הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין ננו-צינורות פחמן פלואורסצנטיים קרובים לאינפרא אדום עבור חישה מולקולרית שעברו פונקציונליזציה באמצעות פולימרים ביומימטיים. ננו-חיישנים אלה יכולים לאפשר הדמיה שנפתרה בזמן ברקמה חיה. לדוגמה, הם יכולים לשמש לאיתור דופמין במוח.

היתרון העיקרי של חיישנים אלה הוא הקרינה האינפרא אדום הטבועה בהם, המאפשרת הדמיה עמוקה יותר לתוך הרקמה. חיישנים סינתטיים מאפשרים זיהוי של מולקולות ללא רכיבי זיהוי מולקולרי טבעיים, מה שהופך את השיטה הגנרית הזו לפיתוח חיישנים לשימושית במיוחד לזיהוי מולקולות קטנות. להכנת תרחיף חומצות גרעין של SWNTs, יש להמיס תחילה חומצות גרעין בנתרן כלורי מולרי של 0.1 לריכוז של 100 מיליגרם למיליליטר.

במכסה אדים, הסר חשמל סטטי מהמרית החד פעמית, צינורות המיקרו-צנטריפוגה ומלאי ה-SWMT, באמצעות אקדח אנטי סטטי. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר מתמיסת חומצת הגרעין ל -980 מיקרוליטר של 0.1 נתרן כלורי מולרי. לאחר מכן הוסף 1 מיליגרם של SWNTs שטופים לתמיסת חומצת הגרעין המתקבלת לפני סוניקציה של התערובת.

מיקום קצה הבדיקה במהלך סוניקציה הוא קריטי. אם מתרחש קצף, מקם מחדש את קצה הבדיקה ונסה להוריד את המשרעת. לחלופין, אתה יכול לנסות פולסים של סוניקציה או סוניקציה באמבטיה אם ההשעיה נשארת גרועה.

בעזרת אולטרסאונד עם קצה בקוטר 3 מילימטר, סוניקטור את התמיסה למשך 10 דקות במשרעת של 40% באמבט קרח. צנטריפוגה את תמיסת ה-DNA SWNT פעמיים למשך 90 דקות ב-16, 100 xg. אסוף ושמור את הסופרנטנט, היזהר לא להפריע לגלולה המכילה צרורות ננו-צינורות פחמן ואגרגטים.

השלך את הגלולה בהתאם לנהלי פסולת מסוכנת מוסדית המתאימים לננו-חומרים. מדוד את ספיגת התמיסה ב-632 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis כדי לקבוע את הריכוז המשוער של SWNTs מרחפים, בהתאם לחוק למברט-ביר, ואת מקדם הדילול המתאים. עבור מתלי פולימר אמפיפיליים, הסר תחילה את החשמל הסטטי מהמרית החד פעמית, צינורות המיקרו-צנטריפוגה ומלאי SWNT.

במכסה אדים, הוסף חמישה מיליגרם של SWNTs לחמישה מיליליטר של תמיסת נתרן כולאט 2%. בעזרת אולטרסאונד עם קצה בקוטר שישה מילימטרים, סוניקטור את התמיסה למשך שעה במשרעת של 40% באמבט קרח. צנטריפוגה את הדגימה ב-150,000 xg למשך ארבע שעות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה, לפני איסוף זהיר של הסופרנטנט.

לאחר מכן, ממיסים 1% משקל של פולימר אמפיפילי בתמיסת scSWNT. לאחר מכן, דיאליזה של תמיסת הפולימר scSWNT באמצעות קרום דיאליזה של 3.5 קילודלטון כנגד ליטר אחד של מים נטולי יונים או חיץ למשך חמישה ימים. החלף את המים או את המאגר בשעה השנייה ובשעה הרביעית.

מדוד את ספיגת התמיסה ב-632 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis כדי לקבוע את הריכוז המשוער של SWNTs מרחפים. להכנת השקופיות המצופות BSA-ביוטין, נקו שקופית מיקרוסקופ וזכוכית כיסוי של 0.17 מילימטר במים נטולי יונים, ולאחר מכן מתנול, אצטון ושטיפה אחרונה של מים נטולי יונים. צור ערוצים על ידי הנחת מספר חתיכות של סרט דו צדדי במרחק של כחמישה מילימטרים זה מזה על שקופית המיקרוסקופ הנקייה.

אטום את התעלות על ידי לקיחת החלקה ארוכה של כיסוי זכוכית ולחיצה על החלק העליון של הסרט הדו-צדדי. הקפד למרכז אותו על שקופית המיקרוסקופ כך ששולי ההחלקה וההחלקה של הכיסוי לא יהיו סמוכים. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי BSA-ביוטין ל-900 מיקרוליטר של מאגר טריס 1x לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.

