הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים
8 בינואר 2017
למרות שתאים פוליפלואידים מתרבים נחוצים לניתוח חוסר יציבות כרומוזומלית של תאים פוליפלואידים, יצירת תאים כאלה מתאים אנושיים שלא עברו טרנספורמציה אינה קלה. הדו"ח הנוכחי מתאר הליכים פשוטים יחסית להקמת תאים טטרפלואידים מתרבים ללא אוכלוסייה דיפלואידית מפיברובלסטים אנושיים רגילים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להקים תאים טטרפלואידים מתרבים, ללא אוכלוסייה דיפלואידית, מפיברובלסטים אנושיים רגילים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כגון כיצד תאים אנופלואידים מתפתחים בשלבים המוקדמים של סרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להקים תאים טטרפלואידים מתרבים, ללא אוכלוסייה דיפלואידית, על ידי הליכים פשוטים יחסית.
בעוד שזנים מסוימים הופכים לטטרפלואידים לחלוטין על ידי טיפול פשוט ברעל ציר, דמקולצין, יש לטפל ברובם בשיטת הניעור במהלך הטיפול כדי לחקות אוכלוסייה דיפלואידית. כדי להתחיל באינדוקציה של טטרפלואידיה ללא שיטת הניעור, עברו בערך חמש פעמים 10 לתאים המתורבתים לתוך צלחת של 100 מילימטר. דגרו את המנה באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
לאחר מכן, טפל בתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם למיליליטר DC.דגירה באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים. לאחר מכן החלף את המדיום המכיל DC במדיום נטול תרופות. דגירה ב-5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס עד לחידוש ההתפשטות.
כדי לגרום לטטרפלואידיה בשיטת הניעור, העבירו את התאים המתורבתים לצלוחיות T-75, וודאו שכל בקבוק מכיל לפחות פעם אחת 10 ל-1/6 התאים. דגרו את הצלוחיות באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, טפל בתאים במדיום המכיל DC למשך 16 עד 18 שעות כדי לעצור אותם במיטוזה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר הדגירה, בדוק את התאים בבקבוק תחת מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה ההפוך. ואז לנער בעדינות כל בקבוק כדי להתחיל באיסוף התאים המיטוטיים המודבקים באופן רופף. יש להימנע מטיפול רשלני, כגון טלטול אלים או נגיעה במשטח הבקבוק בקצה הפיפטה.
אין לזהם את התאים המיטוטיים בתאי ממשק דבוקים. שוטפים בעדינות את הצלוחיות במדיום חם, ומעבירים את התאים לצינורות צנטריפוגה. השתמש במונה תאים אטומיים כדי לספור את מספר התא.
לאחר ספירת תאים, צנטריפוגה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. זרע מחדש את התאים המיטוטיים שנאספו לכלי תרבית של 16 מילימטר. לאחר מכן טפל בתאים המצופים במדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם למיליליטר DC.דגירה ב-5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.
לאחר מכן, החלף את המדיום המכיל DC במדיום נטול תרופות. דגירה באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס עד לחידוש ההתפשטות. לניתוח פלואידיה של DNA, יש לשטוף את התאים עם PBS.
לאחר מכן הוסף לתאים תמיסה המכילה 0.05% טריפסין ו-0.02% EDTA. דוגרים במשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את מתלה התאים לצינור צנטריפוגה.
ולנטרל את הטריפסין על ידי הוספת מדיום המכיל סרום בקר עוברי 10%. צנטריפוגה את התאים בבינוני ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר PBS.
ואז שוב צנטריפוגה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, השעו מחדש תאים במיליליטר אחד של PBS. הוסף ארבעה מיליליטר של 100% אתנול טיפה עם ערבוב.
הניחו לתרחיף לנוח בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בתמיסה מקבעת ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. ולהשעות תאים בחמישה מיליליטר של PBS.
צנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן טפל בתאים עם 475 מיקרוליטר של 0.5 מיליגרם לתמיסת RNA מיליליטר. הוסף 25 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר תמיסת יוד פרופידיום כדי להכתים את התאים.
ואז לערבב. הניחו למתלה לנוח בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמש בציטומטר זרימה עם לייזר 488 ננומטר ומסנן פליטת תעלה אדומה כדי לנתח את תכולת ה-DNA של התאים.
