אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם

המטרות הכוללות של פרוטוקול זה הן לאסוף מדיום מותנה מתאי גזע עובריים של עכברים בתנאי סרום ותרבית ללא מזין ולאפיין את הפונקציות הביולוגיות של מדיום זה. הליך זה מספק תובנות לגבי הפעילות האנטי-הזדקנית של גורמים מסיסים המופרשים מתאי גזע עובריים של עכברים לפיתוח גישה טיפולית בטוחה ונטולת תאים למחלות הקשורות לגיל. מי שידגים את ההליך הזה יהיה ד"ר יון-אוי בה, פרופסור מחקר במעבדה שלי.

במכסה בטיחות ביולוגי, טפל בפיברובלסטים עובריים של עכבר או בתרבית תאי MEF עם 20 מיליליטר של מדיום MEF בתוספת מיטומיצין C בצלחת תרבית תאים של 15 סנטימטר למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולנתק אותם עם שלושה מיליליטר טריפסין EDTA למשך שלוש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. נטרול הטריפסין עם שישה מיליליטר של מדיום MEF טרי כאשר התאים התרוממו מתחתית הצלחת.

לאחר איסוף התאים על ידי צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום MEF וצלחו פעמיים 10 עד השישית המומת MEFs לכל צלחת תרבית של 10 סנטימטר במדיום MEF טרי. תרבית את תאי ההזנה למשך 24 שעות. לאחר מכן החלף את מדיום ה-MEF במדיום תאי גזע עובריים של עכבר וזרע פעמיים פי 10 עד שישי תאי גזע עובריים של עכבר על המזינים למשך 48 שעות לפחות של תרבית משותפת.

במכסה בטיחות ביולוגי, שטפו צלחת של תאי גזע עובריים של עכבר עם חמישה מיליליטר PBS ונתקו את התאים עם טריפסין בתוספת EDTA כפי שהודגם זה עתה. לאחר איסוף התאים על ידי צנטריפוגה, השעו מחדש את גלולת תאי הגזע בחמישה מיליליטר של מדיום תאי גזע טריים וצלחו מיליליטר אחד של תאים למנה במדיום תאי גזע עובריים טריים על חמש צלחות תרבית תאים מצופות ג'לטין. החזר את התאים לחממה עד שהתרבויות מגיעות למפגש של 80-85%.

לאחר מכן שטפו את התאים בלפחות שמונה מיליליטר PBS לצלחת למשך שלוש שטיפות של 10 דקות ולאחר מכן דגירה של 24 שעות במדיום סרום מופחת. לאחר לא יותר מ -24 שעות, העבירו את הסופרנטנט לצינור חרוטי של 50 מיליליטר לצנטריפוגה. לאחר מכן סינון דרך מסננת עליונה של בקבוק 0.2 מיקרומטר.

כדי לבדוק את ההשפעות של המדיום המותנה של תאי גזע עובריים על ידי בדיקת בטא גלקטוזידאז הקשורה להזדקנות, זרע פיברובלסטים עוריים אנושיים בצלחת שש בארות במדיום פיברובלסטים עורי אנושי. לאחר דגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, החלף מחצית מהמדיום במדיום מותנה של תאי גזע עובריים טריים של עכבר לתרבית נוספת של 72 שעות. ביום השלישי לתרבית יש לשטוף את התאים בשני מיליליטר PBS לבאר למשך שתי שטיפות של 30 שניות.