הזרימו 50 מיקרוליטר של תמיסת BSA-ביוטין לתוך התעלה על ידי פיפטינג התמיסה לקצה אחד ונידוף התמיסה בקצה השני באמצעות רקמה. לאחר דגירה של התמיסה במשך חמש דקות, בצע שלוש עד חמש שטיפות עם 50 מיקרוליטר של 0.1 נתרן כלורי מולארי. לאחר מכן, יש לדלל 40 מיקרוליטר של חמישה מיליגרם למיליליטר תמיסת מלאי NAV ל-960 מיקרוליטר של 1x Tris buffer, לריכוז סופי של 0.2 מיליגרם למיליליטר.

הזרימו 50 מיקרוליטר של תמיסת ה-NAV לתעלה על ידי פיפטינג של התמיסה לקצה אחד ונידוף התמיסה בקצה השני באמצעות רקמה. לאחר דגירה של המגלשה במשך שתיים עד חמש דקות, בצע שלוש עד חמש שטיפות עם 50 מיקרוליטר של 0.1 נתרן כלורי מולרי. לאחר מכן, יש לדלל את תמיסות המלאי של SWNTs מרחפים ומאגר הדמיה לריכוז של 1 עד 10 מיליגרם לליטר.

הזרימו 50 מיקרוליטר מתמיסה זו לתעלה ודגרו למשך חמש דקות. שטוף בעדינות את ה-SWNTs העודפים באמצעות 50 מיקרוליטר של מאגר הדמיה. כדי למדוד את התגובה ההפיכה של GT15 DNA-SWNTs לדופמין, הרכיב תחילה את התעלות המצופות חיישן על שלב המיקרוסקופ הקרינה.

הבא את הערוצים למיקוד באמצעות 100X Oil Objective ומצלמת אינדיום גליום ארסניד. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת דופמין מיקרו-מולרית בתמיסת מלח חוצצת פוספט לתעלת הזרימה, ורשום את השינוי בעוצמת הקרינה. שטפו את תמיסת הדופמין באמצעות מי מלח חוצצים פוספט, והתבוננו בשינוי הקרינה של חיישני ה-SWNT הבודדים.

כדי לבצע את סינון צלחת הבאר לתגובה אנליטית של SWNTs פולימרים ביומימטיים, פיפטה נפחים שווים של חיישן SWNT התלוי לכל באר. השתמש בנפח מספיק כדי לכסות את קרקעית הבאר באופן אחיד. לאחר מכן, אנליטים של פיפטה מספריית ההקרנה לתוך לוחות הבאר.

הכן כל אנליט בשלוש פעמים כדי לקחת בחשבון את השונות הפוטנציאלית של באר לבאר ותנודות של עוצמת העירור, או הטמפרטורה. העלה את המטרה תוך ניטור ספקטרום הפליטות באמצעות הספקטרומטר ומערך אינדיום גליום ארסניד. מיקום אופטימלי של המטרה יציב את מישור המוקד בערך באמצע נפח הדגימה בבאר, מה שאמור להתאים למקסימום בעוצמה הנמדדת.

עבור כל באר דגימה, רשום חשיפה של 1 עד 10 שניות כדי לאסוף ספקטרום. השווה את ספקטרום הפליטות עבור כל באר לבקרה המכילה רק SWNTs ללא אנליט נוסף, כדי לכמת את תגובת הקרינה. ספקטרום הספיגה של חיישני ננו-צינורות DNA GT15 מראה שיאים מרובים המתאימים לננו-צינורות פחמן מפוזרים היטב בעלי כיראליות שונה.

הקרינה הקרובה לאינפרא אדום של חיישני ננו-צינורות DNA GT15 מוצגת. מעניין שעוצמת הקרינה מוכפלת בערך בתגובה לדופמין. באיור זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי קרוב לאינפרא אדום חושף חיישני ננו-צינורות DNA בודדים GT15 המשותקים על פני כיסוי זכוכית.

בהמשך חשוב לבדוק את החיישן לשימוש in vivo, למשל הרחבת ספריית האנליטים כך שתכלול מתחרים מולקולריים, בדיקת ליניאריות של תגובה במשטר הריכוז הרלוונטי מבחינה ביולוגית, וגם בדיקת הפיכות. לאחר השליטה, ניתן להשתמש בגישה זו כדי ליצור ספרייה של חיישנים סינתטיים שונים ממולקולות ללא רכיבי זיהוי מולקולאריים ידועים.