetraploidy. נכון להיום זה כבר אישר כי טכניקה זו יכולה להיות מיושם על שורות תאים פיברובלסטים האדם TIG-1, ב&quot;ג, IMR-90 ו טלומרז-הנציח TIG-1 (TIG-HT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בינוניים מינימום הכרחי עם שינוי α או בכל מדיום תרבית תאים אחר מתאים לסוג התא להיחקר בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עובר חום מומת (FBS) על ידי דוגרי 5% (v / v) CO 2 אווירה על 37 מעלות צלזיוס. תאים מעבר כל 3 או 4 ימים לא יעלו על צפיפות subconfluent. הערה: רמת הכפלת אוכלוסייה (PDL) יש לחשב כל פעם passaging להעריך צמיחת תאים וגיל התא. PDL ניתן לחשב את מספר הסלולרי זורעים לתוך צלחת (N1) ואת מספר הסלולרי שנקטפו על passaging הבא (N2) באמצעות הנוסחה הבאה (X הוא PDL הראשוני). PDL = X + (יומן N1 - יומן N2) / log 2 </li></ol> 2. אינדוקציה אסטהblishment של תאים tetraploid מ דיפלואידי פיברובלסטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות tetraploidy ללא פעמי לרעוד. הערה: זני תא מסוימים (למשל ב TIG-1) יכולה להיות כמעט לחלוטין tetraploid ידי טיפול רציף עם demecolcine (DC) כדלקמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי המעבר לתוך צלחות 100 מ&quot;מ אחד או שניים ביום לפני הטיפול כדי לגרום tetraploidy. בדרך כלל, להכין 5 x 10 5 כדי 1 x 10 6 תאים לכל צלחת לזירוז של תאים tetraploid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את התאים גדלו באופן אקספוננציאלי עם מדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר DC במשך 4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף DC-המכיל בינוני עם בינוני נקי מסמים דגירה תאים באווירה 5% (v / v) CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. תאים בדרך כלל לחדש התפשטות בתוך 1 בשבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות tetraploidy עם פעמי לרעוד. הערה: רוב התאים להיות תערובת של אוכלוסיות דיפלואידי ו tetraploid כתוצאה של טיפול פשוט עם DC שתוארו לעיל (2.1). לכן, כמה שינויים של procedure לחסל אוכלוסייה דיפלואידי נחוצה כדלקמן (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר לכמה T75 צלוחיות יום לפני הטיפול כדי לגרום tetraploidy. בדרך כלל, להכין לפחות 5 x 10 6 תאים (1 x 10 6 תאים לכל בקבוק) לזירוז של תאים tetraploid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את התאים גדלו באופן אקספוננציאלי עם מדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר DC עבור 16 - 18 שעות כדי לעצור תאי מיטוזה. כמה הזמן נדרש לעצור תאי מיטוזה יכול להיות תלוי בתאי יעד צריך להיקבע על ידי ניסויים ראשוניים להשיג כמה שיותר תאי mitotic ככל האפשר. לדוגמא, תאים גדלו לאט ומחייבים DC במשך זמן ארוך יותר מאשר תאים גדלו מהר. הערה: אם תאי מטופלים במשך זמן רב מדי בשלב זה, הם עלולים לעבור חלקת mitotic ו לדבוק פני הצלחת, כך שלא ניתן לאסוף תאי mitotic בשל רעידה פעמית בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים mitotic נעצר DC בשיטת שייק פעמי, ב ש&quot;שich רופף דבקה התאים mitotic נאספים על ידי רעד עדין של צלוחיות ושטיפה עם המדיום ואחריו צנטריפוגה (300 XG, 5 דק &#39;). ספירת מספר סלולארי על ידי שיטה מתאימה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reseed התאים mitotic שנאספו לתוך הכלים תרבות 60 מ&quot;מ לטפל בתאים עם 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DC עבור 3 ימים נוספים. זרעים יותר מ 1 x 10 6 תאים mitotic לכל צלחת, כי פחות מ -10% של התאים יכולים לשרוד את הטיפול הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף DC-המכיל בינוני עם בינוני נקי מסמים ולחכות תאים לחדש התפשטות, אשר מתרחשת בדרך כלל בתוך 1 בשבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר דומה לתאי דיפלואידי מקוריים. </li></ol> בחינת 3. DNA ploidy הערה: זהו הליך ומבוסס מדריך טכני יש להפנות עבור נהלים מפורטים ועצות טכניות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים (5 x 10 5 - 1 x 10 6) על ידי תאים דוגרים עם קון פתרון0.05% taining טריפסין 0.02% EDTA במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולנטרל טריפסין על ידי בינוני המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים בינוני לשטוף אותם על ידי resuspending ב 5 מ&quot;ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS) ואחריו צנטריפוגה (300 XG, 5 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תאים לניתוח ה- DNA על ידי אחד משתי השיטות הבאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה לניתוח תאים מבולבלים 10 הערה: שיטה זו יכולה להתבצע באמצעות ערכה זמינה מסחרי עבור ניתוח מחזור התא. דוגמאות שהוכנו בשיטה זו יש לנתח מיד, כי התאים אינם קבועים בהליך ומוכתמת גרעינים חשוף לנזק לאורך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם חיץ ציטראט 40 מ&quot;מ המכיל סוכרוז 250 מ&quot;מ. בהמשך לטיפול בתאים עם 250 μL של 0.1% (v / v) P40 Nonidet ו -30 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​טריפסין ב 200 μL של חיץ ציטראט 40 מ&quot;מ המכיל 250 סוכרוז מ&quot;מ במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של 