Name: באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למדו לזהות את חלבון TMEM184A כקולטן הפרין בתאי כלי דם באמצעות תג GFP. שיטה זו מאפשרת אימות תפקודי של גנים יתומים ומספקת כלי רב-תכליתי למחקר חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר במעבדת לואו-קרנץ נתמך על ידי HL54269 מענקי מחקר מהמכונים הלאומיים לבריאות ל-LLK.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
<li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27063980">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li>
<li>Vit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+membrane+proteins+based+on+analysis+of+trypsin-protected+transmembrane+segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments.</a> J Proteomics. , (2016).</li>
<li>Attwood, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+based+identification+and+comprehensive+classification+of+four-transmembrane+helix+containing+proteins+%284TMs%29+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome.</a> BMC genomics. 17, 268(2016).</li>
<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
<li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+%28PKG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li>
<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

הפרוטוקולים דיווחו כאן נועדו לספק עדויות מאשרות לזיהוי TMEM184A כמו קולטן הפרין בתאי כלי הדם 1. טכניקות מציאה משמשים באופן שגרתי כמנגנון אחד כדי לאשר את הזיהוי של חלבונים חדשים. עם זאת, כמה אובדן תפקודי לאחר המציאה היא בדרך כלל לא הוכחה מספקת כי חלבון מועמד הוא למעשה לקולטן הנכון (או חלבון פונקציונלי אחר). כמו כן, חשוב שתהיינה ראיות כי החלבון המועמד למעשה מציג את הפונקציה. העסקת מבנה עבור גן רומן מתויג עם GFP מאפשרת רווח של ניסויי פונקציה ומקל בידוד של החלב...

