Name: תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: למדו שיטת תרבית אקספלנט לגזירת פיברובלסטים מנינגיאליים חיוביים לפיברונקטין ממוח אנושי לאחר מוות. שיטה זו מאפשרת מחקר מנגנוני מחלת פרקינסון בתאים ממקרים מאומתים באוטופסיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פיתוח פרוטוקול זה מומן על ידי תרומות פרטיות שהופנו לתוכנית תרומת המוח של מכון פרקינסון.

הרשמת תרומת המוח כוללת תיעוד על ידי הנרשם על כוון לתרום. ההרשאה הנתיחה לאחזור רקמות מסופק על ידי קרובי משפחה כפי שמתיר החוק. מחקרים באמצעות דגימות נתיחה שנאספו נבדקים על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) על מנת להבטיח עמידת טלטלות דין והחשבון Act ביטוח בריאות תקנות (HIPAA). הערה: דגימות Leptomeninges נאספות על ידי המבתר או נוירופתולוג המוח במהלך דיסקציה מוח מאוחסנות 50 צינורות חרוטי מיליליטר המכילים תקשורת צמיחת 25-30 מיליליטר קרום מוח. המדגם מאוחסן 4 ° C עד הכנת המדגם. העיבוד צריך להתבצע בהקדם האפשרי כמו את הכדאיות של תאים פוחת עם פוסט מורטם זמן. 1. קמה לפני תחילת Leptomeninges Dissection הערה: שלבים 1.1 - 1.3 הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תקשורת צמיחה קרום מוח על ידי שילוב 375 מיליליטר של מדיה הנשר השונה של Dulbecco, 100 מיליליטר של סרום שור עובר, 5 מיליליטר 10 מ&quot;מ חומצות אמינו לא חיוניים, 5 מיליליטר 200 מ&quot;מ L- alanyl-L- גלוטמין, 5 מיליליטר 100 פירובט נתרן מ&quot;מ, 5 מ&quot;ל 10,000 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין ו -5 מ&quot;ל 250 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Amphotericin B ב 500 מ&quot;ל יחידת הסינון. סנן ומערבבים. השתמש בחומרי הדפסה של עד ארבעה שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את כל החומרים בקבינט הבטיחות הביולוגי לפני התחילה לנתיחה: מנות 4x פטרי, 2x 6 צלחות היטב, 2x אזמלים, 15-20 מעוקר תלוש לכסות 15 מ&quot;מ, חיץ מלוח פוספט (PBS), טפטפות סרולוגיות, aspirating טפטפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של תמיסת הג&#39;לטין סטרילי-autoclaved 0.1% היטב בכל צלחת 6 באר. הגדר את הצלחת בצד במשך 30-60 דקות. כן צלחות 2x 6 באר. </li></ol> 2. הכנת מדגם Leptomeninges הערה: שלבים 2.1 - 2.3 הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כ 10 מ&quot;ל של PBSצלחת תרבות 10 ס&quot;מ רקמה סטרילית ומניחים המדגם קרומי המוח בצלחת. בעזרת מלקחיים, לשטוף leptomeninges בעדינות עם PBS להסיר דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את קרומי המוח לתוך צלחת תרבות חדשה של 10 ס&quot;מ רקמה המכילה 10 מ&quot;ל של PBS טרי ולהמשיך כביסה. חזור על הצורך להסיר דם רב ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בשתי אזמלים, לחתוך leptomeninges רקמה לתוך חתיכה גדולה כ 6 ס&quot;מ X 6 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום המכסה על צלחת תרבות והעברת מיקרוסקופ לנתח במנדף זרימה למינרית אופקי. </li></ol> 3. Dissection של רקמות Leptomeninges הערה: שלבי 3.1 - 3.3 הן להתבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית אופקי באמצעות מיקרוסקופ לנתח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור כלי דם מאזור על פיסת leptomeninges (שלב 2.3) מספיק גדולה כדי ליצור לפחות חתיכות 20-25 3 מ&quot;מ x 3 מ&quot;מ. החזק את leptomeninges במקום עם אזמל אחד ועם אחרים, להשתמש מו גירוד עדין ורדודtion להפריד את הכלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים ריבועים קטנים של רקמות מאזור מוכן. חותך בתהליך הדרגתי על ידי ביצוע חתיכות גדולות הראשון ולאחר מכן לחתוך אותם לחלקים קטנים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל אחד להחזיק את הרקמה במקום אזמל אחר לחתוך את הרקמה עם תנועת נדנדה. בשל העקביות של רקמות, קשה להחליק את אזמלים אחד נגד השני. זה יהיה רק ​​לקרוע את הרקמה בנפרד תוצאת קצוות משוננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך ולהוריד את הגזירים לשניים עד ישנם כ חתיכות 20-25 3 מ&quot;מ x 3 מ&quot;מ. </li></ol> העברה 4. גזור קרום המוח חתיכות לצלחות תרבות רקמות הערה: שלב 4 הוא להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;לטין לשאוב מהצלחת 6-היטב (משלב 1.3). הוסף 1 מיליליטר של תקשורת צמיחה קרום מוח היטב כל אחד. בעזרת מלקחיים סטריליות, למקם 3-4 חתיכות ביופסיה לבאר כל אחד. </li></ol> 5. מיקום של תלושים לכסות על Meninges Pieces הערה: שלבי 5.1 - 5.2 הן להתבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית אופקי באמצעות מיקרוסקופ לנתח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את חתיכות עם 1-2 coverslips עגול 15 מ&quot;מ סטרילית לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהדק היטב עם מלקחיים כדי להבטיח את החתיכות נוגעות בתחתית הצלחת. זה מאפשר התקשרות של פיסות רקמה לתחתית הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 6-היטב לתוך 37 ° C חממה, 5% CO 2. </li></ol> 6. תחזוקת תרבית תאים הערה: שלבים 6.1 - 6.3 הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. טפל תרבות מנות בזהירות coverslips לא צריכה לזוז והוציאי את החתיכות קרום המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 2 ימים בתרבות, להוסיף 1 מיליליטר נוסף של תקשורת צמיחה קרום מוח הטריה היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, בזהירות לשאוב התקשורת ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת הטריה היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי יום 9, להמשיך לשנות תקשורת צמיחה בכללפני כמה ימים עד התרבות הופכים ומחוברים. </li></ol> 7. Passaging הערה: כל הצעדים הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. לאחר פיברובלסטים קרום המוח הגרו אל מחוץ פיסות רקמת קרום המוח ולהתחיל לגדול לכיוון הקצוות של כלי התרבות, להרחיב פיברובלסטים קרום מוח לתוך צלחת תרבות גדולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים את passaging, מעיל צלחת תרבות עם ג&#39;לטין 1% למשך 15-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת מצלחת 6-היטב ולשטוף תאים עם 2 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA זה היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. אין צורך להסיר את מכסה מחליק או רקמת קרום המוח בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים מעוגלים ולהתחיל לנתק, להוסיף 2 מ&quot;ל של התקשורת והתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פיפטה מעלה ומטה כדי לשבש את כל הגושים לחלוטין ולהעביר את פתרון התא כדי בצלחת תרבות גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש יחס של 1: 3 ל -1: 4 לשלב תאים משלוש מנות 6-היטבכדי בצלחת תרבות T75 אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים הפיברובלסטים קרום המוח הם ומחוברות צלוחיות תרבות T75, trypsinize את התאים, cryopreserve בתקשורת cryopreservation ב 1x10 6 תאים / מ&quot;ל לכל בקבוקון. בקבוק תרבות T75 אחת עם פיברובלסטים קרום המוח ומחוברות מכיל כ 5-7 מיליון תאים. </li></ol> .8 אפיון של פיברובלסטים קרום המוח על ידי Immunostaining הערה: לפני שמתחילים את ההליך, להכין 4% פתרון paraformaldehyde, 5% נורמלי עז בסרום PBS (חסימת חיץ), 0.3% Triton X-100 ב PBS (חיץ permeabilization), יסודי ותיכון פתרונות נוגדנים, ו 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של Hoechst 33,342 מדולל PBS מ 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המניות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 15,000 ל -30,000 פיברובלסטים קרום המוח ב שקופיות קאמריות 8-היטב מצופים 0.1% ג&#39;לטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות שבהן תאים מחוברים, לתקן תאים 100 paraformaldehyde μL 4% לכל טוב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את בארות 3 פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize את התאים עם 150 μL של 0.3% Triton X-100 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את בארות 3 פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL פתרון חסימה (PBS + 5% נסיוב עז נורמלי) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון החוסם, ולהוסיף 150 μL של נוגדנים ראשוניים רצויים מדוללים חסימת פתרון. עבור מכתים כפול, להכין דילולים עובדים של נוגדנים עיקריים צינורות צנטריפוגה נפרדים על קרח כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1: 300 דילול של פיברונקטין נגד + 1: 200 דילול של אנטי-nestin בחסימת פתרון. כן 1: 250 דילול של אנטי-SERPINH1 + 1: 1,000 דילול של אנטי-Tuj1 בחסימת פתרון. כן 1: 250 דילול-SERPINH1 נגד + 1: 100 דילול של Sox2 אנטי בחסימת פתרון </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את בארות 3 פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 עובד: דילול 400 של fluorescently שכותרתו נוגדנים משני עזים נגד ארנב (ירוק; Ex / Em 2 </sעד&gt; 495/519 ננומטר) אנטי עכבר עז (אדום; Ex / Em 2 590/617 ננומטר) בתמיסת חסימה ולהוסיף 100 μL היטב כל אחד. דגירה של 1 ש &#39;, בחושך, בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף בארות פעם עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל Hoechst 33342 (כחול; Ex / Em 2 358/461 ננומטר) פתרון לכל היטב דגירה בחושך במשך 3 דקות. לשטוף בארות 3 פעמים עם 1X PBS, עוזב בכביסת 1x PBS הסופית באר, ולכסות את השקופית עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol><li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges%3A+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stem%2Fprogenitor+cells+with+neuronal+differentiation+potential+reside+in+the+leptomeningeal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche.</a> J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges+harbor+cells+expressing+neural+precursor+markers+during+development+and+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood.</a> Front Cell Neurosci. 9, 383(2015).</li>
<li>Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+niches+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell niches in health and diseases.</a> Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).</li>
<li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+cells+induce+dopaminergic+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells.</a> Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).</li>
<li>Nakagomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal-derived+doublecortin-expressing+cells+in+poststroke+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain.</a> Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+autopsy+donor-derived+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells.</a> Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-differentiated+neural+cell+cultures+progress+towards+donor-identical+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue.</a> Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).</li>
<li>Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+autopsy-derived+fibroblasts+as+a+tool+to+study+systemic+alterations+in+human+neurodegenerative+disorders+such+as+Alzheimer%27s+disease--methodological+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations.</a> J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).</li>
<li>Bliss, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+postmortem+human+dura+mater+and+scalp+for+deriving+human+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures.</a> PLoS One. 7 (9), e45282(2012).</li>
<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPSC+lines+from+archived+non-cryoprotected+biobanked+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 4(2014).</li>
<li>Adler, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+clinical+diagnostic+accuracy+of+early+vs+advanced+Parkinson+disease%3A+clinicopathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study.</a> Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+clinical+diagnosis+of+idiopathic+Parkinson%27s+disease%3A+a+clinico-pathological+study+of+100+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+accuracy+of+clinical+diagnosis+of+Lewy+body+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease.</a> Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).</li>
<li>Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779(2013).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+triplication+Parkinson%27s+patient%27s+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159(2011).</li>
<li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson%27s+disease+patients%3A+reversal+by+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li>
<li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול פשוט חזק כדי להפיק תרבות פיברובלסטים קרום מוח מן leptomeninges שלאחר המוות האנושי שנאסף יחד עם תרומת מוח. יש מעט מאוד תיאורים של פרוטוקולים לגזור בתרביות תאים מן החומר האנושי לאחר המוות. שני מחקרים לתאר תרבויות עור נגזרת פיברובלסטים 7, 8, 9, מחקר אחד מתאר דגימות הדורות 10, ועוד מתאר שאינו cryopreserved דגימות הדורות קפוא ...

