מתכות הדמיה ברקמת המוח על ידי אבלציה לייזר - פלזמה מצמידים אינדוקטיבי - ספקטרומטריית מסה (LA-ICP-MS)
22 בינואר 2017
כמותית מיפוי מתכות ברקמות ידי אבלציה ליזר - אינדוקטיבי פלזמה מצמידה - ספקטרומטריית מסה (LA-ICP-MS) הנה שיטה אנליטית רגישה שיכול לספק תובנה חדשה איך מתכות להשתתף בתהליכי פונקציה ומחלות נורמלים. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמית מתכות כמותית בסעיפים דקים של רקמת נוירולוגית עכבר.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לכמת את ההתפלגות המרחבית של מתכות בחתכים של רקמה באמצעות ספקטרומטריית מסות עם פלסמה המושרה השראית לאחר אבלציה בלייזר (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry). שיטה זו יכולה לספק מענה לשאלות מפתח הן בביולוגיה בסיסית והן במחקר מחלות, ובמיוחד במצבים שבהם ביוכימיה של מתכות מעורבת בפתולוגיה של המחלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא שומרת על מידע מרחבי לגבי המתכות, מידע שבאופן מסורתי אובד בשימוש בטכניקות רגילות לניתוח מתכות.
ההשלכות של טכניקה זו חולקות לכיוון של טיפול ואבחון של מחלות נוירודגנרטיביות, מכיוון שהיא מאפשרת לנו לנטר כיצד מתכתים משתנים באזורי מוח המראים מוות של תאים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות בהקמה של ניסויים ארוכים ומורכבים אלו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן תכנון הניסוי וניתוח הנתונים עלולים להיות מאתגרים, כיוון שכל שלב חייב להתבצע בסדר ספציפי.
ראשית, הנח דגימת רקמת מוח ואת כל סטנדרטי הרקמה התואמים למטריצה בתא האבלאציה הלייזרית. ודא שהדגימות נמצאות בתוך עומק השדה של מצלמת ה-LACCD. סגור את דלת התא והדק את הבורגים בעזרת האצבעות.
לאחר מכן, בתוכנת ה-ICPMS, פתח את שסתום גז הנשיאה והגדר את קצב הזרימה ל-1.2 liters per minute. בתוכנת ה-LA, בצע שטיפה (purge) של תא האבלאציה בעזרת גז הנשיאה למשך 30 דקות. עבור תא אבלאציה בעל נפח כפול, העבר את במת הדגימה לכל אחת מפינות התא בכל עשר דקות כדי להפחית את כמות האוויר השארי בתא.
הפעילו את ה-ICPMS והמתינו שעתיים לחימום המכשיר. בזמן חימום המכשיר, שרטטו בתוכנת ה-laser ablation קו אבלציה באורך של כ-שלושה מילימטרים על פני השטח של סטנדרט הרקמה הראשון. לחצו על קו האבלציה והגדירו את קוטר הגרם ברירת המחדל, את מהירות הסריקה ואת השפע הקריני (radiant fluence).
שכפל את הקו שש פעמים, במרווחים השווים לקוטר האלומה. חזור על תהליך זה עבור כל תמיסת סטנדרט. לאחר מכן, השתמש בכלי הקו כדי לסמן את אזור האבלציה על הדגימה, מהפינה השמאלית העליונה דרך הנקודה הרחבה ביותר של הדגימה, תוך שימוש באותם פרמטרים ששימשו עבור הסטנדרטים.
שכפלו את הקו לפי הצורך כדי להבטיח כיסוי מלא של הדגימה, באותם מרווחים שבהם נעשה שימוש בתקנים. לאחר מכן, שרטטו סדרת קווים לסריקה לסירוגין של התקנים, לא יאוחר מ-20 שעות לאחר סריקת הדגימה, או בין כל דגימה. הוסיפו סריקה של התקנים לסוף הניסוי.