0.5 מיקרוגרם / Inh טריפסין מ&quot;לibitor ו -0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​RNase א &#39;40 מ&quot;מ חיץ ציטראט המכילים סוכרוז 250 מ&quot;מ, ו דגירה התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​יודיד propidium (PI) במאגר ציטראט 40mm המכיל סוכרוז 250 מ&quot;מ, ו דגירה התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להכתים גרעין התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה לניתוח תאים קבועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים עם 80% אתנול על ידי השעיית התאים 1 מ&quot;ל של PBS, הוספת 4 מ&quot;ל של dropwise 100% EtOH תוך ערבוב ההשעיה תא ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. תאים מקבעים זה יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים על ידי resuspending אותם 5 מ&quot;ל של PBS ואחריו צנטריפוגה (300 XG, 5 דק &#39;). פנקו את התאים עם 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNase A ו- להכתים אותם עם 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​יודיד propidium (PI) (475 μL של 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNase A ו- 25 μL של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PI) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את תוכן ה- DNA של tהוא התאים באמצעות cytometer זרימה עם לייזר 488 ננומטר מסנן פליטה במסלול האדום (ארוכה לעבור&gt; 610 ננומטר). לנתח מדגם התייחסות מוכן מתאי דיפלואידי אמיתי בעת ובעונה אחת כדי להעריך ploidy של התאים היעד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להוסיף חרוזים תקן הקרינה להעריך את יחס עוצמת הקרינה של תאים דיפלואידי מול חרוזים. השתמש &#39;גובה הדופק לעומת רוחב דופק&#39; אפשרות של זרימת cytometer להפלות בין תאים tetraploid יחיד גושים של תאים דיפלואידי 11. </li></ol></li></ol> בחינת 4. רוזני כרומוזום וניתוח קריוטיפ הערה: כל אלה הם הליכים ומבוססים מדריך טכני או הפרוטוקולים של היצרן יש להפנות עבור נהלים מפורטים ועצות טכניות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים גדל באופן אקספוננציאלי עם 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DC עבור 4 שעות לעצור תאים metaphase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שקופיות כרומוזום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; קציר תאים (לפחות 5 x 10 5 תאים) על ידי trypsinization ו להשעות במדיום המכיל FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים במדיום (300 XG, 5 דק &#39;) ולטפל עם פתרון hypotonic (5 מ&quot;ל של 0.075 KCl M) על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון ו להשעות תאים המקבעים של Carnoy (מתנול: חומצה אצטית = 3: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים תאים על גבי זכוכית נושאת על ידי הטלת בנפח קטן (25 - 35 μL) של ההשעיה תא. צעדים נוספים כמו חשיפת אדים חמים עשויים להיות נחוצים כדי לשפר את כרומוזום מתפשטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאים עבור ספירת כרומוזום או ניתוח קריוטיפ או קרינת ססגוניות הכלאה באתרו (mFISH). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת כרומוזום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים עם 5% Giemsa פתרון (או 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לצרכן המכיל 0.5 מ&quot;ג / A מ&quot;ל RNase עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי) במשך 15 - 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיגיטלי לצלם לפחות 50 תאי metaphase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מספר כרומוזום לכל תא באמצעות Softwa ניתוח תמונהמחדש לאחר הפרדה ידנית של נגיעת חופפים הכרומוזומים באמצעות תוכנה לעריכת תמונות. למרות מספר כרומוזום יכול להיות בקיע באופן ידני, בקיע ממוחשב מומלץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח קריוטיפ הערה: ניתוח זה צריך להתבצע על ידי טכנאי מיומן או חברה מקצועית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים כתמים על פי טכניקת G-banding תקן 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח הכרומוזומים לעשות karyograms תקן 12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mFISH הערה: שלב זה הוא אופציונלי צריך להתבצע במידת הצורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם באמצעות בדיקות FISH ססגוניות עבור כרומוזומים אנושיים על פי הפרוטוקול של היצרן 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסננים מתאימים תוכנה לניתוח mFISH 13. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Rabinovitch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+progression+in+Barrett%27s+esophagus+III%3A+baseline+flow+cytometric+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables.</a> Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).</li>
<li>Galipeau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSAIDs+modulate+CDKN2A%2C+TP53%2C+and+DNA+content+risk+for+progression+to+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma.</a> PLoS Med. 4 (2), e67(2007).</li>
