שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

המטרה הכוללת של בדיקה תפקודית במבחנה זו היא להעריך היבטים שונים של פגוציטוזיס בתיווך FC. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האימונוהמטולוגיה ורפואת עירוי דם כגון מהי המשמעות הקלינית של נוגדנים עצמיים ואלו לתאי דם אדומים. טכניקה זו מספקת בדיקה ביולוגית פונקציונלית שניתן לבצע במבחנה לחיזוי תוצאת העירוי באותם חולים עם נוגדנים מוכנים מראש כנגד כדוריות דם אדומות.

מי שתדגים את ההליך תהיה סינדי טונג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. עכשיו אל תשכח שעבודה עם דם אנושי עלולה להיות מסוכנת וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת חלוקי מגן וכפפות בעת ביצוע הליך זה. לאחר השגת דגימות דם מלאות של 10 מיליליטר מתורם בריא בצינורות ואקוטיינר המכילים חומצה ציטראט דקסטרוז על ידי ניקור ורידים, הצינורות מוכנסים לארון בטיחות ביולוגית מסוג II והדם מדולל ביחס של אחד לאחד במדיום שלם וחם.

לאחר מכן, פיפטה איטית של תאי הדם לאורך דפנות צינור הצנטריפוגה על שיפוע צפיפות טמפרטורת החדר, תוך הקפדה לא לערבב את השכבות. הפרד את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן, השליכו את שכבת הפלזמה העליונה והשתמשו בפיפטה מזכוכית של פסטר כדי להעביר את ה-PBMC המכיל מעיל באפי לתוך שפופרת חדשה של 15 מיליליטר.

שטפו את ה-PBMCs המבודדים שלוש פעמים ב-PBS, והשעו את התאים בשלושה עד שבעה מיליליטר של מדיום לאחר צנטריפוגה שלישית. לאחר הספירה, יש לדלל את התאים ל-1.75 כפול 10 עד שישי תאים לריכוז מיליליטר בתווך שלם ולזרוע 400 מיקרוליטר תאים לכל באר של שקופית בת שמונה חדרים לדגירה של שעה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בלחות מלאה. כדי לאגד את תאי הדם האדומים R2R2, יש לשטוף תחילה את כדוריות הדם האדומות שלוש פעמים ב-PBS.

יש לדלל את גלולת R2R2 לאחר הצנטריפוגה השלישית ביחס של אחד לאחד עם נוגדנים אנטי-D רב-שבטיים מסרום אנושי למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב לסירוגין. בתום האופסוניזציה, הוציאו את התאים מהאינקובטור ולאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים נוספות ב-PBS כפי שהודגם זה עתה. השעו מחדש את הגלולה לנפח של 1.25% במדיום RPMI שלם.

לאחר מכן, החלף את הסופרנטנט מכל באר של המגלשה בת שמונה התאים ב-400 מיקרוליטר של תאי R2R2 האופסונים למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, השתמש במתאמי ההחלקה כדי להסיר את התאים, ולטבול את עודפי ה-R2R2 במגבת נייר. כעת, מלאו של 100 מיליליטר ב-PBS וטבלו לאט כל שקופית 30 עד 40 פעמים בתמיסת המלח כדי להסיר את רוב ה-R2R2 הלא פגוציטוזה.

לאחר הייבוש, תקן את השקופיות ב-100% מתנול למשך 45 שניות ואפשר לתאים להתייבש לפני הרכבת הדגימות עם כיסוי. למחרת, טען כל שקופית על מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם עדשת אובייקטיבית של פי 40 וספור ידנית לפחות 200 מונוציטים ואת מספר ה-R2R2 הפגוציטוזי בתוך כל מונוציט באמצעות מונה אחד בכל יד כדי לכמת בו זמנית את מספר המונוציטים ואת מספר תאי ה-R2R2 הפגוציטוזיים לכל דגימה. אימונוגלובולין תוך ורידי נקשר וחוסם קולטני FC המעכבים פגוציטוזיס באופן תלוי מינון עם עיכוב של כמעט 100% שנצפה החל מריכוזי 200 מיקרוגרם של אימונוגלובולין תוך ורידי למיליליטר וכמעט ללא עיכוב שנצפה בריכוזים מתחת ל-0.5 מיקרוגרם של המעכב.

כאשר המדדים הפגוציטים מנורמלים לבקרה החיובית R2R2 כעיכוב של 0%, ניתן לקבוע עקומת עיכוב עם IC 50 של שלושה מיקרוגרם למיליליטר. עם ניסיון, ניתן להשתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להבחין בין מונוציטים לבין תאי דם אדומים מזהמים ו-vacuoles מתאי דם אדומים פגוציטוזיים. יש להימנע מצבירי תאים צפופים ופסולת במהלך הכימות כמו גם מאופסוניזציה יתר של תאי הדם האדומים R2R2, מה שעלול להוביל לפגוציטוזיס מוגבר שמצטופף יתר על המידה בפנים המונוציטים ומפריע לניתוח פגוציטי מדויק.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שש עד שמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוציטוכימיה או אימונופלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ביטוי חלבון פגוציטי, אינטראקציות של תאי דם אדומים ומידור. עם פיתוחה הראשוני ואופטימיזציה נוספת, טכניקה זו תסייע לאופן שבו חוקרים בתחומי רפואת עירוי וביולוגיה של התא חוקרים מערכות אופסוניזציה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקת חד-שכבתית מונוציטים כדי להעריך את סוגי האינטראקציה של נוגדנים המעוררים פגוציטוזיס.