לאחר מכן, קבע את התאים ב-3.7% פרפורמלדהיד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר במכסה אדים. לאחר הקיבוע יש לשטוף את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS, כפי שהודגם זה עתה ולסמן את התאים במיליליטר אחד עד שניים של תמיסת בטא גל SA למשך 17 וחצי שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני. בתום תקופת הצביעה יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן, מכתים עם Eosen למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סדרה נוספת של שטיפות PBS, דמו את התאים בהגדלה של פי 100 על ידי מיקרוסקופ אור. לניתוח מחזור התא, זרע שמונה פעמים 10 עד הפיברובלסטים העוריים האנושיים הרביעי לבאר בצלחת תרבית תאים של שישה סנטימטרים במדיום פיברובלסטים עורי אנושי טרי לדגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

למחרת בבוקר, החלף מחצית מהמדיום במדיום מותנה של תאי גזע עובריים של עכבר והחזיר את התאים לאינקובטור. לאחר 24 שעות, קצרו את התאים על ידי דיסוציאציה של טריפסין EDTA ואחריה שתי שטיפות במיליליטר אחד של תמיסת PBS. השעו מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר תמיסת PBS קרה לאחר הכביסה השנייה.

לאחר מכן, תקן את התאים עם יישום חכם טיפה ב -200 מיקרוליטר אתנול קר תוך כדי מערבולת. אחסן את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר מכן, שטפו אותם בתמיסת PBS טרייה.

לאחר הצנטריפוגה השנייה, יש לטפל בגלולה עם 250 מיקרוליטר של מאגר נתרן ציטראט בתוספת RNase למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני. בתום הדגירה, סמן את התאים עם 250 מיקרוליטר של מאגר נתרן ציטראט המכיל פרופידיום יודיד למשך 20 דקות. לאחר מכן, העריכו את שלבי מחזור התא של כל דגימה על ידי ציטומטריית זרימה.

לניתוח PCR כמותי של טרנסקריפטאז הפוך, השתמש בערכת מיצוי RNA כדי לבודד את ה-RNA הכולל מפיברובלסטים עוריים אנושיים שטופלו במדיום מותנה של תאי גזע עובריים של עכבר על פי פרוטוקול היצרן. השתמש בספקטרופוטומטר כדי לכמת את סך ה-RNA שחולץ. לאחר מכן, נסח תערובת תגובה המכילה את פריימרים אוליגו דאוקסיתימידין ו-M-MLV reverse transcriptase בהתאם לפרוטוקול היצרן.

לאחר מכן הוסף מיקרוגרם אחד של ה-RNA הכולל לצינור ה-PCR המכיל את תערובת התגובה. לבסוף, מדוד את ההגברה של ה-CDNA עם מכונת PCR בזמן אמת באמצעות תערובת המאסטר PCR הירוקה ופריימרים הגנים המתאימים. תאי גזע עובריים של עכברים הגדלים בתנאי תרבית תאי גזע עובריים רגילים של עכבר על שכבת תאי הזנה MEF מציגים צורה אליפסה ומראה מבריק.

בעוד שתאי גזע עובריים של עכברים הגדלים בתנאי סרום ותרבית ללא מזין מדגימים מורפולוגיה שטוחה ולא סדירה. הטיפול בפיברובלסטים העוריים האנושיים המזדקנים במדיום מותנה של תאי גזע עובריים של עכבר מפחית את מספר התאים החיוביים לבטאגלקטוזידאז הקשורים להזדקנות. יתר על כן, ניתוח מחזור התא של תאים אלה מגלה כי טיפול במדיום מותנה בתאי גזע עובריים של עכבר מגדיל באופן דרמטי את מספר התאים בשלבים S ו-G2/M תוך הפחתת מספר התאים בשלב G0/G1.

בנוסף, טיפול במדיום מותנה בתאי גזע עובריים של עכבר מפחית את הביטוי של גנים הקשורים להזדקנות ושל ציטוקינים מזכירים הקשורים לפנוטיפ המזדקן. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור לאסוף את הסרום והמדיום ללא מזין לאחר 24 שעות, שכן דגירה ארוכה מגדילה את האפשרות לאוטוליזה של תאים או אפופטוזיס על ידי רעב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף מדיום מותנה של תאי גזע עובריים של עכבר ללא סרום ומזין לגישה נטולת תאים.

אל תשכח שעבודה עם מגיב כגון פרפורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון טיפול במגיב זה במכסה אדים, בעת ביצוע הליך זה.