<li>Olaharski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploidy+and+chromosomal+instability+are+early+events+during+cervical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-independent+abrogation+of+a+postmitotic+checkpoint+contributes+to+human+papillomavirus+E6-induced+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy.</a> Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).</li>
<li>Davoli, T., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+causes+and+consequences+of+polyploidy+in+normal+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).</li>
<li>Fox, D., Duronio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreplication+and+polyploidy%3A+insights+into+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease.</a> Development. 140, 3-12 (2013).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437, 1043-1047 (2005).</li>
<li>Ganem, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+triggers+hippo+tumor+suppressor+pathway+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation.</a> Cell. 158 (4), 833-848 (2014).</li>
<li>Kuznetsova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability%2C+tolerance+of+mitotic+errors+and+multidrug+resistance+are+promoted+by+tetraploidization+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells.</a> Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).</li>
<li>Vindeløv, L., Christensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+and+proteolytic+enzyme-based+techniques+for+nuclear+isolation+and+DNA+content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Juan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+measurement+for+DNA+ploidy+and+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis.</a> Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).</li>
<li>Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+analysis+guidelines+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genet+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Chromosome analysis guidelines preliminary report.</a> Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).</li>
<li>Liehr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+FISH+probe+sets+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Multicolor FISH probe sets and their applications.</a> Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bipolar+spindles+with+two+centrosomes+in+tetraploid+cells+established+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts.</a> Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts.</a> Front. Oncol. 3, 198(2013).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+telomerase-immortalized+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosome+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts.</a> Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).</li>
<li>Di Leonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rereplication+in+the+presence+of+mitotic+spindle+inhibitors+in+human+and+mouse+fibroblasts+lacking+either+p53+or+pRb+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function.</a> Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).</li>
<li>Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+state+induces+p53-dependent+arrest+of+nontransformed+mammalian+cells+in+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+of+the+mitotic+spindle+assembly+checkpoint+with+p53+to+prevent+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy.</a> Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).</li>
<li>Aylon, Y., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+Guardian+of+ploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">p53: Guardian of ploidy.</a> Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).</li>
<li>Uetake, Y., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+progression+after+cleavage+failure+%3A+mammalian+somatic+cells+do+not+possess+a+%26%2334%3Btetraploidy+checkpoint%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a &#34;tetraploidy checkpoint&#34.</a> J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).</li>
<li>Ganem, N., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+the+proliferation+of+polyploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting the proliferation of polyploid cells.</a> Cell. 131, 437-440 (2007).</li>
<li>Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+of+p53+for+maintaining+chromosomal+stability+during+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization.</a> Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרים.

