השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנן חומרים המיוצרים על ידי זן חיידקי אחד, המעכבים את זן החיידקים השני. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות במספר תחומים מיקרוביולוגיים, אך היא שימושית במיוחד באקולוגיה מיקרוביאלית, בהבנת אינטראקציות חיידקיות אנטגוניסטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא זולה וקלה לביצוע ולפרשנות.

מי שתדגים את ההליך תהיה אריתה, סטודנטית במעבדה. כדי להתחיל בניסוי, יש לחסן מושבה אחת של מזרק זרחן לתוך 3 מיליליטר של מרק King's Medium B, או KB. דגרו על התרבות בן לילה. למחרת בבוקר, יש לדלל את תרבית המרק ב -1 עד 100 ל -3 מיליליטר מרק KB טרי.

דגרו את התרבות במשך שלוש עד ארבע שעות עם ניעור בטמפרטורת החדר. ודא שלתרבית יש עלייה ניכרת בעכירות, ולאחר מכן הוסף מיטומיצין C.לאחר מכן, דגרו את התרבות למשך הלילה עם ניעור בטמפרטורת החדר. למחרת, גלולה של מיליליטר אחד עד שניים של מיטומיצין C גרמה לתרביות במיקרו צנטריפוגה על ספסל.

הסר ועקר את חומרי העל של התרבית על ידי העברת הסופרנטנט דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר. הוסף נתרן כלורי כדי להגיע לריכוז מולארי אחד, והוסף פוליאתילן גליקול, או PEG 8000, לריכוז סופי של 10%, לסופרנטנט הסטרילי. הפוך שוב ושוב את הדגימות עד שגם הנתרן הכלורי וגם ה-PEG מומסים לחלוטין.

דגרו את הדגימות באמבט קרח למשך שעה. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות. לאחר הסיבוב, שפכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הכדור במאגר על ידי פיפטינג שוב ושוב.

הסר את שאריות ה-PEG על ידי שתי תמציות עוקבות עם נפח שווה של כלורופורם. שלב עם כלורופורם עם הגלולה המושעה מחדש ומערבל את התערובת למשך 15 שניות. ואז צנטריפוגה את התערובת ב 20, 000 פעמים G למשך חמש דקות.

העבירו את השלב המימי העליון לצינור מיקרופוגה טרי. חזור על מיצוי זה פעמיים, עד שלא נראה ממשק לבן בין השלב המימי והאורגני. אפשר לשאריות כלורופורם להתאדות מסופרנטנטים שחולצו במכסה אדים.

חסנו מושבה אחת של זן מזרק P לשלושה מיליליטר של KB, ודגרו על התרבית למשך הלילה עם ניעור בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, יש לדלל את התרבית מ-1 עד 100 ל-KB טרי. דגרו את התרבות במשך שלוש עד ארבע שעות עם ניעור בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו אגר מים מעוקר על ידי חיטוי תרחיף אגר במים טהורים במיוחד.

שמור על האגר הרך המותך באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס לפני השימוש. בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילית, העבירו שלושה מיליליטר אגר רך לצינור תרבית סטרילי. החזר את צינור התרבות לאמבט המים כדי לשמור עליו במצב מותך.

לפני ששופכים את הכיסוי, הניחו לאגר המותך להתקרר, אך אל תאפשרו לו להתמצק. זה קריטי שהאגר יישמר במצב חם ומותך לחלוטין לפני החיסון. אם לא, הכיסוי יהיה בעל מראה מגורען ויהיה קשה יותר לפרש.

במכסה מנוע סטרילי, יש לחסן 100 מיקרוליטר מתרבית זן הבוחן לתוך האגר הרך והמערבולת לערבוב. סובב את התרבית ביד למשך 10 עד 15 שניות, ואז שפך אותה על תחתית צלחת אגר. הטה את הצלחת לכל הכיוונים כדי להבטיח שהאגר הרך מכסה באופן שווה את האגר התחתון.

מכסים את הצלחת ומניחים לה 20 עד 30 דקות להתמצק. היזהר לא להפריע לצלחת בזמן ההתמצקות. לאחר ההתמצקות, הבחין בשניים עד חמישה מיקרוליטרים של סופרנטנט על גבי השכבה.

הניחו לצלחות לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר. התבונן ורשום את התוצאות למחרת בבוקר. בשיטה זו, שני זנים של מזירי זרחן מעוכבים על ידי בקטריוצינים שונים.

זן A רגיש לחיידק טיילוצין בעל משקל מולקולרי גבוה, אך אינו רגיש לבקטריוצין חלופי בעל משקל מולקולרי נמוך. לעומת זאת, זן B אינו רגיש לטיילוצין, אך רגיש לבקטריוצין בעל המשקל המולקולרי הנמוך. הטיילוצין מתאושש ביעילות לאחר משקעי PEG, בעוד שבקטריוצינים בעלי משקל מולקולרי נמוך יותר לא.

הרג בתיווך בקטריופאג'ים נבדל מאנטי-מיקרוביאלים אחרים שאינם משכפלים על ידי השוואת סדרת דילול. במקרה של פינוי בתיווך בקטריופאג'ים, דילול הסופרנטנט נפתר לפלאקים בודדים, או אזורי טיהור, בעוד שקרחת בקטריוצין בתיווך לא נפתרה לפלאק כזה. הליך זה יכול לשמש כמסך ראשוני לזיהוי חומרים מעכבים, וניתן לשלב אותו עם מניפולציות גנטיות במורד הזרם כדי לזהות או לאשר את מקור הפעילות הזו.