Name: תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: למדו לנתח את שלמות ה-DNA בתאים חופשיים בדגימות שתן לאבחון לא פולשני של סרטן שלפוחית השתן והערמונית. שיטה זו מציעה רגישות של 73% וספציפיות של 84% לאיתור מוקדם של מחלות אורולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לגריין טירני ולסילביה בליסימו על עזרתן בעריכה.

הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות ועדת האתיקה מחקר האדם irst. הערה: בפרוטוקול זה, אנחנו מבודדים דנ&quot;א מדגימות השתן לבצע ניתוח שלמות UCF DNA. קווי LNCaP ותא MRC ששימשו לבניית סטנדרטים. טכניקות כגון מיצוי DNA, כימות DNA (ספקטרופוטומטר ו בזמן אמת PCR עבור הגן שליטה, STOX1), בזמן אמת PCR עבור אונקוגנים ספציפיים בוצעו (איור 1). איסוף ועיבוד שתן 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג דגימת שתן ראשון בבוקר נקי לתפוס בכוס נקייה ויבשה, פלסטיק. אסוף לפחות 50 מ&quot;ל של דגימת שתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על שתן על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 3 שעות ולשלוח אותו למעבדה באותה הטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים כל דגימה על ידי היפוך זה פעמיים מיד עם הגעתו במעבדה ולהעביר לשתי 50 מ&quot;ל תחתית חרוטי צינורות פוליפרופילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינורותב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C או בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר 10 מ&quot;ל של החלק העליון של supernatant שתן לשני צינורות 5 מ&quot;ל, עוזב לפחות 2 מ&quot;ל של supernatant מעל גלולה התא. הערה: העברת החלק העליון של supernatant מפחיתה את הסיכון של זיהום על ידי תאים או פסולת הסלולר. אין הגדרה ברורה בין החלקים העליונים ותחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וזורקים את הכדור ומיד להקפיא את supernatant ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol> בידוד DNA 2. מן Supernatant שתן שורות תאים הערה: לבודד את ה- DNA משורת תאים (למשל, LNCaP לסרטן הערמונית או MRC בסרטן שלפוחית השתן) באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. בידוד של DNA מן supernatant שתן צריכה להתבצע באמצעות הפרוטוקול המסחרי, שונה כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot אחד supernatant שתן בטמפרטורת החדר. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס ומערבבים את דגימת שתן ולהעביר 1 מ&quot;ל של supernatant שתן לתוך צינור 5 מ&quot;ל ברור. להקפיא את השתן שיורי ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של k proteinase ישירות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ AL המדגם ומערבבים היטב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את צינורות דגירת הדגימות ב 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להכין עמודה אחת עבור כל דגימה ולהכין את מאגרים לשטוף, AW1 ו AW2, על פי הוראות היצרן (להוסיף את הסכום המצוין של 100% אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את דגימות בחזרה לטמפרטורת החדר ומוסיפים 1 מ&quot;ל של אתנול מוחלט. מערבבים היטב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 650 μL של התערובת שהושגה בשלב 2.7 לעמודה צנטריפוגות אותו ב -6,000 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הצינור המכיל את הזרימה דרך למקם את הטור על צינור אוסף חדש, נקי. חזור על שלבים 2.8 ו -2.9 עד שכל התערובת מדגם נוצל בעבר (5 פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 &amp;# 181; L של חיץ AW1 מבלי להרטיב את שפת הטור. צנטריפוגה זה ב 6,000 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השפופרת המכילה את הזרימה דרך ולהחליף אותו עם צינור אוסף חדש, נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של חיץ AW2 מבלי להרטיב את שפת הטור. צנטריפוגה זה במלוא המהירות (20,000 XG) במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השפופרת המכילה את הזרימה דרך ולהחליף אותו עם צינור אוסף חדש, נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.12 כדי להסיר כל חיץ כביסה שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור לתוך צינור 1.5-מ&quot;ל נקי. הוסף 50 μL של חיץ elution AE ולחכות 7 דקות על מנת להבטיח כי מרטיב חיץ העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה זה ב 8000 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה eluent משלב 2.15 לתוך הטור-מיני צנטריפוגות אותו במהירות המרבית עבור 1 דקות כדי להבטיח את התאוששות מקסימלית של ה- DNA. </li></ol> 3. כימות דנ&quot;א דילול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ספקטרופוטומטר, לבצע כימות של דנ&quot;א בוטh הקו הסלולרי לבין דגימות supernatant שתן. השתמש 2 μL של המדגם על ספקטרומטר הספסל העליון, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את דגימות DNA UCF כדי לקבל ריכוז של 1 ng / μL ולאחסן את ה- DNA ב -20 ° C עד לניתוח שלמות ה- DNA. הערה: אם כמות ה- DNA אינו מספיק כדי להמשיך עם בזמן אמת PCR (לפחות 100 נ&quot;ג), לבצע תהליך בידוד DNA חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את דנ&quot;א מדגימות שורת תאים להשיג שישה תקנים עם ריכוזים שונים: 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5, ו -2 ng / μL, כל אחד עם נפח של 100 μL (st1, ST2, ST3, st4, ST5, ו st6). אחסן את הסטנדרטים DNA התא קו ב -20 ° C עד לניתוח שלמות ה- DNA. </li></ol> 4. DNA Integrity מבחן - PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה פריימרים (ריכוז תלוי בסוג של assay), Supermix הירוק, סטנדרטי DNA התא אונליין, דגימות בדילול UCF DNA על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות רצועה בצלחת fאו הדיסק הרוטור 72-היטב. Aliquot 10 μL בשני עותקים עבור כל תקן מדגם מדולל 10 μL של מים RNase ללא עבור הביקורת השלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת של 1 μL של כל צבע יסוד (הריכוזים מסומנים בטבלה 1), 12.5 μL של Supermix ירוק, ו -6.5 μL של RNase ללא מים עבור כל דגימה. כאשר מכין את התערובת, להשתמש את המספר הבא של דגימות: 6 תקני 2 משכפל, מספר דגימות עבור 2 משכפל, שליטה שלילית 2 משכפל, ו -2 דגימות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 15 μL של התערובת לתוך כל טוב. אל פיפטה או לסובב את הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הפרוטוקול עם תנאי PCR המצוינים בטבלת 1. הערה: לקבלת ערך DNA UCF, 29 דגימות DNA עובדו עבור כל ניסוי בזמן אמת באמצעות הדיסק הרוטור 72-היטב: 29 x 2 דגימות + 6 x 2 תקנים + שלילי מלא x 2 = 72 (UCF DNA ערך). הערה: הפרוטוקול לניתוח שלמות ה- DNA UCF יכול גם להיותמתבצע באמצעות מכשיר אחר בזמן אמת PCR (בעת השימוש במכשיר אחר, צבע רוקס ייתכן שיהיה צורך להוסיף). </li></ol> 5. DNA Integrity מבחן - ניתוח נתונים ופרשנות הערה: ערך DNA UCF עבור כל דגימה הושגה על ידי תוכנת מערכת מכשיר איתור בזמן אמת באמצעות בניית עקומת סטנדרט עבור כל הערכת גן PCR פרט באמצעות אינטרפולציה עקומה סטנדרט, כפי שתוארה לעיל 7-9 (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את המשכפל; מדגם משכפל עם הבדל ≥1 Ct חייב להיות מושלך מחדש העריך בניסוי שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את Ct החציוני עבור כל דגימה ולשקול דגימות עם ערך Ct ≤ 36. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הספציפיות של מוצרי ה- PCR באמצעות ניתוח היתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הריכוז של כל amplicon ידי אינטרפולציה עם עקומת סטנדרט; להשיג ערך ריכוז (ng / μL) עבור כל amplicon.</li>
</ol>

