בחיי עיר זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני

ננו-חלקיקים נמצאים בשימוש הולך וגובר בתעשייה וברפואה בשל תכונותיהם הפיזיוכימיות הייחודיות. עם זאת, החששות לבריאות האדם הקשורים לחשיפה ממושכת לננו-חלקיקים נמשכים. ניתן לכמת סיכונים אלה על ידי חקר ההתנהגות של ננו-חלקיקים בתוך התאים והתגובות המטבוליות המושרות של תאים לננו-חלקיקים.

זה נובע בחלקו מהיעדר שיטות המאפשרות זיהוי וכימות של ננו-חלקיקים מופנמים בתא סינסל. בעוד שניתן להשתמש בכלים אנליטיים רבים, כולל מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה, כדי להעריך את הספיגה התאית של ננו-חלקיקים, אלה מספקים מידע איכותי רק ברמה מיקרוסקופית. נהפוך הוא, שיטות באתרן המבוססות על ספקטרוסקופיה אטומית יכולות להפחית את כמות חפצי ההדמיה הנובעים מהכנת הדגימה ויכולות להניב תצפית ישירה על ננו-חלקיקים.

כדי לנצל זאת, אנו מציגים גישה מתאמת המאפשרת לנו לחקור ננו-חלקיקים במצב המקורי או במיטת מעבדה עם תג פלואורסצנטי. כאן, אנו מתארים שיטה המבוססת על שילוב של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח מיקרו-בדיקה גרעינית. זה מספק תמונות של צפיפות התא, התפלגות מיוחדת של יסודות כימיים וכמות הננו-חלקיקים לתא.

כהדגמה, נחקור מתאים שנחשפו לננו-חלקיקי טיטניום דו חמצני במשך 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח מיקרו-בדיקה גרעינית. עבור פרוטוקול זה, יש צורך במחזיק מדגם מותאם אישית המיוצר עם הפולימר PEEK. זה חייב להיות מתאים לתרבית תאים ולתצפיות במבחנה.

מכסים את המחזיק בנייר כסף פוליקרבונט בעובי שני מיקרון. רדיד הפוליקרבונט מודבק לצלחת PEEK בשכבה דקה של תמיסת Formvar. לאחר ההרכבה, יש לעקר את מחזיק המדגם.

ניתן לאחסן מספר מחזיקי דגימות סטריליים, אחד לכל באר, בצלחת סטרילית של שתים עשרה בארות עד שהם נחוצים לשימוש. תאים שעברו טרנספטציה עם פלסמידים GFP בשורת מטריצה נבדקים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שהטרנספקציה התרחשה בהצלחה, ושהם מבטאים את החלבון הפלואורסצנטי. קצרו את התאים עם טריפסין, ודגרו אותם במשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

עצור את פעולת הטריפסין על ידי הוספת מדיום תרבית טרי. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב -1200 סיבובים לדקה בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והוסף נפח מתאים של מדיום תרבית טרי.

ספרו את התאים ובצעו דילול עם מדיום תרבית שלם טרי ותרמוסט כדי לקבל תרחיף תאים של 500 תאים למיקרוליטר. צלחת טיפה של 40 מיקרוליטר במרכז רדיד הפוליקרבונט. מניחים בזהירות את הדגימה בחממת התאים למשך שעתיים.

מוסיפים בעדינות שני מיליליטר מדיום תרבית טרי ומשאירים אותם למשך 24 שעות. ננו-חלקיקי תחמוצת טיטניום פלואורסצנטיים תוכננו, סונתזו והושתלו בפלואורופורים נפוצים על מנת לזהות, לעקוב ולמקם ננו-חלקיקים במבחנה. לשלב זה כבר היה צריך להכין תרחיף ננו-חלקיקים טיטניום דו חמצני במים טהורים במיוחד בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר.

לפזר את הננו-חלקיקים באמצעות פולסים סוניקציה אינטנסיביים באורך דקה בטמפרטורת החדר. לדלל את הננו-חלקיקים במדיום תרבית מתאים כדי לקבל תרחיף חשיפה של ארבעה מיקרוגרם לסנטימטר מרובע. החלף את המדיום הקודם של תרבית התאים למדיום החדש המכיל ננו-חלקיקים וערבב אותו בעדינות כדי להשיג התפלגות ננו-חלקיקים הומוגנית.

הכן קבוצה של תאי בקרה באותו אופן ללא תוספת של ננו-חלקיקי טיטניום דו חמצני. דגירה על אוכלוסיות התאים למשך 24 שעות. באמצעות פרפורמלדהיד, דגימות אלו עשויות להיות קבועות ומעובדות להדמיה באתרה ובתא בודד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

קיבוע פיזיקלי קריוגני, לעומת זאת, שומר על מבנה התא ועל שלמותו הביוכימית. קיבוע הקפאת צלילה עוצר במהירות את הפעילות התאית תוך אלפיות שנייה ונמנע משימוש בתרכובות מקבעות. כדי לתקן את התאים באופן קריוגני, אנו מבצעים את הפעולות הבאות.