זיהוי של חלבוני מועמד פונקציות רומן לעתים קרובות תלוי פרוטוקולי בידוד מבוסס זיקה ואחריו נחישות רצף חלקית. הדוגמות אחרונות של חלבונים זיהו לאחרונה כוללות הטרנסממברני חלבון 184A (TMEM184A), קולטן הפרין המזוהה לאחר אינטראקציות זיקת הפרין 1, ו TgPH1, חלבון מושלם הומולוגית pleckstrin שקושר PI phosphoinositide (3,5) P 2 2. זיהוי חלבונים הרומן השני כרוך ניתוח רצף ישיר של פפטידים כגון שעד Vit, et al. שהשתמשו פפטידים הטרנסממברני לזהות מוצרי חלבון מן הגנים uncharacterized בעבר 3. באופן דומה, זיהוי רצפי חלבוני רומן ניתן להשיג באמצעות ביואינפורמטיקה מחפש משפחות חלבון מאופיינים בעבר כגון זיהוי של חלבוני 4TM חדשים 4. בחינת רצפי גנים המשפחה aquaporin יש אלכך הניב זיהוי של חברים חדשים עם פונקציות רומן 5. לאחר זיהוי, ניתוח של תפקוד חלבון הוא בדרך כלל השלב הבא שלפעמים ניתן לבדוק באמצעות assay ספציפי של תפקוד חלבון כגון במקרה aquaporin. במידת האפשר, פונקציה של חלבון זיהו לאחרונה ניתן לבדוק עם האנזימטית ספציפי או מבחני תפקוד חוץ גופית דומה. בגלל פונקציות רבות של חלבונים חדשים תלויות יחסי גומלין מורכבים המתרחשים רק פגעו תאים או אורגניזמים, ב מבחני חוץ גופייה לא תמיד יעילים. עם זאת, מבחני vivo ב חייב להיות מתוכנן בצורה כזאת, כי הם תלויים רצף הגן. תרבית תאים, ו / או אורגניזמים מודל פשוט, מציאה יכולה לספק ראיות תומכות לזיהוי חלבון / הפונקציה 6. עם חלבונים חדשים שזוהו כאמור לעיל, הוא לעתים קרובות די פשוט להפיל חלבון כדי לאשר פונקציה, גידולד העיצוב של in vivo מבחנים תפקודיים שתלויים רצף גן הופך להיות חשוב עבור האפיון של חלבונים חדשים. הזיהוי האחרונה של TMEM184A כמו קולטן הפרין (כי מודולציה התפשטות שריר חלק בכלי דם ותגובות דלקתיות בתאי האנדותל) באמצעות כרומטוגרפיה זיקת MALDI MS 1, 7 ספקו הזדמנות לפתח אוסף של מבחנים לאחר מציאת ניב תוצאות עקביות עם זיהוי . סקירה אחרונה אשרה כי הפרין אינטראקציה במיוחד עם גורמי גדילה רבים, הקולטנים שלהם, רכיבים תאים מטריקס, קולטנים הידבקות תא, וחלבונים אחרים 8. במערכת כלי הדם, הפרין ו proteoglycans סולפט heparan (המכיל שרשראות סולפט heparan הדומים במבנה שלהם הפרין) אינטראקציה עם כמה מאות חלבונים 9. כדי לאשר מבחינה תפקודית that TMEM184A היה מעורב עם ספיגת הפרין ומחייבת, טכניקות שהעסיקו את מבנה הגן TMEM184A פותחו. הדו&quot;ח הנוכחי כולל אוסף של מבחנים המבוססים על ה- GFP-TMEM184A לבנות לשימוש המאשר את זהותו של TMEM184A כמו קולטן הפרין.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A לבנות</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>Light Sensitive</td></tr><tr><td>Fluorescein-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>Light Sensitive</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, ללא מתנול)</td> <td>Thermo Sci Pierce Biotech, זמין דרך פישר סיינטיפיק</td><td>PI28908 בפישר</td><td>השתמש</td></tr><tr><td>בצלחות נויטראוודין (צלחות שחורות מצופות אבידין 96 בארות)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, באמצעות פישר סיינטיפיק</td><td>PI15510 בפישר</td><td>שימו לב לצלחות שחורות בעלות חיי מדף</td></tr> של <tr><td>96 בארות</td><td>Corning Life Sciences Plastic, שנרכשו באמצעות Fisher Scientific</td><td>064432 ב-Fisher</td><td></td></tr><tr><td>A7r5 תא שריר חלק כלי דם קו</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>ניתן להחלפה לתאי אנדותל אבי העורקים של בקר MEM medium1</td></tr><tr><td>BAOEC</td><td>Cell Applications, Inc.</td>תרבית <td>B304-05</td><td>כפי שהומלץ בתחילה, ניתנת להחלפה במדיום MEM להמשך תרבית 1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC תאי שריר חלק אבי העורקים בקר</td><td>Cell Applications, Inc.</td>תרבית <td>B354-05</td><td>כפי שהומלץ בתחילה, ניתנת להחלפה למדיום MEM להמשך תרבית1</td></tr><tr><td>RAOEC תאי אנדותל אבי העורקים של חולדות</td><td>Cell Applications, Inc.</td>תרבית <td>R304-05a</td><td>כפי שהומלץ בתחילה, ניתנת להחלפה למדיום MEM להמשך תרבית7</td></tr><tr><td>biotinylated anti-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, באמצעות Fisher Scientific</td><td>MA5-15256-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים מצופים סטרפטווידין</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td>זמין מ-Bio-Rad</td><td></td><td>ניתן להכין במעבדה. ה-pH הוא 6.8</td></tr><tr><td>TMEM184A נוגדן ל-N-terminus</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td><td>ידוע רק TMEM184A נוגדן לאזור N-terminal.</td></tr><tr><td>נוגדן TMEM184A למסוף C</td><td>שהתקבל מ-ProSci Inc, Poway, CA&nbsp;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci בשימוש בנוגדנים <חזקים>איור 1</חזק></td></tr><tr><td>GFP</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc9996</td><td>בשימוש בנוגדנים משניים <חזקים>איור 5</חזק></td></tr><tr><td>, המסומנים ב-TRITC או Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (חמור נגד ארנב, TRITC) 715 165 150 (חמור נגד עכבר, Cy3)</td> <td>תגובתיות צולבת מינימלית כדי למזער כל כתמים לא ספציפיים.</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>שנרכשו מ-Sigma</td><td>C5849</td><td>שים לב שהמספר הקטלוגי הספציפי הזה הופסק.&nbsp; הספק יספק מידע לגבי החלפה.</td></tr><tr><td>הדמיה חיה צלחות 35 מ"מ</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &ndash; 20 מ"מ - מיקרוסקופ</td> קונפוקלי C <td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta עם עדשת טבילה בשמן 63X</td><td>משמש לתמונות והדמיה חיה במיקרוסקופ <חזק> 1, 2 ו-3</חזק></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>C2+ קונפוקלי עם עדשת טבילה בשמן 60X</td><td>משמש לתמונות ב-<חזק>איור 5</חזק></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 880 עם עדשת טבילה בשמן 63X</td><td>משמש לתמונות בציוד <חזק>איור 2C</חזק></td></tr><tr><td>אלקטרופורציה</td><td>Bio-Rad</td><td>Gene Pulser מערכת</td><td></td>X-Cell</tr><tr><td>קובטות אלקטרופורציה</td><td>זמינות מ-MidSci</td><td>EC2L</td><td>ניתן להשיג גם מספק ציוד</td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>TECAN</td><td>TECAN Infinite&reg; m200 Pro קורא צלחות</td><td>קריאות באמצע הבארות ולא על פני השטח.</td></tr><tr><td>תוכנת מחשב למדידת עוצמת הצביעה</td><td>תמונה J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ תוכנית ומידע זמינים באינטרנט</td><td>ניתן להשתמש בכל תוכנית מתאימה. ראה https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html לפרטים נוספים&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין תרבית תאים</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td>נרכש כפתרון פי 10</td></tr></tbody></table>