<ol><li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Mol.Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li>
<li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Nucleic+Acids+in+Urine%3A+Sources%2C+Structure%2C+Diagnostic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential.</a> Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).</li>
<li>Szarvas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+of+tumor+and+urinary+DNA+to+detect+bladder+cancer%3A+urine+supernatant+versus+urine+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.Rep%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment.</a> Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).</li>
<li>Togneri, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+of+urothelial+bladder+cancer+revealed+in+urinary+cfDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Hum.Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA.</a> Eur.J.Hum.Genet. , (2016).</li>
<li>Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+Integrity%2C+Applications+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Clin.Chem%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research.</a> Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).</li>
<li>Hao, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+DNA+in+serum+as+a+biomarker+for+diagnosis+and+prognostic+prediction+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer.</a> Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+Cell-Free+DNA+Integrity+Analysis+for+Early+Detection+of+Prostate+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.Markers%22%5BJournal%5D)">Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients.</a> Dis.Markers. 2015, 574120(2015).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+prostate+cancer+diagnosis%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.Res.Int%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study.</a> Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+bladder+cancer+diagnosis%3A+preliminary+data%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.Oncol%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data.</a> Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Ishkanian, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li>
<li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2%2Fneu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Patho%22%5BJournal%5D)">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li>
<li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li>
<li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632(2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

