באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות

המטרה הכוללת של שימוש במבנה מתויג GFP היא לאשר את זהותו של חלבון שלא היה ידוע בעבר באמצעות GFP כידית. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי תפקודי של גנים יתומים כאשר פעילות אנזים ספציפית אינה זמינה לאישור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתג ה-GPF מאפשר להשתמש באותו מבנה עבור מספר סוגים של ניסויים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להתקשות, מכיוון שהטרנספקציה לא תמיד מביאה לביטוי המבנה החזק, והתאים לא תמיד מתעוררים לחיים. הרעיון לשיטה הזו עלה לראשונה, כשהתחלנו לזהות את הקשיים בזיהוי חלבון באמצעות נוגדנים שנוצרו נגדו בלבד. התחל בהשעיית התאים המעניינים במיליליטר אחד של מאגר אלקטרופורציה של מי מלח חוצץ HEPES והנח מיד את התאים על קרח.

הוסף נפח מספיק של פלזמה מתויגת G TMEM184A FP לתאים כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם למיליליטר של DNA, והעביר כ-0.4 מיליליטר תאים לקובטה אלקטרופורציה מקוררת מראש. אלקטרופוראט את התאים. לאחר מכן ראו את התאים שהועברו על צלחות תרבית רקמה, והניחו את הכלים באינקובטור תרבית תאים למשך 24 עד 72 שעות.

שלב הטרנספקציה הוא השלב הקריטי ביותר בהליך, מכיוון שרוב עבודת הניסוי הנותרת לא יכולה להסתיים ביעילות אם התאים אינם ברי קיימא, ואינם מבטאים רמות משמעותיות של המבנה המתויג ב-GFP. בנקודת הזמן הניסוי המתאימה, הוסף 100 מיקרוגרם למיליליטר של רודמין הפרין למדיום תרבית התאים המבטא GFP-פלסמיד, ודגר את התאים, מוגנים מפני אור, עד להשגת רמת הצביעה הרצויה כפי שנצפתה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS וכמה שניות של ניעור עדין, מוגן מפני אור, ואחריו קיבוע עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.

כדי להעריך את הלוקליזציה המשותפת של רודמין הפרין המתויג על ידי GFP, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם עירור GFP ורודמין המתאים ולייזרים מופחתים כדי לדמות לפחות 50 תאים מכל ניסוי תיוג נפרד. בחן את התמונות בתוכנית ניתוח התמונה המתאימה כדי לקבוע את הממצא היחסי של רודמין וספיגתו בכל תא, תוך שימוש בכלי יד חופשית כדי להקיף את התאים בתוך כל תמונה פלואורסצנטית. השתמש בכלי המדידה כדי לקבוע את העוצמה בתוך כל חלל מוקף בעיגול, ולאחר מכן ייצא את נתוני עוצמת הקרינה לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את השטח כפול העוצמה, תוך הפחתת הרקע עבור אותה כמות שטח עבור כל תא.

לאחר מכן ניתן לחשב ממוצע של הקרינה לכל תא עבור כל התאים, כדי לקבל נתונים מובהקים סטטיסטית. כדי להקל על העברת אנרגיית התהודה הקרינה מ-GFP TMEM184A לרודמין הפרין, הרכיב תחילה GFP קבוע TMEM184A תאים עם תווית רודמין הפרין על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. לעורר את התאים ב-405 ננומטר להדמיית פליטת הרודמין, ולאחר מכן עירור של 488 ננומטר כדי לדמות את פליטת ה-GFP.

לאחר מכן עורר את התאים ב-561 ננומטר להדמיית פליטת רודמין שנייה. להדמיית תאים חיים של ספיגת רודמין הפרין, זרעו תרבית צלחת קונפלואנט של 100 מיליליטר של תאים שעברו TMEM184A GFP לתוך צלחות הדמיה של תאים חיים בגודל 635 מילימטר כדי להשיג תאים ליד מפגש. לאחר 48 שעות, החלף את הסופרנטנט במדיום תרבית ללא פנול אדום, והעביר צלחת תאים למיקרוסקופ קונפוקלי עם שלב התחממות המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס.

מקדו את המיקרוסקופ, והוסיפו 100 מיקרוגרם למיליליטר של רודמין הפרין לתאים בערבוב עדין. לאחר מכן התחל מיד להקליט את התמונות החיות. אם לא מתרחשת ספיגת הפרין בשדה הראייה, הזיזו מעט את הצלחת כדי לזהות את התאים עם שלפוחית ירוקה אחת לפחות, המכילה את תווית הרודמין.

להערכת קשירת הפרין במבחנה, שטפו צלחת 96 בארות שחורה מצופה אטיוון וצלחת 96 בארות שחורה אחת לא מצופה עם 200 מיקרוליטר של 0.2% CHAPS PBS pro-well לשלוש שטיפות של חמש דקות עם ניעור. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 100 מיקרוליטר של 60 פיקומולים לבאר של אנטי-GFP ביוטיניל בשלוש עותקים לצלחת המצופה אטיוון עבור כל קבוצת מציאת GFP. לאחר מכן, הוסף חיץ רק לבארות הבקרה ואטום את כל הבארות בכיסוי צלחת לדגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר עם טלטול.