קרום המוח מורכב משלוש ממברנות כי להגן על המוח: דורת מאטר, מאטר נואיד והפיאה. לאחרונה, הוא הוכר כי קרומי המוח גם לשחק תפקיד חשוב הומאוסטזיס התפתחות המוח והמוח 1. קרום המוח נגזר mesenchymal ותאי הנגזרות רכס עצביים ומעניין, הוכיח כי ובתאים המתגוררים קרום מוח יכול להצמיח נוירונים במבחנה ואחרי השתלת in vivo 2, 3, 4. תרבויות קרום המוח כבר גם השתמשו בהצלחה כמו שכבות מזינות, כפי שהוא בעלי פעילות התרמת תאים שמקורם סטרומה לבידול של תאי גזע עובריים לתוך נוירונים דופאמינרגיים 5. יתר על כן, יש leptomeninges פוטנציאל להבדיל ישירות לתוך הנוירונים, האסטרוציטים, ו oligodendrocytes בתנאים איסכמי 6. עבור פרוטוקול זה, דגימות קרום מוח שלאחר מות אדם נאספות מאטר נואיד ופיאה, שנקראות באופן leptomeninges, ו נרכשות במסגרת תרומת מוח אנושית למטרות מחקר. Dissection של המוח מתבצע תוך 24 שעות של מוות המדגם leptomeninges מושם בתקשורת צמיחה הקרה לעיבוד נוסף בתוך 6-8 השעות הבאות כפי שמודגם כאן בפרוטוקול זה. פרוטוקול זה מתאר את לנתיחה והכנה דגימות קרום מוח האנושי לפיתוח תרבית תאי leptomeninges העיקרי חולה. הרקמה היא חתכה לתוך 25-30 חתיכות של כ 3 מ&quot;מ x 3 ריבועים מ&quot;מ. שלוש יצירות ממוקמות בכל 6-גם ג&#39;לטין מצופה היטב והחזיקה עם coverslips זכוכית עגול. דיסקציה הקרום המוח לוקח בערך 25-35 דקות. האתגר העיקרי עם תרבות זו הוא עקרות כמו רכש המוח, תחבורה לנתיחה לא מבוצעות בדרך כלל בתנאים סטריליים. Therefore, חשוב להשלים את תרבות התקשורת עם קוקטייל של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B amphotericin ולהשתמש מנות רבות גם בנפרד חתיכות רקמת תרבות. תולדה של פיברובלסטים קרום המוח מתרחשת בדרך כלל בתוך השבוע הראשון. מדיה מוחלפת מדי יומית שלוש עד תאים ומחוברות התאים passaged enzymatically. הפיברובלסטים קרום המוח הם cryopreserved ב 1 מיליון תאים לכל מ&quot;ל / בקבוקון בתקשורת cryopreservation. עם פרוטוקול זה, 20-30 מיליון פיברובלסטים קרום המוח ניתן לגזור 6-8 שבועות עבור cryopreservation. יישומי Downstream של פיברובלסטים קרום המוח אלה תרבויות עיקריות למחקר מחלה, והבחנה עצבית ישירה או גזירה של תאי גזע מושרים מן leptomeninges להבנה של מנגנוני מחלה ו לפיתוח תרופות.