באמצעות tmem184a gfp-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

כאשר חלבונים חדשים מזוהים באמצעות ניתוח בידוד ביואינפורמטיקה מבוסס זיקה, הם לעתים קרובות uncharacterized ברובו. נוגדנים נגד פפטידים ספציפיים בתוך רצף החזה לאפשר כמה ניסויי לוקליזציה. עם זאת, אינטראקציות אפשריות אחרות עם הנוגדנים לעתים קרובות לא ניתן לשלול. מצב זה ספק הזדמנות לפתח סדרה של מבחנים תלויים רצף החלבון. באופן ספציפי, מבנה המכיל את רצף הגן מצמידים את רצף קידוד GFP בסוף C- מסוף של החלבון הושג והעסיק למטרות אלה. ניסויים לאפיין לוקליזציה, זיקה ליגנד, ורווח של פונקציה תוכננו במקור ובוצע כדי לאשר את הזיהוי של TMEM184A כמו קולטן הפרין 1. בנוסף, המבנה יכול להיות מועסק ללימודים בשאלות טופולוגיה הממברנה אינטראקציות חלבון-ליגנד מפורטים. הדו&quot;ח הנוכחי מציג arange של פרוטוקולי ניסוי מבוססים על מבנה GFP-TMEM184A לידי ביטוי בתאי כלי דם שיכול בקלות להיות מותאם עבור חלבונים חדשים אחרים.

אמנם, בתיאוריה, transfection של כל DNA לבנות לתוך תאים יכול להיות מושלם עם ריאגנטים transfection lipophilic, דיווחים קודמים מצביעים transfection יעיל יותר של GFP בונה לתאי אנדותל באמצעות electroporation 12. הפרוטוקול הניתן כאן בדרך כלל מושגת GFP-לבנות ביטוי יותר מ -80% של תאי אנדותל נגזרות העיקריות ותאי שריר חלק בשימוש. עיצוב של המבנה המועסק השתמש במערכת זמינה מסחרי שיכול לספק מבנה זה במהירות. השימוש המיועד הגדול התמקד בנושא...

TMEM184A קידוד לבנות עם תג ה- GFP על הסופית- carboxy המיועד ביטוי איקריוטיים, הועסק מבחנים שנועדו לאשר את זיהוי של TMEM184A כמו קולטן הפרין בתאי כלי דם.

באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

המטרה הכוללת של שימוש במבנה מתויג GFP היא לאשר את זהותו של חלבון שלא היה ידוע בעבר באמצעות GFP כידית. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי תפקודי של גנים יתומים כאשר פעילות אנזים ספציפית אינה זמינה לאישור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתג ה-GPF מאפשר להשתמש באותו מבנה עבור מספר סוגים של ניסויים.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להתקשות, מכיוון שהטרנספקציה לא תמיד מביאה לביטוי המבנה החזק, והתאים לא תמיד מתעוררים לחיים. הרעיון לשיטה הזו עלה לראשונה, כשהתחלנו לזהות את הקשיים בזיהוי חלבון באמצעות נוגדנים שנוצרו נגדו בלבד. התחל בהשעיית התאים המעניינים במיליליטר אחד של מאגר אלקטרופורציה של מי מלח חוצץ HEPES והנח מיד את התאים על קרח.הוסף נפח מספיק של פלזמה מתויגת G TMEM184A FP לתאים כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם למיליליטר של DNA, והעביר כ-0.4 מיליליטר תאים לקובטה אלקטרופורציה מקוררת מראש. אלקטרופוראט את התאים. לאחר מכן ראו את התאים שהועברו על צלחות תרבית רקמה, והניחו את הכלים באינקובטור תרבית תאים למשך 24 עד 72 שעות.שלב הטרנספקציה הוא השלב הקריטי ביותר בהליך, מכיוון שרוב עבודת הניסוי הנותרת לא יכולה להסתיים ביעילות אם התאים אינם ברי קיימא, ואינם מבטאים רמות משמעותיות של המבנה המתויג ב-GFP. בנקודת הזמן הניסוי המתאימה, הוסף 100 מיקרוגרם למיליליטר של רודמין הפרין למדיום תרבית התאים המבטא GFP-פלסמיד, ודגר את התאים, מוגנים מפני אור, עד להשגת רמת הצביעה הרצויה כפי שנצפתה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS וכמה שניות של ניעור עדין, מוגן מפני אור, ואחריו קיבוע עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.כדי להעריך את הלוקליזציה המשותפת של רודמין הפרין המתויג על ידי GFP, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם עירור GFP ורודמין המתאים ולייזרים מופחתים כדי לדמות לפחות 50 תאים מכל ניסוי תיוג נפרד. בחן את התמונות בתוכנית ניתוח התמונה המתאימה כדי לקבוע את הממצא היחסי של רודמין וספיגתו בכל תא, תוך שימוש בכלי יד חופשית כדי להקיף את התאים בתוך כל תמונה פלואורסצנטית. השתמש בכלי המדידה כדי לקבוע את העוצמה בתוך כל חלל מוקף בעיגול, ולאחר מכן ייצא את נתוני עוצמת הקרינה לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את השטח כפול העוצמה, תוך הפחתת הרקע עבור אותה כמות שטח עבור כל תא.לאחר מכן ניתן לחשב ממוצע של הקרינה לכל תא עבור כל התאים, כדי לקבל נתונים מובהקים סטטיסטית. כדי להקל על העברת אנרגיית התהודה הקרינה מ-GFP TMEM184A לרודמין הפרין, הרכיב תחילה GFP קבוע TMEM184A תאים עם תווית רודמין הפרין על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. לעורר את התאים ב-405 ננומטר להדמיית פליטת הרודמין, ולאחר מכן עירור של 488 ננומטר כדי לדמות את פליטת ה-GFP.לאחר מכן עורר את התאים ב-561 ננומטר להדמיית פליטת רודמין שנייה. להדמיית תאים חיים של ספיגת רודמין הפרין, זרעו תרבית צלחת קונפלואנט של 100 מיליליטר של תאים שעברו TMEM184A GFP לתוך צלחות הדמיה של תאים חיים בגודל 635 מילימטר כדי להשיג תאים ליד מפגש. לאחר 48 שעות, החלף את הסופרנטנט במדיום תרבית ללא פנול אדום, והעביר צלחת תאים למיקרוסקופ קונפוקלי עם שלב התחממות המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס.מקדו את המיקרוסקופ, והוסיפו 100 מיקרוגרם למיליליטר של רודמין הפרין לתאים בערבוב עדין. לאחר מכן התחל מיד להקליט את התמונות החיות. אם לא מתרחשת ספיגת הפרין בשדה הראייה, הזיזו מעט את הצלחת כדי לזהות את התאים עם שלפוחית ירוקה אחת לפחות, המכילה את תווית הרודמין.להערכת קשירת הפרין במבחנה, שטפו צלחת 96 בארות שחורה מצופה אטיוון וצלחת 96 בארות שחורה אחת לא מצופה עם 200 מיקרוליטר של 0.2% CHAPS PBS pro-well לשלוש שטיפות של חמש דקות עם ניעור. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 100 מיקרוליטר של 60 פיקומולים לבאר של אנטי-GFP ביוטיניל בשלוש עותקים לצלחת המצופה אטיוון עבור כל קבוצת מציאת GFP. לאחר מכן, הוסף חיץ רק לבארות הבקרה ואטום את כל הבארות בכיסוי צלחת לדגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר עם טלטול.בתום הדגירה, שטפו את כל הבארות שלוש פעמים ב-CHAPS PBS, כפי שהודגם זה עתה, והוסיפו 100 מיקרוליטר של חמישה ננומול לבאר של GFP TMEM184A, או GFP בלבד, לבארות המתאימות בצלחת המצופה אטיבן. לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר עם טלטול, שטפו את כל הבארות עם CHAPS PBS טרי, והוסיפו 100 מיקרוליטר מכל ריכוז פלואורסצאין-הפרין ניסיוני, לבארות הבדיקה המתאימות בשלוש עותקים, לצלחת המצופה באטיבן. הוסף את תקני הריכוז הן לצלחות המצופות באטיבן והן לצלחות הלא מצופות, ודגירה על שתי הלוחות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, עם טלטול, מוגן מפני אור.כעת, השתמש בקורא צלחות כדי לתעד את פליטת הפרין-פלואורסצנציה הראשונית בבארות הבקרה של שתי הלוחות, ואת פליטת הקרינה הכוללת הראשונית מהבארות עם TMEM184A ה-GFP או ה-GFP המשותק בצלחת המצופה אטיוואן. לאחר מכן העבירו את הפרין הפלואורסצנטי הבלתי קשור מהבארות עם TMEM184A ה- GFP או ה- GFP המשותק לבארות המתאימות בלוח השחור הלא מצופה. לאחר קריאה מיידית של פליטת הקרינה על הלוח השחור הלא מצופה, הוסף 100 מיקרוליטר של CHAPS PBS טרי בחזרה לבארות שמהן הוסר הפלואורסצין-הפרין, וקרא את פליטות הקרינה עבור בארות אלה כדי לקבל את פליטת הקרינה מהדגימות שהוסרו והלא קשורות בצלחת הלא מצופה.לאחר שהתקבלו כל הקריאות הלא מאוגדות, השתמש בערכי פליטת הפרין הכוללים כדי לאשר את הרמות הנכונות של הפרין שנוספו לכל באר, על ידי הפחתת קריאות הרקע הממוצעות מהערכים. לאחר מכן צור תרשים של הפליטה לעומת סך הפלואורסצאין-הפרין שנוסף, כדי לקבוע את קנה המידה של הפליטה לעומת כמות הפרין, ולשרטט את הפרין הקשור המתוקן, לעומת הפרין הנוסף עבור המשולש מבארות TMEM184A GFP ו-GFP. משך הזמן לאחר הטרנספקציה משפיע על התפלגות TMEM184A ה-GFP, שנראה כי מצטבר במשך 72 שעות לפחות, כאשר יותר GFP ניכר באזור הפרה-גרעיני לאורך זמן.נראה כי דפוס הצביעה של GFP בתרבית תאי כלי דם מייצגת זו, דומה ביותר לזה של נוגדן שהועלה כנגד פפטיד C-terminal, תוצאה הגיונית, בהתחשב בכך שה-GFP נמצא בקצה C של החלבון. השימוש בליגנד פלואורסצאין-רודמין-הפרין יכול לשמש גם להערכה בזמן אמת של לוקליזציה משותפת של קולטני ליגנד לאורך זמן. ספיגת הפרין מוגברת ב-GFP TMEM184A לבנות תאי נוקדאון יציבים שעברו טרנספטציה, וכתוצאה מכך תאים שיכולים להחזיר את היכולת להפנים רודמין הפרין ברמה של תאים מסוג בר או מעליה.באמצעות מערכת הטקט GFP המודגמת המקודדת בפלסמיד, מבנה TMEM184A GFP מבודד נוגדן נגד GFP מדגים קשירת הפרין טריפל ספציפית, בעוד שה-GFP הבקרה אינו קושר שום הפרין. צביעה אימונופלואורסצנטית פשוטה עם נוגדנים שוב GFP יכולה גם לספק מידע על מיקום ה-GFP, בהתבסס על גישת הנוגדנים בתאים שאינם חדירים ומספקת ראיות ראשוניות לכך שה-GFP המתבטא בקרום הפלזמה הוא חוץ-תאי. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לגרום לביטוי מצוין של מבנה GFP, לאחר 24 עד 48 שעות של תרבית.בעת ניסיון פרוטוקול הדמיה חיה, חשוב לזכור כי תאים מסוימים עשויים שלא להפגין את הספיגה המשותפת, ולכן לעתים קרובות יש צורך לבחון תאים אחרים. מבחני קשירה עם ליגנדים של GFP יכולים להיות מסובכים על ידי דימר או אגרגטים מסדר גבוה יותר של חלבון GFP, במיוחד אם הם נמצאים במיצלות דטרגנטים. בסך הכל, ביטוי של חלבונים מתויגים GFP יכול להקל על מגוון רחב של ניסויים כדי לאשר את זהותו של חלבון שלא היה ידוע בעבר.