אחת הבעיות העיקריות אינדוקציה של tetraploidy מתאי דיפלואידי ידי חומרים כימיים, בין אם על ידי מעכבי cytokinesis או על ידי מעכבי ציר, הוא שתאי הופכים לרוב תערובת של אוכלוסיות דיפלואידי ו tetraploid, ותאי tetraploid יש להפריד בין תאי דיפלואידי. רוב הגישות הנפוצות לבידוד תרמי של אוכלוסייה tetraploid ללא תאים דיפלואידי להשתמש FACS או שיבוט על ידי הגבלת דילול. עם זאת, נהלים אלה הם מייגע ולא קלים לביצוע. בדו&quot;ח זה, אנו מציגים פרוטוקול חדש להקים תאים tetraploid שגשוג ללא אוכלוסייה דיפ...

Polyploidy נצפתה לא רק ברקמות מקצועיות של מינים יונקים אלא גם במגוון של מצבים פתולוגיים, כגון סרטן ומחלות ניווניות. תאים polyploid (בעיקר tetraploid) הם נצפו לעתים קרובות בנגעים preneoplastic של רקמות אנושיות, כגון נגעים intraepithelial 1,2 או קשקש ושט בארט של 3,4 צוואר הרחם, ואת כבר נחשב כמקור לתאי aneuploid ממאיר ברקמות אלו 5 , 6. למרות זאת הוא הציע מרה של tetraploid לתאי aneuploid יכולה להיות אירוע מכריע בשלבים המוקדמים של tumorigenesis, המנגנונים המעורבים בתהליך זה אינם מובנים במלואם. זה גם בגלל שאין מודל במבחנה כבר זמין שבו תאים אנושיים polyploid nontransformed יכול להפיץ. ישנם חוקרי מושרה tetraploidy בתאי אפיתל אדם nontransformed באמצעות דור של תאי binucleated ידי Inhibiting cytokinesis 7-9. בשיטה זו, לעומת זאת, תאים דיפלואידי מיותר חייבים להתבטל על ידי מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) 7,8 או שיבוט על ידי הגבלת דילול 9. בגלל הליכים אלה הם מייגע ולא קלים לביצוע, שיטות פשוטות יותר להקים תאי tetraploid nontransformed הם רצויים עבור מחקר בתחום זה. בדו&quot;ח הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול להקים תאי tetraploid שגשוג מן fibroblasts אדם נורמלי או פיברובלסטים אדם הנציח טלומרז ידי נהלים פשוטים יחסית. הנהלים להשתמש demecolcine רעל כישור (DC) לעצור תאי דיפלואידי ב מיטוזה, ותאי mitotic שנאספו על ידי מנערים מטופלים נוספים עם DC. תאי mitotic דיפלואידי שטופלו DC עבור זמן ממושך להמיר תאי G1 tetraploid, ותאים אלה להתרבות תאי tetraploid כמו לאחר מעצרו צמיחה במשך כמה ימים לאחר הסרת תרופה. פרוטוקול זה מספקשיטה יעילה ליצירת מודל שימושי כדי לחקור את הקשר בין אי יציבות כרומוזום והפוטנציאל בשעור של תאים אנושיים polyploid.