<table><tbody><tr><td>צלחות פטרי קורנינג</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי 15 מ"מ פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>אזמלים, להב סטרילי, מס' 15</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים עם קצה מדויק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלוח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>יחידת סינון קורנינג 500 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>430770</td><td>משלב רכיבי מדיה ו מסנן.</td></tr><tr><td>צלוחיות שטופלו בתרבית תאים של Nunc עם מכסי פילטר, T175 ס"מ2&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Growth Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td><td>תרמו פישר</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B (תמיסה צהובה/250 ומיקרו; g/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker Freeze 120 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fibronectin Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 שקופיות תאיות באר&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>20% פרפורמלדהיד&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>100% גליצרול&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים 100% רגיל&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד פיברונקטין [F1]</td><td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>1:300 דילול בתמיסה חוסמת</td></tr><tr><td>אנטי-SERPINH1</td><td>סיגמא</td><td>S5950-200ul</td><td>1:250 דילול בתמיסה</td></tr><tr><td>חוסמת אנטי-SOX2</td><td>Millipore</td><td></td><td>MAB4343 1:100 דילול בתמיסה</td></tr><tr><td>חוסמת Anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>1:200 דילול בתמיסת חסימה</td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1:1,000 דילול בתמיסת חסימה</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 אנטי-ארנב</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>1:400 דילול בתמיסת חסימה; (ערוץ ירוק; Ex/Em2 495/519 ננומטר)&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 נגד עכבר</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>1:400 דילול בתמיסת חסימה; (ערוץ אדום; Ex/Em2 590/617 ננומטר)&nbsp;</td></tr><tr><td>כתם Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>מדלל לריכוז סופי של 1.0 &mu; גרם/מ"ל; (ערוץ כחול; Ex/Em2 358/461 nm)</td></tr><tr><td colspan="4">ספקים הם הצעות, ניתן להשתמש גם במוצרים דומים מספקים חלופיים.</td></tr></tbody></table>