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

כאן אנו מדגימים את השימוש בצבע ניאון אלקסה מצמידים את α-bungarotoxin למדוד GABA לוקליזציה הקולטן לפני השטח ואנדוציטוזה בנוירונים בהיפוקמפוס. באמצעות השימוש במבנים הנושאים תג תאי קצר שנקשר α-bungarotoxin, ניתוח של סחר endocytic פלזמה קרום חלבון יכול להיות מושגת.

שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר

כתב יד זה מתאר כיצד לבצע (מולקולה בודדת) Förster Resonance Energy Transfer (FRET) - מבחנים מבוססי Förster למדידת דינמיקת הקישור בין קולטן אנטיגן של תאי T (TCR) ומולקולות MHC עמוסות פפטידים אנטיגניות כפי שהן מתרחשות בתוך הסינפסה האימונולוגית של תא T במגע עם שכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת מישורית פונקציונלית.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

חלבוני מעטפת גרעינית ממלאים תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים בסיסיים רבים והיו מעורבים במגוון מחלות אנושיות.  פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר חדש מבוסס Cre/Lox המאפשר בקרה מרחבית-זמנית של שיבוש מתחמי LINC.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

מאמר זה מציג שיטה לימוד קולטן גלוטמט (GluR) סחר בתרבויות היפוקמאל העיקרי הנתק. באמצעות גישה האכלה נוגדן התווית אנדודוגני או קולטנים מוגזם בשילוב עם גישות פרמקולוגית, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים הוויסות ביטוי המשטח של GluR על ידי מודולים תהליכי הפנמה או מיחזור.

גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

כתב יד זה מתאר גישה מבוססת הגנום בקנה מידה מבוססי לזהות קולטן מסחטות-ליגניות ואינטראקציות.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

למדו לזהות את חלבון TMEM184A כקולטן הפרין בתאי כלי דם באמצעות תג GFP. שיטה זו מאפשרת אימות תפקודי של גנים יתומים ומספקת כלי רב-תכליתי למחקר חלבונים.

באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות

גלה סרטונים נוספים