הכן צלחת העברת אלומיניום על ידי קירורו בחנקן נוזלי. אחסן את הצלחת בקופסה מלאה בחנקן נוזלי, תוך שמירה על משטח הצלחת מעל הנוזל באדי החנקן הקרים. מצננים כמות מספקת של 2-מתילבוטן ל-150 מעלות צלזיוס.

הכינו בז אחד של 50 מיליליטר עם מדיום תרבית ושני בזים עם מים טהורים במיוחד. ודא שנייר סופג נמצא בקרבת מקום כדי לייבש את הדגימה לפני הקפאתו. שטפו תאים פעם אחת במדיום תרבית ולאחר מכן פעמיים נוספות במים סטריליים וטהורים במיוחד כדי להסיר עודפי מלחים שנותרו במדיום התרבית.

יבש במהירות את הדגימה על הנייר הסופג. צלול-הקפיא את התאים ב-2-מתילבוטן המצונן למשך 30 שניות והניח אותם על צלחת העברת האלומיניום המצוננת. חשוב לשמור על הקופסה סגורה ככל האפשר על מנת למנוע התעבות אדי מים על משטח הצלחת הקרה.

לאחר הקפאת כל הדגימות, ייבוש בהקפאה מתבצע בשיטה הבאה כדי לסלק מים. ראשית, בצע ייבוש ראשוני למשך 12 עד 24 שעות בלחץ נמוך ובטמפרטורה נמוכה. לאחר מכן, תוך שמירה על לחץ נמוך, בצע שלב ייבוש משני למשך 24 שעות לפחות כאשר טמפרטורת הצלחת מוגברת ל-40 מעלות צלזיוס.

לאחר הקפאה ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורת החדר למשך מספר ימים בתנאים סטריליים ויבשים המוגנים מפני אבק ולחות. ניתוח מיקרו-גשושית גרעינית נערך במתקן Ifera בבורדו, צרפת. מאיץ חלקיקים סינגלטרון של 3.5 מגה-וולט מספק אלומת יונים קלה בתחום האנרגיה של מגה-אלקטרון וולט.

הדמיית יסודות כימיים בוצעה על קו האלומה של המיקרו-בדיקה באמצעות טכניקות אנליטיות משלימות של קרן יונים. הטכניקות המשמשות באמצעות מיקרו-PIXE, פליטת קרני רנטגן המושרה על ידי חלקיקים, STIM, מיקרוסקופ יונים שידור סריקה ומיקרו-RBS, ספקטרומטריית פיזור אחורי של רתרפורד. הדגימות ממוקמות בתוך תא הניתוח ומוקרנות תחת ואקום עם חלקיקים שונים על מנת לבצע ניתוחי אלומת יונים שונים.

STIM משמש לתיעוד מפות צפיפות אוויר של תאים על סמך חלקיקי האנרגיה המשתחררים העוברים דרך אזורים של תאים בעלי צפיפות שונה. ניתוח Micro-PIXE ו-micro-RBS מספקים את ההתפלגות המרחבית והכימות של יסודות כימיים ברמת תא בודד. מיקרו-קרן פרוטון של 1.5 מגה-אלקטרון וולט ממוקדת עד לקוטר של כ-1 מיקרומטר והיא נסרקת על פני התאים המעניינים, שזוהו על ידי STIM.

קרני רנטגן הנפלטות מאטומים הקיימים בדגימה, החל מנתרן ועד טיטניום, מאפשרות לקבוע את ריכוזי היסודות. פרוטונים מפוזרים לאחור נאספים על מנת למדוד את המספר הכולל של החלקיקים הנכנסים הנדרשים כדי לנרמל את עוצמות קרני הרנטגן. זה קריטי שיהיו תקני כיול מוסמכים לכימות ריכוזי היסודות על מנת לכייל את תגובת גלאי הרנטגן.

על מנת לנתח את נתוני אלומת היונים, פיתחנו תוסף חדש ל-ImageJ. ראשית, חושבו מפות צפיפות STIM. ניגודיות בסריקת תמונות מיקרוסקופ ברזל שידור נובעת מהבדלים מקומיים בצפיפות ומאפשרת זיהוי של מבני תאים כגון הגרעין והציטופלזמה.

ניתן לעבד מספר מפות בבת אחת. כל מפה מתאימה לתווך המועבר אנרגיה מחלקיקים נכנסים. השלב השני בניתוח נתונים מורכב מחישוב ספקטרום תאים בודדים.

ניתוח פליטת קרני רנטגן המושרה על ידי חלקיקים מניב הן את ההרכב הכימי של הדגימה והן את מפות היסודות של יסודות כימיים. מפות יסודות כימיים מחושבות לאחר מיון פוטונים לפי מיקום האלומה בזמן ההקלטה ובחירת חלון אנרגיה שבמרכזו יסוד ספציפי. מפות מייצגות בדרך כלל את מספר האירועים שזוהו במיקום האלומה ומכילות נתונים כמותיים.