בהתבסס על אורך הקו ומהירות הסריקה, קבעו את זמן האנליזה עבור קווי הדגימה והסטנדרט. לאחר מכן, צרו batch חדש בתוכנת ה-ICPMS ובחרו בניתוח בעת רזולוציה של זמן (time resolved analysis). בחרו את ערכי יחס המסה למטען הרלוונטיים, והגדירו את זמני האינטגרציה עבור כל יחס, כך שזמן האינטגרציה הכולל למחזור אחד יהיה 0.25 שניות.
שמרו את ה-batch. עבור batch סטנדרטי, מלאו את זמן האנליזה עבור כל שורה עם חיץ (buffer) נוסף של 15 שניות כדי להוסיף זמן לחימום הלייזר ולזמני שטיפה (washout). הגדירו רשימת הרצות דגימות עם רכישה (acquisition) עבור כל שורת סטנדרט.
עבור סדרת הדגימות, שכפל את סדרת התקנים, והתאם את הזמנים ואת מספר הרכישות בהתאם לתבנית השחייה (ablation) של הדגימה. לאחר שה-ICPMS התחמם, הוסף את הסדרה הראשונה לתור, וודא שהתוכנה ממתינה לטריגר ממכשיר ה-LA. לאחר מכן, בתוכנת ה-LA, הפעל את ספק הכוח של הלייזר, והגדר את זמני החימום והשטיפה (washout) של הלייזר.
הפעילו את רצף הלייזר, ובדקו שה-ICPMS מתחיל נכון באיסוף הנתונים לאחר האבלציה. ברגע שהנתונים נאספו, הפיקו את הנתונים עבור התקנים מקבצי ה-CSV. בצעו תיקוני בסיס (baselines) של המתיחה, והשמיעו את אות הרקע.
זהו ירידות באותה שנגרמו מחורים בדגימות הרקמה הסטנדרטיות. הסתיר אזורים אלו בעלי האות הנמוך, ולאחר מכן ייצא את הנתונים כגיליון אלקטרוני. חשב מקדם המרה מ-CPS ל-PPM עבור כל יסוד שזוהה.
חזור על תהליך זה עבור כל תמיסת סטנדרט. לאחר מכן, פתח את התוכנה לבניית תמונות כמותיות וייבא את נתוני הדגימות מקבצי ה-CSV. בחר מספר אזורים ברקע כדי לבצע תיקון רקע.
בחרו את כלי עריכת הגרפים, לחצו לחיצה ימנית על התמונה ובחרו בשינוי מראה התמונה (modify image appearance). שנו את הצבע הראשון ב-Z לערך שלילי גדול, ולחצו על "בוצע" (done) כדי להדגיש את אות הרקע. לאחר מכן, בלשונית הסטנדרטים, הזינו את גורמי התיקון של ה-CPS PPM עבור כל סטנדרט ולחצו על "הפעל" (go).
פתחו את דפדפן הנתונים בלשונית הנתונים, לחצו קליק ימני על קובץ תמונה מתוקן, ובחרו ב-"new image". פתחו את חלון שינוי מראה התמונה (modify image appearance) והגדירו את טבלת הצבעים ואת קנה המידה. השתמשו בכלי הוספת ההערות (add annotation) כדי להציב סרגל צבעים על התמונה.
כוון את סורגל הצבעים בחלון סורגל הצבעים. לאחר שהתמונה צבעה ואנוטציה (סימון) בוצעה, העתק והדבק את התמונה לתוכנה אחרת, או ייצא את התמונה מתוכנת בניית התמונות. כדי להפעיל את כלי ה-ROI, בחר "עיבוד תמונה" (image processing) מחבילות הניתוח ובחר תמונה.
בלשונית התמונה, לחצו על ROI והתחילו את שרטוט ה-ROI. בחרו את אזור העניין ולאחר מכן לחצו על finish ROI. בלשונית התמונה, לחצו על stats כדי לקבל את נתוני ה-ROI.
העתיקו והדביקו את הנתונים לגיליון אלקטרוני, והקפידו לשמור לאחר הוספת כל ROI. חזרו על התהליך לפי הצורך. באמצעות טכניקה זו נחקרו תכולת המתכת וההפצה שלה במוח של עכבר מסוג wild type.