<table><tbody><tr><td>MEM-ואלפא;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת דמקולצין (10 &mu; g/mL in HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1925-10ML</td><td></td></tr><tr><td>BD CycleTES Plus DNA Reagent ערכות BD</td><td>Biosciences</td><td>#340242</td><td>לבדיקת פלואידיה של DNA על ידי זרימה ציטומטריית</td></tr><tr><td>כרומוזום אנושי רב צבעוני FISH בדיקה 24XCyte</td><td>MetaSystems</td><td>#D-0125-060-DI</td><td>יש צורך בערכת מסננים מיוחדת ותוכנה לניתוח mFISH</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה של Isis עם תוכנת mFISH&nbsp;</td><td>יש צורך בערכת בדיקה מיוחדת</td> של <td>MetaSystems</td><td></td></tr></tbody></table>

הקמת תאי tetraploid proliferative מ nontransformed אדם פיברובלסטים

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

תאים פוליפלואידים (בעיקר טטרפלואידים) נצפים לעתים קרובות בנגעים פרה-ניאופלסטיים של רקמות אנושיות וחוסר היציבות הכרומוזומלית שלהם נחשב כאחראי לסרטן ברקמות כאלה. למרות שתאים פוליפלואידים מתרבים נדרשים לניתוח אי יציבות כרומוזומלית של תאים פוליפלואידים, יצירת תאים כאלה מתאים אנושיים שלא עברו טרנספורמציה היא מאתגרת למדי. אינדוקציה של טטרפלואידים על ידי חומרים כימיים מביאה בדרך כלל לתערובת של אוכלוסיות דיפלואידיות וטטרפלואידיות, ורוב המחקרים השתמשו במיון או שיבוט תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה על ידי הגבלת דילול כדי להפריד בין תאים טטרפלואידים לתאים דיפלואידים. עם זאת, הליכים אלה גוזלים זמן ומייגעים. הדו"ח הנוכחי מתאר פרוטוקול פשוט יחסית לגרימת תאים טטרפלואידים מתרבים מפיברובלסטים אנושיים רגילים עם זיהום מינימלי על ידי תאים דיפלואידים. בקצרה, הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: עצירת תאים במיטוזה על ידי דמקולצין (DC), איסוף תאים מיטוטיים לאחר ניעור, דגירה של תאים שנאספו עם DC למשך 3 ימים נוספים, ודגירת תאים בתווך נטול תרופות (הם מחדשים את התפשטותם כתאים טטרפלואידים תוך מספר ימים). בהתאם לסוג התא, ניתן להשמיט את אוסף התאים המיטוטיים על ידי ניעור. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ומעשית להקמת תאים טטרפלואידים מתרבים מפיברובלסטים אנושיים רגילים. תאים טטרפלואידים שהוקמו בשיטה זו יכולים להוות מודל שימושי לחקר חוסר יציבות הכרומוזומים והפוטנציאל האונקוגני של תאים אנושיים פוליפלואידים.

מניסיוננו, תאים TIG-1 יכול להתבצע כמעט tetraploid לחלוטין על ידי טיפול רציף פשוט עם 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל DC במשך 4 ימים (איור 2 א). לעומת זאת, זנים פיברובלסטים אחרים, כגון ב&quot;ג או IMR-90, ותאי TIG-HT, הפכו תערובת של דיפלואידי ואוכלוסיות tetraploid הבאים אותו הטיפול, ובידוד של תאי mitotic בשיטה שייק פעמי יש צורך במהלך טיפול DC (בדרך כלל 16 - 18 שעות לאחר תחילת הטיפול) (2B הדמוי, C). לאחר טיפול נוסף עם DC במשך...

למרות שתאים פוליפלואידים מתרבים נחוצים לניתוח חוסר יציבות כרומוזומלית של תאים פוליפלואידים, יצירת תאים כאלה מתאים אנושיים שלא עברו טרנספורמציה אינה קלה. הדו"ח הנוכחי מתאר הליכים פשוטים יחסית להקמת תאים טטרפלואידים מתרבים ללא אוכלוסייה דיפלואידית מפיברובלסטים אנושיים רגילים.