תורם גזירת תרבויות leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

למרות התקדמות גדולה נעשתה באפיון הקליני של מחלת פרקינסון, מספר מחקרים מדווחים כי האבחנה של מחלת פרקינסון לא אשרה פתולוגית של עד 25% של מאובחנים קליני מחלת פרקינסון. לכן, רקמה שנאספו חולים שאובחנו קלינית עם מחלת פרקינסון אידיופטית יכול יש שיעור גבוה של אבחנה מוטעית; ומכאן במבחנה מרקמות כגון ללמוד מחלת פרקינסון כמודל פרה-קליני יכול להיות עקר. על ידי איסוף leptomeninges אדם לאחר המוות עם אבחנת נוירו אשרה של מחלת פרקינסון מתאפיין אובדן תא nigrostriatal תכלילים חלבון תאי בשם גופיפי לוי, אחד יכול להיות בטוח כי פרקינסון קליני שנצפה אינו נגרם על ידי אחר תהליך מחלה (למשל גידול, טרשת עורקת). presen פרוטוקול זהts לנתיחה והכנת leptomeninges אדם לאחר מות גזירה של תרבות פיברובלסטים קרום מוח. הליך זה הוא איתן ויש לה שיעור הצלחה גבוה. האתגר של התרבות הוא סטריליות כמו רכש המוח הוא בדרך כלל לא להתבצע בתנאים סטריליים. לכן, חשוב להשלים את תרבות התקשורת עם קוקטייל של פניצילין, סטרפטומיצין, ו amphotericin B. על הגזרה של פיברובלסטים קרום מוח ממקרי נתיחה-אשר עם מחלת הפרקינסון מספקת את הבסיס לפיתוח מודלים במבחנה של מחלת פרקינסון. פיברובלסטים קרום המוח להופיע 3-9 ימים לאחר הכנת המדגם כ 20-30 מיליון תאים ניתן cryopreserved ב 6-8 שבועות. תרבות פיברובלסטים קרום המוח היא הומוגנית והתאים להביע פיברונקטין, סמן נפוץ לזהות קרומי המוח.

כאשר פרוטוקול עיבוד leptomeninges הצליח, תולדה של פיברובלסטים קרום המוח היא ראשונה שנצפתה שלושה תשעה ימים אחרי הניתוח, אם כי זה יכול להיות תלוי באורך של מרווח שלאחר מוות של המוח. איור 1 מדגים תרבויות פיברובלסטים קרום המוח של ארבעה תורמים שונים. איור 1 א מציג פיסת leptomeninges שנערך על ידי תלוש כיסוי זכוכית (קו אלכסוני כהה) ו תולדה פיברובלסטים סביב ארבעה ימים רקמות לאחר עיבוד מתורם 88 בן עם 10 שעות 20 דקות מרווח של...

פרוטוקול תרבות leptomeninges explant מהמוח שלאחר מוות האנושי הוא דרך חזקה ופשוט טכניים לגזור פיברובלסטים קרום מוח חיובי פיברונקטין בתוך 6-8 שבועות cryopreserve כ 20-30 מיליון תאים.

תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

אני בירגיט שולה, מנהלת תוכנית תרומת המוח במכון ובמרכז הקליני של פרקינסון. בסרטון זה, אנו מתארים טכניקה לתרבית תאים אקספלנט ומשך הפיברובלסטים הראשוניים מלפטומנינגים של מוח אנושי לאחר המוות מחולים עם מחלת פרקינסון. ניתן להשתמש בפיברובלסטים אלה למגוון יישומים, כולל בדיקות מבוססות תאים.זה חשוב, מכיוון שאנו יכולים לחקור קווי תאים ממקרים שהוכחו בנתיחה לאחר המוות של מחלת פרקינסון ספורדית עם פתולוגיה של גוף לוי. התחל בהנחת כל החומרים הנדרשים לתוך מכסה המנוע. יש לרסס את כל החפצים הנכנסים למכסה המנוע באתנול 70% ולנגב אותם.השלב הראשון הוא העברת קרומי המוח מהצינור לכלי החיתוך. התחל במזיגת כ-10 מיליליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט לתוך צלחת חיתוך סטרילית של 10 סנטימטרים. כאן תוכלו לראות את קרומי המוח.בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו בזהירות את קרומי המוח לכלי החיתוך. בצע שלב זה באיטיות כדי למנוע קריעה. השלב הבא הוא לשטוף את קרומי המוח ב-PBS כדי להסיר כמה שיותר דם.אם הדגימה שלך מדממת מדי, תוכל לשקול להעביר אותה לכלי חיתוך אחר. הוסף עוד 10 מיליליטר PBS לכלי טרי של 10 סנטימטרים. חזור על שטיפה זו כדי להמשיך להסיר דם מקרומי המוח.לבסוף, העבירו את קרומי המוח לכלי טרי בגודל 10 סנטימטר המכיל PBS. בסיום, מכסים את הכלי ומעבירים אותו למיקרוסקופ החיתוך במכסה המנוע הזרימה הלמינרית. השלב הבא הוא להמשיך לחתוך את קרומי המוח לחתיכות קטנות יותר.בעזרת שני אזמלים סטריליים, הפרד בעדינות את כלי הדם מקרומי המוח בתנועת גירוד רדודה. הכן אזור גדול מספיק כדי לחתוך בערך 18 חתיכות בגודל 3 מילימטר על 3 מילימטר, כפי שמוצג בתמונה זו. לאחר מכן, קח את האזמל ובעזרת תנועת נדנדה, חתך את האזור המוכן לחתיכות בגודל 3 מילימטר על 3 מילימטר.קל יותר לעשות זאת בתהליך מדורג על ידי חיתוך קרומי המוח לחתיכות גדולות יותר ולאחר מכן חיתוך החלקים הללו לחלקים קטנים יותר. מכסים את כלי החיתוך ומעבירים אותו בחזרה למכסה המנוע של תרבית הרקמות. לאחר מכן, התכוננו להעביר את קרומי המוח לצלחת תרבית רקמה בת שש בארות שצופה יפה במיליליטר אחד של 0.1 אחוז ג'לטין למשך 30 עד 60 דקות.הוסף מיליליטר אחד של אמצעי קרום המוח לכל באר. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו שלושה עד ארבעה חתיכות קרום המוח למרכז כל באר. התאים הגדלים בצלחת זו יהיו מעבר אפס.השלב הבא משתמש בכיסויים כדי להבטיח שחלקי קרומי המוח נייחים ויישארו במגע עם צלחת התרבות. הניחו כיסוי עגול סטרילי של 15 מילימטר מעל חתיכות קרומי המוח. במידת הצורך, מקם מחדש את חלקי קרומי המוח עם כיסוי.לאחר מכן, בעזרת המלקחיים, לחץ בחוזקה כלפי מטה על הכיסוי כדי לוודא שהחלקים נוגעים בצלחת. תמונה זו מציגה את חלקי קרומי המוח המוחזקים במקומם עם כיסוי. הניחו את המכסה מעל צלחת שש הבארות והעבירו בזהירות את הצלחת לאינקובטור המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני.לאחר יומיים בתרבית, הוסף מיליליטר נוסף של חומר קרום המוח טרי לכל באר. בשבעה ימים, שאפו את התקשורת. לאחר מכן, מלאו מחדש כל באר ב -2 מיליליטר מדיה טרייה.לאחר היום השביעי, המשיכו לחדש את הבארות ב-2 מיליליטר של מדיה טרייה כל יומיים. תמונה זו מציגה את היום הראשון של חתיכות קרומי המוח והתרבות תחת מיקרוסקופ הפוך. לאחר כשישה עד תשעה ימים, ניתן להבחין בהתקשרות תאית בצמיחה הראשונה.בין 15 ל -19 יום, מספר התאים גדל והצמיחה הופכת צפופה יותר. פיברובלסטים של קרום המוח מאופיינים בביטוי של פיברונקטין. תמונות אלה מציגות תאי קרום המוח מתורבתים שנצבעו וחיוביים לפיברונקטין.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להפיק תרביות של לפטומנינגים מתורמי מוח אנושיים לאחר המוות. טכניקה זו מספקת דרך פשוטה וחזקה להפיק פיברובלסטים של קרום המוח תוך שלושה עד שישה שבועות, ומאפשרת לאגור 15 עד 20 מיליון תאים במספר מעבר נמוך.

derivation-leptomeninges-explant-cultures-from-postmortem-human-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר שיטות להפיק אוכלוסיות מועשר Murine של תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) בתרבות העיקרי, אשר להבדיל לייצר oligodendrocytes בוגרת (OLS). בנוסף, דו"ח זה מתאר את טכניקות כדי לייצר Murine myelinating שיתוף תרבויות על ידי זריעת OPCs העכבר על המיטה neurite של הגב עכבר שורש עצב הגנגליון (DRGNs).