ניתוח דנ&quot;א שלמות UCF הוא שיטה חדשה, לא פולשנית להערכת שלמות ה- DNA בשתן. הוצע לאחרונה לאבחון המוקדם של סרטן שלפוחית השתן וסרטן הערמונית 9 7,8. מספר יתרונות וחסרונות של הבדיקה התקינה DNA UCF נדונים כאן, יחד עם הזדמנות עתידית. היתרון העיקרי של הגישה הוא שהיא מציעה שיטה זולה, לא פולשנית פרוטוקול פשוט ללמוד שתן כמקור פוטנציאלי של סמנים ביולוגיים, הדורשים ידע בסיסי בלבד של טכניקות הביולוגיה ...

תא ללא DNA ניתן לאתר בדם ובשתן בשל מוות של תאים על ידי מנגנונים אפופטוטיים או נמקי. דנ&quot;א נייד ללא בדם נחקר באופן נרחב למטרות אבחון ופרוגנוסטיים במחלות שונות, בעיקר סרטן 1. עם זאת, פחות ידוע על התפקיד ללא תא שתן (UCF) DNA. UCF DNA עשויה מהקורן חולף דם דרך מערכת סינון גלומרולרי או מתאי שמגיעים ישירות במגע עם נוזל 2 הגוף הזה (למשל, תאי urothelial או תאי ערמונית). שימוש DNA UCF כמקור ביומרקרים נחקר בעיקר לאבחון המוקדם של כליות, שלפוחית שתן, סרטן הערמונית בשל האחוז הגבוה של DNA UCF מגיע ישירות מתאי בדרך שתן 3,4. מעט מאוד ידוע על DNA UCF ואת השיטות הטובות ביותר לבידוד ואפיון זה. בהינתן ההשערה כי תאים סרטניים לשחרר קטעי דנ&quot;א עוד יותר מתאים רגילים, ההערכהשל שלמות ה- DNA בתא ללא נחקרה בניסיון להבהיר את מקור ה- DNA במחזור הדם 5. מספר מחקרים הוכיחו כי שלמות ה- DNA ללא תא דם מייצג בדיקת אבחון טוב עבור סוגים רבים של סרטן 6, ואותו ההשערה הוצעה ביחס שתן 7-9. מאמר זה מתאר שיטה חדשה לניתוח שלמות UCF DNA עם יישום פוטנציאל לגילוי סרטן שלפוחית ​​השתן וסרטן הערמונית. בפרט, על שלמות ה- DNA UCF שבר יותר מ -250 נ&quot;ב נבדקה 4 אזורים ידועים כבעל מספר עותק דנ&quot;א מוגבר בגידולים מוצקים, כולל ערמונית וסרטן שלפוחית השתן: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), AR (Xq12) 10-14. אונקוגנים ספציפיים, ולא רצפים אקראיים, נבחרו כדי להגדיל את ההסתברות למציאת אותם בשבריר תא ללא של חולי סרטן. אחד היתרונות העיקריים שלשיטה זו היא כי היא גמישה וכי באזורים אחרים יכולים גם להיבחר על בסיס סוג גידול ומאפיין.