לנתח דגימת ייחוס שהוכנה גם מתאים דיפלואידים אמיתיים כדי להעריך פלואידיות של תאי מטרה. כדי להתחיל, טפל בתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי עם מדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם למיליליטר DC למשך ארבע שעות כדי לעצור את התאים במטאפאזה. לאחר מכן, קצרו לפחות חמש פעמים 10 ל -1/5 התאים על ידי טריפסיניזציה.
השעו את התאים שנקטפו במדיום המכיל FBS. צנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת אשלגן כלורי מולרית של 0.075
.דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של הקיבוע של קרנוי.
ואז צנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאים ב-0.5 מיליליטר של הקיבוע של קרנוי. זרוק 30 מיקרוליטר ממתלה התא על מגלשת זכוכית.
לבסוף, צבעו ונתחו את התאים באמצעות ספירת כרומוזומים או ניתוח קריוטיפ. במחקר זה, תאים טטרפלואידים פרוליפרטיביים, ללא אוכלוסייה דיפלואידית, מתורבתים מפיברובלסטים אנושיים רגילים. למרות שזני תאים מסוימים יכולים להפוך לטטרפלואידים לחלוטין על ידי טיפול מתמשך ב-DC, יש לטפל ברוב התאים בשיטת הניעור במהלך הטיפול ב-DC כדי לחסל אוכלוסייה דיפלואידית.
התוצאות המייצגות לאינדוקציה של טטרפלואידיה בשלושה זני פיברובלסטים מוצגות כאן. הזן TIG-1 הופך כמעט כולו לטטרפלואיד באמצעות טיפול רציף פשוט ב-DC.עם זאת, טיפול זה גורם לזני BJ ו-TIG-hT להפוך לתערובת של אוכלוסיות דיפלואידים וטטרפודים. לכן, בידוד של תאים מיטוטיים בשיטת הניעור הכרחי במהלך תהליך הטיפול.
ספירת כרומוזומים מתבצעת בתאים הטטרפלואידים שהוקמו. כפי שניתן לראות, מספר הכרומוזום המודאלי הוא 92 עבור תאי TIG-1 ו-BJ, ו-91 עבור תאי TIG-hT. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנער בעדינות את הצלוחיות בשלב הניעור, לא לגרום לזיהום של תאים מיטוטיים על ידי תאי ממשק דבקים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להקמת תאי טטרהפלואידיים פרוליפרטיביים מפיברובלסטים אנושיים נורמליים, החיוניים לחקר חוסר יציבות כרומוסומלית. הטכניקה מאפשרת לחוקרים ליצור תאים אלו ללא אוכלוסייה דיפלואידית, ובכך היא מקלה על מחקרים של שלבי קרצינוגנזה מוקדמים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מחקר קרצינוגנזה
- יציבות כרומוזומלית
רקע
- תאים פוליפלואידיים פרוליפרטיביים הם קריטיים לניתוח של חוסר יציבות כרומוזומלית.
- יצירת תאים כאלה מתאים אנושיים שאינם טרנספורמיים טומנת בחובה אתגרים.
- הבנת אנאפלואידיות היא חיונית בהקשר של התפתחות סרטן.
- מחקר זה נועד לפשט את התהליך של יצירת תאים טטרהפלואידיים.
מטרת המחקר
- להפקת תאים טטרהפלואידיים פרוליפרטיביים הנקיים מאוכלוסיות דיפלואידיות.
- לסייע במחקר על התפתחות תאים אנאופלואידיים בתהליך הקרצינוגנזה.
- לספק שיטה פשוטה להפקת תאים אלו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העברה של תאים מתרביות לכלי 100 מילימטר.
- דגירה של תאים באטמוספירה של 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 שעות.
- שימוש ברעלן כישורים, demecolcine, להשראת טטרפלואידיות.
- יישום שיטת ה-shake-off עבור זנים מסוימים כדי להסיר אוכלוסיות דיפלואידיות.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של תאים טטראפלואידיים פרוליפרטיביים.
- הדגמה של יעילותם של ההליכים הפשוטים המתוארים.
- תובנות לגבי המכניזמים של התפתחות אנאuploidy.