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להקים תאים טטרפלואידים מתרבים, ללא אוכלוסייה דיפלואידית, מפיברובלסטים אנושיים רגילים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כגון כיצד תאים אנופלואידים מתפתחים בשלבים המוקדמים של סרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להקים תאים טטרפלואידים מתרבים, ללא אוכלוסייה דיפלואידית, על ידי הליכים פשוטים יחסית.בעוד שזנים מסוימים הופכים לטטרפלואידים לחלוטין על ידי טיפול פשוט ברעל ציר, דמקולצין, יש לטפל ברובם בשיטת הניעור במהלך הטיפול כדי לחקות אוכלוסייה דיפלואידית. כדי להתחיל באינדוקציה של טטרפלואידיה ללא שיטת הניעור, עברו בערך חמש פעמים 10 לתאים המתורבתים לתוך צלחת של 100 מילימטר. דגרו את המנה באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.לאחר מכן, טפל בתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם למיליליטר DC.דגירה באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים. לאחר מכן החלף את המדיום המכיל DC במדיום נטול תרופות. דגירה ב-5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס עד לחידוש ההתפשטות.כדי לגרום לטטרפלואידיה בשיטת הניעור, העבירו את התאים המתורבתים לצלוחיות T-75, וודאו שכל בקבוק מכיל לפחות פעם אחת 10 ל-1/6 התאים. דגרו את הצלוחיות באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, טפל בתאים במדיום המכיל DC למשך 16 עד 18 שעות כדי לעצור אותם במיטוזה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר הדגירה, בדוק את התאים בבקבוק תחת מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה ההפוך. ואז לנער בעדינות כל בקבוק כדי להתחיל באיסוף התאים המיטוטיים המודבקים באופן רופף. יש להימנע מטיפול רשלני, כגון טלטול אלים או נגיעה במשטח הבקבוק בקצה הפיפטה.אין לזהם את התאים המיטוטיים בתאי ממשק דבוקים. שוטפים בעדינות את הצלוחיות במדיום חם, ומעבירים את התאים לצינורות צנטריפוגה. השתמש במונה תאים אטומיים כדי לספור את מספר התא.לאחר ספירת תאים, צנטריפוגה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. זרע מחדש את התאים המיטוטיים שנאספו לכלי תרבית של 16 מילימטר. לאחר מכן טפל בתאים המצופים במדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם למיליליטר DC.דגירה ב-5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.לאחר מכן, החלף את המדיום המכיל DC במדיום נטול תרופות. דגירה באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס עד לחידוש ההתפשטות. לניתוח פלואידיה של DNA, יש לשטוף את התאים עם PBS.לאחר מכן הוסף לתאים תמיסה המכילה 0.05% טריפסין ו-0.02% EDTA. דוגרים במשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את מתלה התאים לצינור צנטריפוגה.ולנטרל את הטריפסין על ידי הוספת מדיום המכיל סרום בקר עוברי 10%. צנטריפוגה את התאים בבינוני ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר PBS.ואז שוב צנטריפוגה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, השעו מחדש תאים במיליליטר אחד של PBS. הוסף ארבעה מיליליטר של 100% אתנול טיפה עם ערבוב.הניחו לתרחיף לנוח בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בתמיסה מקבעת ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. ולהשעות תאים בחמישה מיליליטר של PBS.צנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן טפל בתאים עם 475 מיקרוליטר של 0.5 מיליגרם לתמיסת RNA מיליליטר. הוסף 25 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר תמיסת יוד פרופידיום כדי להכתים את התאים.ואז לערבב. הניחו למתלה לנוח בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמש בציטומטר זרימה עם לייזר 488 ננומטר ומסנן פליטת תעלה אדומה כדי לנתח את תכולת ה-DNA של התאים.לנתח דגימת ייחוס שהוכנה גם מתאים דיפלואידים אמיתיים כדי להעריך פלואידיות של תאי מטרה. כדי להתחיל, טפל בתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי עם מדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם למיליליטר DC למשך ארבע שעות כדי לעצור את התאים במטאפאזה. לאחר מכן, קצרו לפחות חמש פעמים 10 ל -1/5 התאים על ידי טריפסיניזציה.השעו את התאים שנקטפו במדיום המכיל FBS. צנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת אשלגן כלורי מולרית של 0.075.דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של הקיבוע של קרנוי.ואז צנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאים ב-0.5 מיליליטר של הקיבוע של קרנוי. זרוק 30 מיקרוליטר ממתלה התא על מגלשת זכוכית.לבסוף, צבעו ונתחו את התאים באמצעות ספירת כרומוזומים או ניתוח קריוטיפ. במחקר זה, תאים טטרפלואידים פרוליפרטיביים, ללא אוכלוסייה דיפלואידית, מתורבתים מפיברובלסטים אנושיים רגילים. למרות שזני תאים מסוימים יכולים להפוך לטטרפלואידים לחלוטין על ידי טיפול מתמשך ב-DC, יש לטפל ברוב התאים בשיטת הניעור במהלך הטיפול ב-DC כדי לחסל אוכלוסייה דיפלואידית.התוצאות המייצגות לאינדוקציה של טטרפלואידיה בשלושה זני פיברובלסטים מוצגות כאן. הזן TIG-1 הופך כמעט כולו לטטרפלואיד באמצעות טיפול רציף פשוט ב-DC.עם זאת, טיפול זה גורם לזני BJ ו-TIG-hT להפוך לתערובת של אוכלוסיות דיפלואידים וטטרפודים. לכן, בידוד של תאים מיטוטיים בשיטת הניעור הכרחי במהלך תהליך הטיפול.ספירת כרומוזומים מתבצעת בתאים הטטרפלואידים שהוקמו. כפי שניתן לראות, מספר הכרומוזום המודאלי הוא 92 עבור תאי TIG-1 ו-BJ, ו-91 עבור תאי TIG-hT. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים אם היא מבוצעת כראוי.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנער בעדינות את הצלוחיות בשלב הניעור, לא לגרום לזיהום של תאים מיטוטיים על ידי תאי ממשק דבקים.