<table><tbody><tr><td>ערכת מיני QIAamp DNA &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; ירוק סופרמיקס, 100 x 50 ומיקרו; L rxns, 2.5 מ"ל (2 x 1.25 מ"ל)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT אוליגוס DNA מותאם אישית&nbsp;</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td>טיהור HPLC, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>ניתן להשתמש בשיטות ספקטרופוטומטריות אחרות לכימות DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>מכשיר PCR אחר בזמן אמת יכול לשמש גם</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אחת לצינורות</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>של 50 מ"ל<td>אינקובטור-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ו-deg; C מקפיא-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מעלות; מקפיא</td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>10 & #956; L פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 & #956; L פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & #956; L פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 & #956; קצות פיפטה L (</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td></td><td></td><td></td>1.5 מ"ל</tr><tr><td>צינורות</td><td></td><td></td><td></td>50 מ"ל</tr><tr><td>צינורות</td><td></td><td></td><td></td>15 מ"ל</tr><tr><td>רוטור דיסק 72 רוטור</td><td>9018899</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות וכובעים רצועות קורבט, 0.1 מ"ל (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>צינורות איסוף (2 מ"ל)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 מ"ל)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 מ"ל)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

תא ללא dna integrity ניתוח בדגימות שתן

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

למרות הנוכחות של מחזורי DNA ללא תא פלזמה או בסרום הוכחה נרחב להיות מקור מתאים של סמנים ביולוגיים עבור סוגים רבים של סרטן, כמה מחקרים התמקדו את הפוטנציאל של השימוש ללא תא שתן (UCF) DNA. החל מ ההשערות כי תאים אפופטוטיים נורמלי לייצר DNA מקוטעת וכי תאים סרטניים לשחרר עוד DNA, את התפקיד הפוטנציאלי של שלמות ה- DNA UCF הוערך כסמן אבחון מוקדם מסוגל להבחין בין חולים עם הערמונית או סרטן שלפוחית ​​השתן אנשים בריאים. ניתוח שלמות UCF DNA מוצע על הבסיס ארבעה PCRs כמוני בזמן האמת של ארבעה רצפים ארוכים מ -250 נ&quot;ב: c-myc, BCAS1, HER2, ו AR. רצפים כי לעתים קרובות יש מספר עותק דנ&quot;א גדל ב סרטן שלפוחית ​​השתן וסרטן הערמונית נבחרו לניתוח, אבל השיטה היא גמישה, וגנים אלה יוכל להחליף אותו עם גנים אחרים של inteמנוחה. את התועלת הפוטנציאלית של UCF DNA כמקור ביומרקרים כבר הודגמה עבור ממאירויות אורולוגים, ובכך לסלול את הדרך למחקרים נוספים על אפיון DNA UCF. המבחן שלמות ה- DNA UCF יש את היתרון של להיות לא פולשנית, מהירה, וקלה לביצוע, עם רק כמה מיליליטרים של שתן צורך לבצע את הניתוח.

ריכוז DNA חופשי הכולל היה לכימות על ידי spectrophotometry עבור כל הדגימות נותחו, מראה מגוון של בין 1.51 ו 138 ng / μL. חמש דגימות בקרה שימשו שחזור של נתונים: שני ניסויים בזמן אמת עצמאית בוצעו עבור c-myc, HER2, BCAS1, AR, ו STOX1. המקדמים של השתנות (CV) חושבו אז עבור כל גן (טבלה 2), עם תואר טוב של שחזור בין שני ניסויים בלתי תלויים (טבלה 2). <p class="jove_content" fo:...

מוצעת שיטה לניתוח שלמות ה-DNA בחלק העל-טבעי נטול התאים של דגימות השתן. השיטה מתאימה לגילוי מוקדם של ממאירויות אורולוגיות והוכחה כמדויקת לאבחון מוקדם של סרטן שלפוחית השתן.

תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להעריך את שלמות ה-DNA נטול תאי השתן ברצפים אונקוגנים ספציפיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן האורולוגי, כגון אבחון מוקדם ולא פולשני של סרטן שלפוחית השתן והערמונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה לביצוע ולניתוח.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון של ממאירויות אורולוגיות, מכיוון שהן בדרך כלל משחררות תאים וחומצות גרעין חופשיות בשתן. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי דגימות שתן, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון סרום או פלזמה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שריכוז ה-DNA נטול תאי השתן הוא לרוב נמוך.הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשניסינו למצוא שיטה פשוטה לגילוי מוקדם לא פולשני של סרטן שלפוחית השתן. כדי להתחיל בהליך, השג דגימת שתן נקייה של 50 מיליליטר בבוקר שנשמרה בארבע מעלות צלזיוס למשך לא יותר משלוש שעות. הפוך את הדגימה פעמיים ולאחר מכן חלק את הדגימה לשני צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מיליליטר.צנטריפוגה של הדגימה ב-850 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, עבור כל שפופרת העבירו 10 מיליליטר מהחלק העליון של הסופרנטנט לשני צינורות של חמישה מיליליטר, והשאירו לפחות שני מיליליטר של סופרנטנט מעל הגלולה. השליכו את הכדורים ואחסנו את הסופרנטנט במינוס 80 מעלות צלזיוס.חזור על תהליך זה לקבלת דגימות שתן נוספות לפי הצורך. כדי להתחיל בטיהור ה-DNA, עבור כל דגימה יש להפשיר כמות גדולה של חומר שתן. מערבל את הדגימה המופשרת והפוך את הצינור פעמיים.מניחים מיליליטר אחד מהדגימה בשפופרת של חמישה מיליליטר, ומאחסנים את השאר במינוס 80 מעלות צלזיוס. הכינו ערכת טיהור DNA המתאימה לדגימות שתן לפי הוראות היצרן. הוסף לדגימה 100 מיקרוליטר של פרוטאינאז K ומיליליטר אחד של מאגר ליזה וערבב היטב עם פיפטה.דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. במהלך הדגירה, הכינו את מאגרי הכביסה בעמוד סיבוב. לאחר הדגירה, הניחו לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של אתנול מוחלט וערבבו היטב על ידי פיפטינג.העבירו 650 מיקרוליטר מהמדגם לעמודה. צנטריפוגה ב 6000 פעמים G למשך דקה אחת. החלף את צינור האיסוף וחזור על תהליך זה עד שכל הדגימה נטענה על העמודה.לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר ממאגר הכביסה הראשון וצנטריפוגה את העמודה ב 6000 פעמים G למשך דקה אחת. החלף את צינור האיסוף, הוסף 500 מיקרוליטר ממאגר הכביסה השני וצנטריפוגה את העמודה במהירות מקסימלית למשך שלוש דקות. הנח את העמוד בצינור איסוף נקי וצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך שלוש דקות נוספות כדי להסיר את שאריות מאגר הכביסה.העבירו את העמוד לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מיליליטר. טען 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה על העמוד ואפשר למאגר להיספג בעמודה למשך שבע דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את העמודה ב 6000 פעמים G למשך דקה אחת.פיפטה את השטיפה בחזרה לתוך העמודה וצנטריפוגה את העמודה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת כדי להשיג את ה-DNA נטול תאי השתן. כדי להתחיל בהכנת התקנים, תחילה בודדו DNA מקו תאים מתאים באמצעות ערכת טיהור. כמת את ה-DNA מכל דגימת שתן מטוהרת בקו התאים עם ספקטרופוטומטר לפי הוראות יצרן הערכה.יש לדלל את ה-DNA של UCF לננוגרם אחד למיקרוליטר ולאחסן את הדגימות המדוללות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לבדיקת התקינות. לדלל את ה-DNA של קו התאים כדי ליצור שישה, 100 מיקרוליטר סטנדרטים בריכוזים שונים. אחסן את התקנים במינוס 20 מעלות צלזיוס.כדי להתחיל בבדיקת תקינות ה-DNA, יש להפשיר את דגימות ה-DNA של UCF, התקנים, פריימרים המתאימים ל-PCR וסופר-מיקס ירוק על קרח. לאחר מכן הגדר את לוחית דיסק הרוטור עם 72 בארות עם צינורות רצועה. הנח שתיים, 10 מיקרוליטר של ליטר של תקן ולאחר מכן כל דגימה לבארות.הכן שתי בארות של 10 מיקרוליטר מים ללא RNase כבקרות שליליות. עבור כל באר מלאה, הכינו תערובת של מיקרוליטר אחד מכל פריימר, 12.5 מיקרוליטר סופרמיקס ירוק ו-6.5 מיקרוליטר מים ללא RNase. מעבירים 15 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר מלאה, ואז מעבירים את הבארות לדיסק רוטור של 72 בארות.בצע את ה-PCR עם מכשיר בזמן אמת בהתאם למפרט היצרן. באמצעות תוכנת המכשירים, בדוק אם לשכפולים כלשהם יש הפרש ערכי סף רכיבה של אחד או יותר. השליכו את הדגימות הללו מהניתוח והעריכו את סף המחזור החציוני עבור הדגימות הנותרות.בצע ניתוח התכה על כל דגימה עם ערך סף מחזור חציוני של 36 או פחות כדי להעריך את הספציפיות של מוצר ה-PCR. לאחר מכן השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע ריכוז בננוגרם למיקרוליטר עבור כל יישום. DNA נטול תאי שתן בודד ושלמות ה-DNA הוערכה בארבעה אזורים המראים מספר עותקי DNA מוגבר בגידולים מוצקים.רצף בקרה הוערך גם כדי לוודא שכמות ה-DNA בכל דגימה מספיקה לבדיקת התקינות. ריכוז ה-DNA החופשי הכולל ומקדמי השונות חושבו עבור כל גן. שיטה זו מציגה רגישות של 73% וסגוליות של 84% לגילוי סרטן שלפוחית השתן, אך רק 58% רגישות ו-44% ספציפיות לסרטן הערמונית.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ביום עבודה אחד אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR דיגיטלי או ריצוף מהדור הבא על מנת לענות על שאלות נוספות כמו משרה מספר עותקים של הגנים המעניינים. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לבודד DNA חופשי מתאים מהשתן בצורה פשוטה מאוד, וכיצד לחקור את שלמותם של אזורי עניין ספציפיים באמצעות גישות PCR בזמן אמת.