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

פרוטוקול זה מתאר את הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ מיתרי השדרה העובר ומתוחזק במבחנה או להשתלה או למחקר של שושלת oligodendrocytic.

הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים

סרטון זה מדגים טכניקה להכנת תרביות פרוסות צפות בחופשיות מהמוח האנושי הבוגר. פרוסות דקות נוצרות מאזור במוח באמצעות ויברטום. פרוסות אלה תלויות לאחר מכן במדיום תרבית בתוספת גורמי גדילה כדי לשמור על כדאיות הרקמה.

הכנת תרביות פרוסות צפות ממוח אנושי בוגר

סרטון זה מדגים טכניקה לביסוס תרבית תלת ממדית של תאי גלייה. תאי גלייה שמקורם במוח חולדה עטופים בתוך מטריצה פולימרית הניתנת להצלבה המכילה רכיבי מטריצה חוץ-תאיים. עם הדגירה במדיום גדילה, תאי הגליה מתרבים בתוך המטריצה התומכת ליצירת תרבית תלת ממדית.

הקמת תרבית תלת-ממדית של תאי גלייה שמקורם במוח חולדה

הנוזל השדרתי חדרית (CSF) רוחץ את בתאים קליפת מוח neuroepithelial ומוחות במהלך ההתפתחות המוקדמת של מוח בעובר. כאן אנו מתארים שיטה שפתחה לבודד CSF חדרית מעוברים מכרסמים בגילים שונים כדי לחקור הפונקציה הביולוגית שלה. בנוסף, אנו מדגימים נתיחתנו מוחות קליפת מוח explant וטכניקת התרבות שמאפשרת לצמיחת explant עם כמויות מינימאליות של תרבות בינונית או CSF.

בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר מסלולים בודדים של הזדקנות המוח באמצעות תוכנית תרומת מוח ואפיון נכון של המוח. תורמי מוח מעורבים במחקר אורכי ארוך טווח כולל הערכות רב מימדיות סדרתיות. הפרוטוקול מכיל תיאור מפורט של עיבוד המוח ומתודולוגיית אבחון מדויקת.

פרוטוקול בנק המוח Abbiategrasso לאיסוף, עיבוד ואפיון מוחות מזדקנים

אנו מתארים הזרקה תאיים כי מעסיקה מחט כפוף בקצה כי ניתן לייצב את הגולגולת, ובכך לחסל את הסיכון של נזק על הבסיס הבסיסי. הגישה יכולה לשמש למיפוי הגורל הגנטי ומניפולציות של תאים לטומאנעיים ולמעקב אחר תנועת נוזל מוחי שדרתי.

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs), סוג תא תוך גולגולתי שזוהה לאחרונה, הם בעלי תפקידים לא מובנים. מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לקצירת LLECs מעכברים וביסוס תרביות ראשוניות במבחנה . פרוטוקול זה נועד לאפשר לחוקרים להתעמק בתפקודים התאיים ובהשלכות הקליניות האפשריות של LLECs.

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

מאמר זה מתאר פרוטוקול להתפשטות תאי גידול במחזור נוזל המוח בעמוד השדרה (CSF-CTCs) שנאסף מחולים עם מחלת לפטומנינגיאלית הקשורה למלנומה (M-LMD) כדי לפתח מודלים פרה-קליניים לחקר M-LMD.

אקס ויוו תרבית של תאי גידול במחזור הדם בנוזל השדרה המוחי מחולי מלנומה לחקר מחלת לפטומנינגה הקשורה למלנומה

למדו שיטת תרבית אקספלנט לגזירת פיברובלסטים מנינגיאליים חיוביים לפיברונקטין ממוח אנושי לאחר מוות. שיטה זו מאפשרת מחקר מנגנוני מחלת פרקינסון בתאים ממקרים מאומתים באוטופסיה.

תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

גלה סרטונים נוספים