establishment-proliferative-tetraploid-cells-from-nontransformed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מדגימים את פרוטוקול עבור הדור של המושרה בתאי גזע pluripotent מן האדם תאים סומטיים באמצעות lentivirus בתיווך המסירה של גורמים אנושיים Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. Pluripotency אושרה על ידי המורפולוגיה ואת הנוכחות של גזע עובריים (ES) סמנים ספציפיים התא.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

קרצינומה הקשורים fibroblasts (CAFs) עשיר myofibroblasts להציג בתוך stroma הגידול, לשחק תפקיד מרכזי נהיגה התקדמות הגידול. פיתחנו מודל הגידול coimplantation xengraft עבור ניסיוני להפקת CAFs מן fibroblasts החלב האנושי. הפרוטוקול מתאר כיצד להקים myofibroblasts CAF כי תרכוש את היכולת לקדם tumourigenesis.

הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתוכנתים מחדש ומאופיינים ללא גורמים והמרה למצבים קליניים משוערים.

גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

גזירה חזקים של האדם המושרה האדם pluripotent גזע (hiPS) תאים הושג באמצעות שילוב של וירוס Sendai וירוס (Sev) וקטור בתיווך תיכנות של fibroblasts עורי. HiPS התא תחזוקה התרחבות המשוב בוצע באמצעות xeno חופשי ו מוגדר תנאי תרבות כימית עם laminin רקומביננטי אנושי 521 (LN-521) מטריקס Essential E8 (E8) בינוני.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

כאן נתאר שיטת הרלוונטית קלינית, יעילות גבוהה, ללא מזין לתכנת fibroblasts העיקרי אנושי לתוך תאי גזע pluripotent המושרה משתמש ששונה mRNAs קידוד גורמים התיכנות, בוגרת microRNA-367/302 מחקה. נכללים גם הם שיטות להערכת יעילות התיכנות, להרחיב iPSC המשובטים מושבות, לאשר את הביטוי של סמן pluripotency טרה-1-60.

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת אנטיגן גידול פונקציונלי-ספציפי המושרה pluripotent תא גזע בודד באמצעות OP9/DLL1 מערכת התרבות המשותף.

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

פרוטוקול זה ממחיש את האינדוקציה של תוכנית המטוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות על ידי ביטוי נאכף של הגורמים שעתוק GATA2, GFI1B ו-FOS כדי ליצור גזע המטפאות ובתאי קדמון.

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

למד כיצד להקים תאים טטרפלואידיים פרוליפרטיביים מפיברובלסטים אנושיים לא ממומרים ללא אוכלוסייה דיפלואידית. השיטה משתמשת בדמקולצין ובשיטת shake-off לחקירת אי-יציבות כרומוזומלית ומנגנוני קרצינוגנזה מוקדמים.

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

גלה סרטונים נוספים