מחושבת ערימה של מפות כימיות, אחת לכל יסוד שנבחר. אזורי עניין עבור כל תא נמצאים באמצעות נתוני PIXE עבור זרחן. הספקטרום המתאים לכל תא שלם מחושב לאחר מכן על ידי סיכום הספקטרום הבודד על פני אזור העניין של כל תא.

מכאן ניתן לחלץ נתונים כמותיים על השפע הכימי בכל תא באמצעות תוכנת ניתוח ייעודית PIXE ו-IBS. כאן אנו מראים תמונות פלואורסצנטיות של תאים לאחר קיבוע פרפורמלדהיד. השורה העליונה מציגה תאים שלא נחשפו לננו-חלקיקי טיטניום דו חמצני בעוד שהשורה התחתונה נחשפה.

הערוץ הכחול מראה את גרעין התא, הערוץ הירוק מראה מיטוכונדריה, והערוץ האדום מראה טיטניום. ניתן לראות בבירור כי אין טיטניום דו חמצני בבקרות. מהערוץ הממוזג מימין ניתן לראות כי ננו-חלקיקים נמצאים אך ורק בציטופלזמה ואינם נכללים במיטוכונדריה.

מה שחסר לשיטה זו, לעומת זאת, הוא מידע כמותי על ריכוז הננו-חלקיקים. ניתוח מיקרו-גשושית גרעינית יכול לקוות לספק זאת. כל התמונות הללו צולמו באמצעות טכניקות שונות לניתוח מיקרו-בדיקות.

שוב, השורה העליונה מציגה את תאי הביקורת, והשורה התחתונה מציגה תאים שמכילים ננו-חלקיקי טיטניום. התמונה השמאלית ביותר מציגה מדידות STIM של צפיפות התאים הקבועים קריוגנית. שלושת הפאנלים הבאים מראים את שפע האשלגן, הזרחן והטיטניום הקיימים בתאים המתקבלים על ידי PIXE.

שוב, שום טיטניום אינו נראה בבקרות וגם לא בגרעיני התא. על מנת לכמת, תא אחר תא, את ספיגת הטיטניום, אנו מגדירים אזורי עניין על סמך גבולות התא המוצגים בפאנל הימני ביותר ומודדים את שפע היסודות באזורים אלה. ממדידות PIXE אלה, שרטטנו את התפלגות השפע היסודי ברמת התא הבודד עבור הביקורת והאוכלוסיות החשופות.

אוכלוסיית הביקורת משורטטת בלבן, והאוכלוסייה החשופה משורטטת בצהוב. התכולה החציונית של טיטניום הקיימת כאן נמוכה למדי בהשוואה למינון החשיפה של ארבעה מיקרוגרם לסנטימטר רבוע. טווח ספיגת הטיטניום מראה שונות גדולה על פני האוכלוסייה, מ-0.2 מיקרוגרם לסנטימטר רבוע ועד 1.8 מיקרוגרם לסנטימטר רבוע.

שמנו לב גם לעלייה של יונים תוך-תאיים חופשיים כגון אשלגן וסידן בדגימות שנחשפו לננו-חלקיקים, מה שמרמז על שינוי בהומאוסטזיס התאי הנגרם על ידי נוכחות של ננו-חלקיקי טיטניום דו חמצני. ניתוח מיקרו-בדיקה גרעינית יכול לספק מידע שימושי ברמה התת-תאית ומספק כימות של היסודות הכימיים המרכיבים דגימה ביולוגית. טכניקות אלו מציגות יתרונות רבים.

האחת, בהכנת דגימה שאינה דורשת קיבוע כימי. שנית, האפשרות לחקור תחומים גדולים יותר עם יכולת להתמקד בתחומי עניין נוספים. שלוש, כימות יסודות כימיים ברגישות של כמה מיקרוגרם לגרם.

וארבע, זיהוי תאי תאים כמו הגרעין, הגרעין והציטופלזמה. הקביעה המדויקת של אלה, בעת חקר ההפנמה של ננו-חלקיקים בתאים בודדים, חיונית לטוקסיקולוגיה כמותית של ננו-חלקיקים. כפי שמוצג במקרים שנחקרו כאן, היכולת להתבונן ולכמת ננו-חלקיקים בתוך תאים בודדים מאפשרת לנו להבין טוב יותר את הצטברות הערך של יסודות כימיים אנדוגניים ואקסוגניים, כגון ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת.

פרוטוקול זה מדגיש את ההתאמה של ניתוח מיקרו-גשושית גרעינית למחקרים עתידיים של אינטראקציה של ננו-חלקיקים עם תאים חיים. הגישה הכמותית נותנת מידע על ההשפעה של ננו-חלקיקים אלה במונחים של זיהוי, זיהוי, לוקליזציה וכימות, וברמת התא הבודד עבור ננו-חלקיקים מקומיים וכימיים כאחד.