- יישומים פוטנציאליים במחקר הסרטן ובמחקרים כרומוזומליים.
מסקנות
- השיטה מספקת דרך מהימנה ליצירת תאים טטראפלואידיים.
- מחקר זה מעמיק את ההבנה של אי-יציבות כרומוזומלית.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל תאים אלו כדי לחקור את תהליך הקרצינוגנזה באופן מעמיק יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
הקמת תאים טטרהפלואידיים בעלי יכולת התרבות מתאי פיברובלסטים אנושיים לא-טרנספורמיים נותנת מענה לצורך קריטי במודלים חסונים של חוסר יציבות כרומוזומלית בשלבים מוקדמים של קרצינוגנזה. יכולת זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכנית ותיקוף של מטרות עבור מסלולים המעורבים בהתקדמות מחלות המונעות על ידי אנאפלואידיה. הפשטות וההדירות של השיטה תומכות במחקר תרגומי רחב ותגבירות את הביטחון החזוי בבחירת מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מנגנוני חוסר יציבות כרומוזומלית הרלוונטיים לטרנספורמציה אונקוגנית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות המעורבות בפוליפלואידיה ובאנאפלואידיה.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד של אוכלוסיות טטראפלואידיות ללא זיהום של תאים דיפלואידיים.
- משפר את רמת הביטחון החזויה עבור ניתוח מסלולים ומיון בשלבים מאוחרים יותר.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכת מתוקתקת להערכה כמותית של התוכן הכרומוזומלי באמצעות פלואו ציטומטריה וקריוטיפינג.
- מנstandardizes את יצירתן של אוכלוסיות תאים טטראפלואידיות לצורך פיתוח בדיקות הדירות (reproducible).
- מאפשר הערכה מהימנה של תרכובות או התערבויות המכוונות למסלולים הקשורים לפוליפלואידיות.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) ובשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מספר זני פיברובלסטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה לצורך חקר אירועים מוקדמים בתהליך הקרצינוגנזה.
- מבטיח רציפות ממחקרים מכניסטיים בשלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני של סמנים ביולוגיים לאי-יציבות כרומוזומלית.
- מפחית את הסיכון בקידום מועמדים המכוונים לתהליכים אונקוגניים המונחים על ידי פוליפלואידיה.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות ליצירה ותיקוף של מודלי תאים טטראפלואידיים לצורך מחקר מכניסטי ותרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על מקוריהם והשלכותיהם של טטרהפלואידיות בתאים אנושיים.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות הדירות של תוכן ה-DNA לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות.
- אנליטיקה: מספק תוצרי ציטומטריה זרימה וקריוטיפ להשוואה חסונה של אוכלוסיות תאים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין תובנות מכניסטיות מוקדמות להתאמת ביומרקרים פרה-קליניים במחקרי אי-יציבות כרומוזומלית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול יישום רחב ליצירת מודלים פוליפלואידיים בתוכניות מו"פ שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בניבוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של אי-יציבות כרומוסומלית.
- ערך תפעולי: מייעל את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של יצירת תאים טטרהפלואידיים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת (go/no-go) וקידום יעיל של תוכניות אונקולוגיות מבחינת השקעת הון.
- השפעה על הפורט폴יו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומודלים בקווי גילוי מוקדמים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, ציטומטריה של זרימה וניתוח קריוטיפ.
- נדרשת גישה ל-demecolcine, סופרי תאים ומכשור ציטומטרי.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדנית של שלבי הניעור (shake-off) והטיפול בתאים כדי למנוע זיהום.
- ייתכן ויהיה צורך בהתאמה עבור זני פיברובלסטים או סוגי תאים שונים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות תגובות ספציפיות לזן עבור demecolcine ושונות טכנית בבידוד תאים מיטוטיים.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Induction and Establishment of Tetraploid Cells from Diploid Fibroblasts without the Shake-off Method
1:52
Induction and Establishment of Tetraploid Cells from Diploid Fibroblasts with the Shake-off Method
4:01
Examination of DNA Ploidy
6:30
Preparation for Chromosome Counts and Karyotype Analysis
8:04
Results: Establishment of Proliferative Tetraploid Cells
9:28
Conclusion
