ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

המטרות הכוללות של הליך זה הן לבודד ולאפיין תא תוך-אפיתל לא קונבנציונלי, אוכלוסיית תאי T גמא דלתא מדגימת מברשת אנדו-צווארית אנושית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהבנת האירועים החיסוניים בתוך התא התוך-אפיתל האנדוסרבי, כדי לסייע בתכנון אסטרטגיות יעילות למניעת זיהומים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כלי רב עוצמה ויעיל לחקר לימפוציטים גמא דלתא T תוך-אפיתליים אנדו-צוואריים, במבחנה.

תדגים את ההליך לורה רומרו, עמיתת מחקר בכירה מהמעבדה שלי. מיד לאחר האיסוף, הניחו את הצינור המכיל את מברשת הציטו על קרח. תוך שעה אחת מרגע האיסוף, מערבל את הצינור המכיל את הציטו-מברשת למשך ארבע פעימות של 10 שניות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור, והסר בזהירות את המברשת מבלי להפריע לפלטה. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום IMDM לתאים, והניחו את הצינור על קרח. הניחו את מברשת הציטו על גבי מסננת תאים של 100 מילימטר בצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ושטפו את המברשת עם 20 מיליליטר IMDM טרי.

צנטריפוגה את הכביסה. השעיה מחדש של הפלטה במיליליטר אחד של IMDM טרי, ובריכה עם שטיפה עם התאים בצינור איסוף הציטו-מברשת המקורית. כדי לנתח את התאים האנדו-צוואריים על ידי זרימה ציטומטרית, יש למנות 1 עד 3 פעמים 10 עד התא החמישי ב-100 מיקרוליטר של מאגר פקס לכל צינור של חמישה מיליליטר, ולסמן את התאים עם הנוגדנים וצבע הכדאיות המעניין למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים במיליליטר אחד של מאגר הערכה. לאחר סיבוב התאים, יש לשפוך לחלוטין את הסופרנטנט. השתמש בחרוזים ובנוגדנים המתאימים לבקרת IgG כדי להגדיר את בקרות הפיצוי.

לאחר מכן, טען את הצינור הראשון, והצב את השער על אוכלוסיית התאים האנדו-צוואריים הכוללת בתרשים פיזור קדימה לצד זה, ואחריו אי הכללה של כפילי התאים. אל תכלול את התאים המתים בהתאם לביטוי הצבע הכדאיות שלהם, שער על התאים החיים החיוביים CD45 ו-CD3 החיוביים. תאי גמא דלתא 1 וגמא דלתא 2 חיוביים מוגדרים כתת-אוכלוסיות של תאים חיוביים CD3 המבטאים גמא דלתא TCR.

כדי לבודד את תאי ה-T של גמא דלתא על ידי בידוד חרוזים מגנטיים, יש להשעות עד פעם אחת 10 עד לתאים האנדו-צוואריים הטריים השביעיים שנקטפו ב-40 מיקרוליטר של מאגר ערכת גמא דלתא MicroBead TCR. בהתאם להוראות היצרן לפרוטוקול הצביעה הדו-שלבי, סמן את התאים בנוגדני גמא דלתא הפטן נגד TCR, ואחריו מיקרו-חרוזים מצומדים נגד FITC למשך 15 דקות בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים במיליליטר אחד של מאגר הערכה, ולשפוך לחלוטין את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ערכה, והניחו את מתלה התא ישירות על עמוד חרוז מגנטי המוגדר במגנט המפריד המתאים, ואספו את הזרימה בצינור חדש. כאשר כל התאים עברו דרך העמוד, שטפו את העמוד שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של חיץ טרי, ואגדו את השטיפות עם התאים שנאספו. כדי לאסוף את תאי ה-T של גמא דלתא, העבירו את העמודה לתוך צינור חרוטי והשתמשו בבוכנת העמודה כדי לשטוף את תאי ה-T מהעמודה עם מיליליטר אחד של מאגר טרי.

כדי לבודד את תאי ה-T של גמא דלתא על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, סמן את התאים בצבע בר-קיימא, בלוח הנוגדנים כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, מיין את התאים לפי הצבע הבר-קיימא שלהם, וחיובי CD45, CD3 וגמא דלתא. ניתן לזהות בקלות אוכלוסייה ייחודית של תאי T המבטאים תאי T של גמא דלתא V1 בדגימות תאים אנדו-צוואריים אנושיים.

ניתוח פנוטיפי מפורט של תאי גמא דלתא חיוביים חיוביים CD3 מגלה שרוב התאים הללו הם CD4 ו-CD8 שליליים. הפרדת חרוזים מגנטיים של התאים האנדו-צוואריים, כפי שהודגם זה עתה, מביאה לטיהור של כמעט 98% אוכלוסייה טהורה של תאי גמא דלתא TCR אלה. ניתן להשיג רמת טוהר זו גם באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, המאמת את השימוש בכל אחת מהטכניקות לבידוד תאי T גמא דלתא אנדו-צוואריים.

מעניין לציין כי הניתוח של תאים תוך-אפיתליים אנדו-צוואריים, תאי T גמא דלתא, שנקטפו מחולות נגועות ב-HIV ובקרות תורמות בריאות, מדגים ירידה קלה במספרם ובכדאיות של תאים חשובים אלה באנשים נגועים ב-HIV. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבד במהירות את הדגימה, ולשמור על התאים על קרח לאורך כל ההליך, כדי לשמור על כדאיות תאים טובה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מיון תאים בודדים בשילוב עם PCR מרובה תפוקה בעל רגישות גבוהה, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מסלולי הדלקת והאיתות בתוך התא התוך-אפיתל האנדו-צווארי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום HIV ומחלות זיהומיות לחקור סמנים תאיים חדשים לפגיעות רירית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין לימפוציטים תוך-אפיתליים מדגימת מברשת אנדו-צווארית אנושית.