כאן, ההתפלגויות של פחמן, מגנזיום וזרחן מוצגות בספירות לשנייה. תמונות כמותיות מוצגות עבור מנגן, נחושת, ברזל ואבץ. ההתפלגות של הפחמן שימשה כסטנדרט פנימי.
ברזל היה השכיח ביותר במוח האמצעי ובגיירוס המשונן (dentate gyrus). אבץ היה השכיח ביותר באזורי הקורטקס. ניתן להשתמש במידע מתמונות אלו כדי לעקוב אחר הביטוי והתפקוד של חלבונים קושירי מתכות. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להקים תוך שעה ניסוי הנפרש על פני מספר ימים, במידה והדבר נעשה כה properly.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לסנכרן את קווי האבלציה ואת קבצי הנתונים עם ה-ICPMS. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון צביעה היסטולוגית של חתכים סמוכים, כדי לספק מידע נוסף כמו קולוקליזציה של מתכות עם חלבונים ספציפיים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר רצינו לבחון כיצד השתנו רמות המתכת במודלים מעבדתיים של מחלת פרקינסון.
למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעמיק את ההבנה בנוגע לניוון עצבי, ניתן ליישמה גם עבור סוגי רקמות ומצבי מחלה שונים, כולל רקמות אנושיות ומגוון של מטריצות ביולוגיות. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לבחון כיצד השתנו רמות המתכות הן בדגימות אנושיות והן במודלים חייתיים של מחלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן הגדרת ניסוי ה-laser ablation ICPMS.
יש לזכור כי עבודה עם חומר ביולוגי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול למיפוי כמותי של מתכות ברקמה נוירולוגית של עכבר באמצעות ספקטרומטריית מסות עם פלזמה מצומדת השראית ואבליציה בלייזר (LA-ICP-MS). טכניקה רגישה זו מספקת תובנות לגבי התפלגות מתכות הקשורה לתפקוד תקין ולתהליכי מחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- כימיה אנליטית
- מטאלומיה
רקע
- שיטת LA-ICP-MS שומרת על מידע מרחבי לגבי מתכות, בניגוד לשיטות מסורתיות.
- הבנת הביוכימיה של מתכות היא קריטית למחקר של מחלות.
- טכניקה זו יכולה לסייע בניטור של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- הדגמות חזותיות הן חיוניות לביצוע יעיל של הפרוטוקול.
מטרת המחקר
- לכימות ההתפלגות המרחבית של מתכות בחתכי רקמה.
- למענה על שאלות ביולוגיות מרכזיות הנוגעות למעורבות של מתכות במחלה.
- לשיפור ההבנה של חלבונים קושרים מתכות במוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות רקמת מוח ותמיסות סטנדרט בתא של האבלציה הלייזרית.
- הגדרת תוכנת ה-ICPMS לאיסוף נתונים.
- ביצוע אבלציה לייזרית והפקת נתונים מקובצי CSV.
- שימוש בתוכנה לבניית תמונות כמותיות לצורך ניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- הפצתו של מתכות כגון ברזל ואבץ מופתה באזורי מוח של עכברים.
- הברזל היה שכיח ביותר במוח האמצעי ובסיבוב המשונן (dentate gyrus).
- ריכוז האבץ היה הגבוה ביותר באזורי קליפת המוח.
- דימויים כמותיים סיפקו תובנות לגבי התפקוד של חלבונים קושרי מתכות.
מסקנות
- LA-ICP-MS הוא כלי בעל ערך לחקר פיזור מתכות ברקמות נוירולוגיות.
- עם תרגול, ניתן להשלים את ההקמה הניסיונית ביעילות.
