ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

המטרות הכוללות של פרוצדורה זו הן לבודד ולאפיין אוכלוסייה של תאי T מסוג גמא-דלתא, שהם תאים תוך-אפיתליאליים לא שגרתיים, מדגימה של מברשת endocervical אנושית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בהבנת האירועים החיסוניים בתוך המדור התוך-אפיתליאלי של endocervix, כדי לסייע בתכנון אסטרטגיות יעילות למניעת זיהומים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כלי רב עוצמה ויעיל לחקר לימפוציטים מסוג T גמא-דלתא תוך-אפיתליאליים של endocervix, in vitro.

את הפרוצדורה תדגים לורה רומרו, עמיתת מחקר בכירה מהמעבדה שלי. מיד לאחר האיסוף, הניחו את הפפלה המכילה את ה-cytobrush על קרח. בתוך שעה מהאיסוף, בצעו ערבוב ב-vortex לפפלה המכילה את ה-cytobrush בארבעה פולסים של 10 שניות.

לאחר מכן, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה והוציאו בזהירות את המברשת מבלי להפריע למשקע. כעת, הוסיפו מיליליטר אחד של מצע IMDM לתאים, והניחו את המבחנה על קרח. הניחו את ה-cytobrush על מסנן תאים של 100 מילימטר בתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר, ושטפו את המברשת עם 20 מיליליטר של IMDM טרי.

סבבו את השטיפה בצנטריפוגה. השביו את המשקע ב-1 ml של IMDM טרי, ואחדו אותו עם השטיפה והתאים בתוך פקעון האיסוף המקורי של ה-cytobrush. כדי לנתח את התאים האנדו-רוחביים (endocervical cells) באמצעות ציטומטריית זרימה, חלקו מנות של 1-3 $\times$ 10⁵ תאים ב-100 µl של fax buffer לכל פקעון של 5 ml, וסמנו את התאים עם הנוגדנים וצבע הבדיקה לחיוניות (viability dye) הרלוונטיים למשך 30 דקות ב-4 °C בחושך.

בסיום האינקובציה, שטפו את התאים ב-1 mL של חוצן הערכה (kit buffer). לאחר סבוב של התאים בצנטריפוגה, שפכו את העלייה (supernatant) באופן מלא. השתמשו בחרוזים ובנוגדני IgG ביקורת המתאימים כדי לקבוע את בקרות הפיצוי (compensation controls).

לאחר מכן, טען את המבחנה הראשונה, והגדר שער (gate) על כלל אוכלוסיית התאים האנדו-צוואריים בגרף פיזור של forward scatter לעומת side scatter, ולאחריו החרג את הכפולים התאיים (cell doublets). החרג את התאים המתים בהתאם לביטוי צבע החיוניות שלהם, תוך הגדרת שער על תאים חיים חיוביים ל-CD45 וחיוביים ל-CD3. תאים חיוביים ל-gamma delta one ול-gamma delta two מוגדרים כתתי-אוכלוסיות של תאים חיוביים ל-CD3 המבטאים gamma delta TCR.

כדי לבודד תאי gamma delta T באמצעות בידוד באמצעות חרוזי מגנט, השביה מחדש עד 1×10⁷ תאי צוואר רחם פנימיים שנקצרו טריים ב-40 µL של בופר מערכת TCR gamma delta MicroBead. בהתאם להוראות היצרן עבור פרוטוקול סמיכה דו-שלבי, סמן את התאים עם נוגדן anti-TCR gamma delta hapten, ולאחריו עם חרוזי MicroBeads מצומדים ל-anti-hapten FITC למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 עד 8 °C. בסיום האינקובציה, שטוף את התאים ב-1 mL של בופר המערכה, ורוקן לחלוטין את העילאי.

שחזר את התאים ב-500 microliters של בופר מהערכה, והעבר את תרחיף התאים ישירות לעמודת חרוזים מגנטית הממוקמת במגנט הפרדה מתאים, תוך איסוף הנוזל העובר למבחנה חדשה. כאשר כל התאים עברו דרך העמודה, שטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 microliters של בופר טרי, ואסוף את השטיפות יחד עם התאים שנאספו. כדי לאסוף את תאי ה-gamma delta T, העבר את העמודה למבחנה קונית, והשתמש בבוכנה של העמודה כדי לשטוף את תאי ה-T מהעמודה באמצעות one milliliter של בופר טרי.

כדי לבודד את תאי ה-gamma delta T באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), סמנו את התאים בצבע חיוניות, כפי שהודגם כעת בלוח הנוגדנים. לאחר מכן, מיין את התאים על פי צבע החיוניות, וביטוי חיובי של CD45, CD3 ו-gamma delta. ניתן לזהות בקלות אוכלוסייה ייחודית של תאי T המבטאים gamma delta V1 בדגימות של תאי צוואר הרחם האנושי.

ניתוח פנוטיפי מפורט של התאים שסוננו כ-CD3 חיוביים ו-gamma delta one חיוביים חושף כי רוב תאים אלו הם CD4 ושליליים ל-CD8. הפרדה באמצעות חרוזי מגנט של תאי צוואר הרחם (endocervical cells), כפי שהודגם הרגע, מובילה לטיהור של אוכלוסייה טהורה במידה של כמעט 98% של תאי TCR gamma delta אלו. רמה זו של טוהר ניתנת להשגה גם באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), מה שמעיד על תקפות השימוש בכל אחת מהטכניקות לבידוד תאי T gamma delta מהצוואר הרחמי.

מעניין לציין כי ניתוח של תאי אפיתל תוך-רקמתיים מהצוואר הרחב, תאי T מסוג גמא-דלתא, אשר נאספו מחוליות נשים נגועות ב-HIV וממדוני תורמים בריאים, מראה ירידה קלה במספרן ובחיוניותן של תאים חשובים אלו בקרב אנשים נגועים ב-HIV. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן להשלימה תוך שעתיים עד שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבד את הדגימה במהירות, ולהקפיד להחזיק את התאים על קרח לאורך כל התהליך, כדי לשמור על חיוניות תאים טובה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיון תאים בודדים בשילוב עם multiplex PCR בעל תפוקה גבוהה ורגישות גבוהה, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע למסלולי הדלקת והסיגנלינג בתוך המדור האינטראפיתליאלי של endocervical. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי ה-HIV והמחלות הזיהומיות לחקור סממני תא חדשים של פגיעות רירית. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן ההכנה של לימפוציטים אינטראפיתליאליים מדגימת מברשת של endocervical אנושי.