בתום הדגירה, שטפו את כל הבארות שלוש פעמים ב-CHAPS PBS, כפי שהודגם זה עתה, והוסיפו 100 מיקרוליטר של חמישה ננומול לבאר של GFP TMEM184A, או GFP בלבד, לבארות המתאימות בצלחת המצופה אטיבן. לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר עם טלטול, שטפו את כל הבארות עם CHAPS PBS טרי, והוסיפו 100 מיקרוליטר מכל ריכוז פלואורסצאין-הפרין ניסיוני, לבארות הבדיקה המתאימות בשלוש עותקים, לצלחת המצופה באטיבן. הוסף את תקני הריכוז הן לצלחות המצופות באטיבן והן לצלחות הלא מצופות, ודגירה על שתי הלוחות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, עם טלטול, מוגן מפני אור.

כעת, השתמש בקורא צלחות כדי לתעד את פליטת הפרין-פלואורסצנציה הראשונית בבארות הבקרה של שתי הלוחות, ואת פליטת הקרינה הכוללת הראשונית מהבארות עם TMEM184A ה-GFP או ה-GFP המשותק בצלחת המצופה אטיוואן. לאחר מכן העבירו את הפרין הפלואורסצנטי הבלתי קשור מהבארות עם TMEM184A ה- GFP או ה- GFP המשותק לבארות המתאימות בלוח השחור הלא מצופה. לאחר קריאה מיידית של פליטת הקרינה על הלוח השחור הלא מצופה, הוסף 100 מיקרוליטר של CHAPS PBS טרי בחזרה לבארות שמהן הוסר הפלואורסצין-הפרין, וקרא את פליטות הקרינה עבור בארות אלה כדי לקבל את פליטת הקרינה מהדגימות שהוסרו והלא קשורות בצלחת הלא מצופה.

לאחר שהתקבלו כל הקריאות הלא מאוגדות, השתמש בערכי פליטת הפרין הכוללים כדי לאשר את הרמות הנכונות של הפרין שנוספו לכל באר, על ידי הפחתת קריאות הרקע הממוצעות מהערכים. לאחר מכן צור תרשים של הפליטה לעומת סך הפלואורסצאין-הפרין שנוסף, כדי לקבוע את קנה המידה של הפליטה לעומת כמות הפרין, ולשרטט את הפרין הקשור המתוקן, לעומת הפרין הנוסף עבור המשולש מבארות TMEM184A GFP ו-GFP. משך הזמן לאחר הטרנספקציה משפיע על התפלגות TMEM184A ה-GFP, שנראה כי מצטבר במשך 72 שעות לפחות, כאשר יותר GFP ניכר באזור הפרה-גרעיני לאורך זמן.

נראה כי דפוס הצביעה של GFP בתרבית תאי כלי דם מייצגת זו, דומה ביותר לזה של נוגדן שהועלה כנגד פפטיד C-terminal, תוצאה הגיונית, בהתחשב בכך שה-GFP נמצא בקצה C של החלבון. השימוש בליגנד פלואורסצאין-רודמין-הפרין יכול לשמש גם להערכה בזמן אמת של לוקליזציה משותפת של קולטני ליגנד לאורך זמן. ספיגת הפרין מוגברת ב-GFP TMEM184A לבנות תאי נוקדאון יציבים שעברו טרנספטציה, וכתוצאה מכך תאים שיכולים להחזיר את היכולת להפנים רודמין הפרין ברמה של תאים מסוג בר או מעליה.

באמצעות מערכת הטקט GFP המודגמת המקודדת בפלסמיד, מבנה TMEM184A GFP מבודד נוגדן נגד GFP מדגים קשירת הפרין טריפל ספציפית, בעוד שה-GFP הבקרה אינו קושר שום הפרין. צביעה אימונופלואורסצנטית פשוטה עם נוגדנים שוב GFP יכולה גם לספק מידע על מיקום ה-GFP, בהתבסס על גישת הנוגדנים בתאים שאינם חדירים ומספקת ראיות ראשוניות לכך שה-GFP המתבטא בקרום הפלזמה הוא חוץ-תאי. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לגרום לביטוי מצוין של מבנה GFP, לאחר 24 עד 48 שעות של תרבית.

בעת ניסיון פרוטוקול הדמיה חיה, חשוב לזכור כי תאים מסוימים עשויים שלא להפגין את הספיגה המשותפת, ולכן לעתים קרובות יש צורך לבחון תאים אחרים. מבחני קשירה עם ליגנדים של GFP יכולים להיות מסובכים על ידי דימר או אגרגטים מסדר גבוה יותר של חלבון GFP, במיוחד אם הם נמצאים במיצלות דטרגנטים. בסך הכל, ביטוי של חלבונים מתויגים GFP יכול להקל על מגוון רחב של ניסויים כדי לאשר את זהותו של חלבון שלא היה ידוע בעבר.