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

ערכת האבחון המוצגת חליל-DNA היא שיטת חיסכון בזמן וידידותי למשתמש כדי לקבוע את ההסתברות האמינה של נוכחות של נגעים סרטן המעי הגס.

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

אנו מתארים כאן שיטות לקוונפיקציה רגיש ומדויק של נגעים 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-דאדו) ו-1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) ב-DNA. השיטות הוחלו על הערכת ההשפעות של חומר מקיף חלקיקי הסביבה (PM2.5) ברקמות (ריאות, כבד וכליות) של עכברים חשופים A/J.

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקת ביופסיה נוזלית לא פולשנית, כולל איסוף דם, פלזמה והפרדת מעיל באפי, cfDNA ומיצוי DNA נבט, כימות של CFDNA או DNA נבט, וניתוח העשרת שבר cfDNA.

איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

שיטה לא מתויגת, לא רדיו-איזוטופית כדי לבדוק פעילות גליקוסילאז uracil-DNA פותחה באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF לניתוח מוצר ישיר apurinic / apyrimidinic המכיל אתרים. הבדיקה הוכיחה להיות די פשוט, ספציפי, מהיר, וקל לשימוש עבור מדידת גליקוזילאאז DNA.

Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה

בדיקת השביט היא אמצעי פופולרי לאיתור נזק לדנ"א. מחקר זה מתאר גישה להפעלת שקופיות בגרסאות מייצגות של בדיקת השביט. גישה זו הגדילה משמעותית את מספר הדגימות תוך הפחתת זמן הריצה של הבדיקה, מספר מניפולציות השקופיות והסיכון לפגיעה בג'לים.

גישת בדיקת שביט בתפוקה גבוהה להערכת נזק לדנ"א תאי

הביופסיה הנוזלית חוללה מהפכה בגישה שלנו למחקרים תרגומיים אונקולוגיים, כאשר איסוף הדגימות, האיכות והאחסון היוו שלבים מכריעים ליישום הקליני המוצלח שלה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מתוקנן ומאומת ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם, שניתן ליישם ברוב מעבדות המחקר התרגומיות.

פרוטוקול קדם-אנליטי של ביופסיה נוזלית סטנדרטית ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם

פרוטוקול זה מתאר בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, המאפשרת אבחון סרטן נקודתי באמצעות ניתוח ex vivo של פעילויות פרוטאז הקשורות לגידול.

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה ISO15189 אוטומטית ומוסמכת של הדור הבא לאיתור שינויים גנומיים ממוקדים ברקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין של סרטן תאים לא קטנים (NSCLC).

זיהוי שינויים ממוקדים בסרטן ריאות של תאים לא קטנים באמצעות ריצוף מהדור הבא

למדו לנתח את שלמות ה-DNA בתאים חופשיים בדגימות שתן לאבחון לא פולשני של סרטן שלפוחית השתן והערמונית. שיטה זו מציעה רגישות של 73% וספציפיות של 84% לאיתור מוקדם של מחלות אורולוגיות.

תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן

גלה סרטונים נוספים