תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להעריך את שלמות ה-DNA נטול תאי השתן ברצפים אונקוגנים ספציפיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן האורולוגי, כגון אבחון מוקדם ולא פולשני של סרטן שלפוחית השתן והערמונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה לביצוע ולניתוח.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון של ממאירויות אורולוגיות, מכיוון שהן בדרך כלל משחררות תאים וחומצות גרעין חופשיות בשתן. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי דגימות שתן, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון סרום או פלזמה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שריכוז ה-DNA נטול תאי השתן הוא לרוב נמוך.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשניסינו למצוא שיטה פשוטה לגילוי מוקדם לא פולשני של סרטן שלפוחית השתן. כדי להתחיל בהליך, השג דגימת שתן נקייה של 50 מיליליטר בבוקר שנשמרה בארבע מעלות צלזיוס למשך לא יותר משלוש שעות. הפוך את הדגימה פעמיים ולאחר מכן חלק את הדגימה לשני צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה של הדגימה ב-850 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, עבור כל שפופרת העבירו 10 מיליליטר מהחלק העליון של הסופרנטנט לשני צינורות של חמישה מיליליטר, והשאירו לפחות שני מיליליטר של סופרנטנט מעל הגלולה. השליכו את הכדורים ואחסנו את הסופרנטנט במינוס 80 מעלות צלזיוס.

חזור על תהליך זה לקבלת דגימות שתן נוספות לפי הצורך. כדי להתחיל בטיהור ה-DNA, עבור כל דגימה יש להפשיר כמות גדולה של חומר שתן. מערבל את הדגימה המופשרת והפוך את הצינור פעמיים.

מניחים מיליליטר אחד מהדגימה בשפופרת של חמישה מיליליטר, ומאחסנים את השאר במינוס 80 מעלות צלזיוס. הכינו ערכת טיהור DNA המתאימה לדגימות שתן לפי הוראות היצרן. הוסף לדגימה 100 מיקרוליטר של פרוטאינאז K ומיליליטר אחד של מאגר ליזה וערבב היטב עם פיפטה.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. במהלך הדגירה, הכינו את מאגרי הכביסה בעמוד סיבוב. לאחר הדגירה, הניחו לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של אתנול מוחלט וערבבו היטב על ידי פיפטינג.

העבירו 650 מיקרוליטר מהמדגם לעמודה. צנטריפוגה ב 6000 פעמים G למשך דקה אחת. החלף את צינור האיסוף וחזור על תהליך זה עד שכל הדגימה נטענה על העמודה.

לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר ממאגר הכביסה הראשון וצנטריפוגה את העמודה ב 6000 פעמים G למשך דקה אחת. החלף את צינור האיסוף, הוסף 500 מיקרוליטר ממאגר הכביסה השני וצנטריפוגה את העמודה במהירות מקסימלית למשך שלוש דקות. הנח את העמוד בצינור איסוף נקי וצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך שלוש דקות נוספות כדי להסיר את שאריות מאגר הכביסה.

העבירו את העמוד לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מיליליטר. טען 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה על העמוד ואפשר למאגר להיספג בעמודה למשך שבע דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את העמודה ב 6000 פעמים G למשך דקה אחת.

פיפטה את השטיפה בחזרה לתוך העמודה וצנטריפוגה את העמודה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת כדי להשיג את ה-DNA נטול תאי השתן. כדי להתחיל בהכנת התקנים, תחילה בודדו DNA מקו תאים מתאים באמצעות ערכת טיהור. כמת את ה-DNA מכל דגימת שתן מטוהרת בקו התאים עם ספקטרופוטומטר לפי הוראות יצרן הערכה.

יש לדלל את ה-DNA של UCF לננוגרם אחד למיקרוליטר ולאחסן את הדגימות המדוללות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לבדיקת התקינות. לדלל את ה-DNA של קו התאים כדי ליצור שישה, 100 מיקרוליטר סטנדרטים בריכוזים שונים. אחסן את התקנים במינוס 20 מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל בבדיקת תקינות ה-DNA, יש להפשיר את דגימות ה-DNA של UCF, התקנים, פריימרים המתאימים ל-PCR וסופר-מיקס ירוק על קרח. לאחר מכן הגדר את לוחית דיסק הרוטור עם 72 בארות עם צינורות רצועה. הנח שתיים, 10 מיקרוליטר של ליטר של תקן ולאחר מכן כל דגימה לבארות.

הכן שתי בארות של 10 מיקרוליטר מים ללא RNase כבקרות שליליות. עבור כל באר מלאה, הכינו תערובת של מיקרוליטר אחד מכל פריימר, 12.5 מיקרוליטר סופרמיקס ירוק ו-6.5 מיקרוליטר מים ללא RNase. מעבירים 15 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר מלאה, ואז מעבירים את הבארות לדיסק רוטור של 72 בארות.

בצע את ה-PCR עם מכשיר בזמן אמת בהתאם למפרט היצרן. באמצעות תוכנת המכשירים, בדוק אם לשכפולים כלשהם יש הפרש ערכי סף רכיבה של אחד או יותר. השליכו את הדגימות הללו מהניתוח והעריכו את סף המחזור החציוני עבור הדגימות הנותרות.

בצע ניתוח התכה על כל דגימה עם ערך סף מחזור חציוני של 36 או פחות כדי להעריך את הספציפיות של מוצר ה-PCR. לאחר מכן השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע ריכוז בננוגרם למיקרוליטר עבור כל יישום. DNA נטול תאי שתן בודד ושלמות ה-DNA הוערכה בארבעה אזורים המראים מספר עותקי DNA מוגבר בגידולים מוצקים.

רצף בקרה הוערך גם כדי לוודא שכמות ה-DNA בכל דגימה מספיקה לבדיקת התקינות. ריכוז ה-DNA החופשי הכולל ומקדמי השונות חושבו עבור כל גן. שיטה זו מציגה רגישות של 73% וסגוליות של 84% לגילוי סרטן שלפוחית השתן, אך רק 58% רגישות ו-44% ספציפיות לסרטן הערמונית.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ביום עבודה אחד אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR דיגיטלי או ריצוף מהדור הבא על מנת לענות על שאלות נוספות כמו משרה מספר עותקים של הגנים המעניינים. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לבודד DNA חופשי מתאים מהשתן בצורה פשוטה מאוד, וכיצד לחקור את שלמותם של אזורי עניין ספציפיים באמצעות גישות PCR בזמן אמת.