- לשיטה זו השלכות משמעותיות להבנת מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
שיטת LA-ICP-MS מאפשרת כימות מתכות ברזולוציה מרחבית ברקמת מוח, ובכך נותנת מענה לפער קריטי במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות, שבהן הפרעות בהומאוסטזיס של מתכות מתרחשות באזורים אנטומיים מדויקים. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) על ידי קישור פיזור המתכות למסלולים רלוונטיים למחלה ולביטוי חלבונים, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים. השיטה מספקת נתונים כמותיים ברזולוציה גבוהה המנחים הפחתת סיכונים מנגנונית ותעדוף פורטפוליו עבור טיפולים רפואיים המווסתים מתכות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי התפלגות מתכות באזורים נוירו-אנטומיים הקשורים לפתולוגיה של המחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות קורלציה בין רמות המתכות לבין ביטוי ופעילות של חלבונים קושרי מתכות.
- ערך מדעי: תומך בביטחון חיזוי על ידי זיהוי הפרה של ויסות מתכות ספציפי לאזור כסמן ביולוגי לשלבים מוקדמים של המחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקות המשך על ידי קביעת פיזור מתכות בסיסי ברקמות מסוג בר (wild-type).
- ערך תפעולי: מספק פלטיים כמותיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור (PPM), החיוניים לנורמליזציה של הבדיקה ולמוכנות לסריקת תרכובות.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה מהימנה של תרכובות באמצעות זיהוי שינויים בהומאוסטזיס של מתכות, המעידים על מעורבות של מנגנון במטרה המיועדת (on-target).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים התאמה של מערכת רלוונטית למחלה באמצעות מעקב אחר שינויים במתכות במודלים של ניוון עצבי, כגון מחלת פרקינסון.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות כימות עקבי של מתכות בחתכי רקמה.
- ערך מדעי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי זיהוי חתימות פתופיזיולוגיות מבוססות מתכות לפני מחקרי יעילות in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת נתוני מתכות ברזולוציה מרחבית התורמים להבנת המנגנון הביולוגי ופעולת התרכובת.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבחינת היפותזות ובהבהרת מסלולים על ידי חשיפת העשרה של מתכות באזורים כגון המוח האמצעי והגירוס המשונן (dentate gyrus) עבור ברזל, ובאזורים קורטיקליים עבור אבץ.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים מוכנים לבדיקה ברזולוציה של מיקרומטרים בודדים, מה שמאפשר מיפוי מתכות הניתן לשחזור על פני סדרות של דגימות.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני CPS בעת רגעית המומרים ל-PPM באמצעות תמיסות סטנדרט, ובכך מספקת קריאות סטטיסטיות להשוואה בין קבוצות ולקביעת גודל האפקט.
- מחקר תרגומי: מתחברת לרצף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות למעקב לרוחב זמן (longitudinal) של שינויים במתכות במודלים של מחלות, ובכך תומכת בהתאמה של ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לדימות מתכות בסוגי רקמות ובמצבי מחלה שונים, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי צמצום העמימות המכניסטית במסלולים תלויי-מתכת באמצעות קורלציה מרחבית ישירה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות סטנדרטים תואמי-מטריצה ופרמטרי אבלציה בלייזר עקביים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של שיבושים בהומאוסטזיס של מתכות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על הפורטפוליו: מספק מידע לתעדוף מותאם-סיכון על ידי כימות המעורבות של המטרה (target engagement) באסטרטגיות לוויסות מתכות באזורי מוח רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרמטרי אבלציה בלייזר, אופטימיזציה של ICPMS ופירוש נתוני מטאלומיקה.
- תלוי במכשור LA-ICP-MS, בקרת גז נשא ובתוכנה לבניית תמונות כמותיות לצורך המרה של CPS ל-PPM.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת דגימות, דפוסי אבלציה ופרוטוקולים לתיקון רקע.
- כולל שיקולי התאמה לעובי רקמה משתנה, הרכב אלמנטרי ואפקטים של מטריצה בין מינים שונים או מצבי מחלה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הסתרת נפילת אות בשל הגנרליות של הרקמה, והצורך במחזורי אבלציה רצופים של סטנדרט-דגימה-סטנדרט כדי לשמור על דיוק הכימות.
