Name: השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: למד שיטת מסך לזיהוי תרכובות מעכבות בחיידקים באמצעות שכבת אגר רכה. השיטה מאפשרת לחקור אינטראקציות אנטגוניסטיות בין זני P syringae ולזהות חומרים פעילים בקלות ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי המענק התחרותי של יוזמת מחקר החקלאות והמזון 2015-67012-22773 מהמכון הלאומי למזון וחקלאות של USDA ל-K.L.H.

1. הכנת Supernatant להיבדק עבור פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל של C mitomycin ידי המסת את הכמות המתאימה לתוך 0.1 סטרילי חיץ M MgSO 4 (חיץ למשל 1 מ&quot;ג mitomycin C / 2 מ&quot;ל). חנות המניה ב 4 מעלות צלזיוס במיכל מוגן האור (C mitomycin רגיש לאור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של פ syringae לתוך 3 מיליליטר של B הבינוני של המלך (KB) מרק 14. דגירה במשך הלילה עם רועד (200 סל&quot;ד) בטמפרטורת החדר (21-25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לדלל את התרבות מרק 1/100 לתוך 3 מ&quot;ל של מרק KB טריים. דגירה של 3-4 שעות עם רעד בטמפרטורת החדר. להוסיף C mitomycin (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, הריכוז הסופי). דגירה התרבות במשך הלילה עם רועד בטמפרטורת החדר. הערה: mitomycin C גורמת הפסקות DNA גדילים כפולות, ובכך ממגרת את תגובת ה- SOS של התא, המוביל ליצירה של שני בקטריופאג ו bacteriocins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 1-2 מ&quot;ל mitomycin C המושרה תרבויות על ידי צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 5 דקות ב microcentrifuge הספסל העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לעקר supernatants תרבות או על ידי העברת supernatant דרך פילטר גודל הנקבוביות 0.22 מיקרומטר או על ידי טיפול supernatant עם כלורופורם (100 כלורופורם μl לכל 1 מ&quot;ל supernatant). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות כלורופורם, המערבולת התערובת במשך 15 שניות ולתת דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לאחר דגירה, צנטריפוגות את התערובת על 20,000 XG במשך 5 דקות. הערה: כלורופורם ביעילות הורג תאים על ידי solubilizing הקרומים שלהם. היתרון של שימוש כלורופורם על עיקור מסנן הוא שזה זול יותר וקל יותר לגמלן אם עיבוד רב (&gt; 20) דגימות בכל פעם. תיתכן אפשרות כי פעילות הרג נתונה אבודה לאחר טיפול כלורופורם כתוצאת מחיצות לשלב האורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השלב העליון, מימי באמצעות pipet 1 מיליליטר ל 1.5 או 2.0 מיליליטר טרי, סטריליצינור microfuge. היזהר שלא להעביר כל שכבת כלורופורם הנמוכה (עדיף להסיר פחות של השלב המימי כדי למנוע מעל carry). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה supernatant הועבר ופתחה במנדף לאפשר כלורופורם שיורית להתאדות (כמה שעות). supernatants חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. ההפרדה וריכוז של תרכובות חיידקים משקל מולקולרי גבוה ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי supernatant סטרילי, להוסיף NaCl ו PEG 8000 עד 1 מ &#39;ו -10% ריכוזיים סופי, בהתאמה. שוב ושוב להפוך את המדגם עד שני NaCl ו PEG מתמוססים לחלוטין. דגירה דגימות באמבט קרח למשך שעה 1 או לילה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C.. גלולה צריכה טופס בתחתית הצינור צנטריפוגות. למזוג supernatant ו resuspend גלולה בנפח הרצוי (כגון 1/10 או 1/100 של vol supernatant המקוריume) של חיץ (10 מ&quot;מ טריס, 10 מ&quot;מ MgSO 4, pH 7.0) על ידי pipetting חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PEG שיורי על ידי שתי עקירות רציפות עם נפח שווה של כלורופורם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב כלורופורם עם הגלולה ו המערבולת המושעית למשך 10 עד 15 שניות, ואז צנטריפוגות את התערובת על 20,000 XG במשך 5 דקות. מעביר את השלב העליון, מימית לצינור microfuge טרי. חזור על החילוץ הזה עד אין ממשק לבן בין השלב המימי ואורגני גלוי (בדרך כלל 2 עקירות סכות הכל). אפשר כלורופורם שיורית להתאדות מן supernatants חילוץ במנדף. </li></ol></li></ol> 3. הכנת השכבה ובדיקת Supernatants עבור פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של זן פ syringae להיבדק עבור רגישות לתוך 3 מ&quot;ל של KB, דגירה במשך הלילה עם רועד בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, חזרה לדלל את התרבות 1/100 לתוך KB הטרי. דגירה 3-4 שעות עם רועד ב חדר טמפרטורותמִחָדָשׁ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן אגר מים מעוקרים ידי מעוקר% השעית 0.35-0.7 (w / v) אגר במי ultrapure. הערה: מלאי של אגר מים רכים יכולים להיות נמס במיקרוגל ולעשות בהם שימוש חוזר שוב ושוב, כיסוי טרי לא צריך להיות מוכן עבור כל ניסוי. אם אגר מים לשימוש חוזר, זה קריטי כדי לוודא שהוא נמס לגמרי בא במיקרוגל. אם לא, את שכבת-העל יצטרך מרקם מחוספס על ולהתגבש שיגרום פרשנות קשה. במקרה זה, להמיס את אגר במשך כמה דקות יותר במיקרוגל מאשר לעשות בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על אגר רך המותך באמבט מי C ° 60 לפני השימוש. שימוש pipet סרולוגיות סטרילי, העברת 3 מ&quot;ל של אגר רך לצינור תרבות סטרילי. החזר את צינור התרבות באמבט מים כדי לשמור אותן במצב מותך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפוך את הכיסוי, ראשון לאפשר אגר מותך להתקרר (זה צריך להרגיש חמים אך לא חם למגע), אך אינו מאפשר לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף סטרילי, לחסן 100 μl שלתרבות הזן הבוחן לתוך אגר ו המערבולת הרכות לערבב. סובב תרבות ביד במשך 10-15 שניות, ואז לשפוך על גבי (אגר KB) אגר תחתון. הטה את הצלחת לכל הכיוונים כדי להבטיח את אגרתי הרך באופן ברור מכסה את אגר התחתון. הערה: אגר התחתונה יכול להיות כל הקרושה (1.5% אגר) בינוני שבו זן הבדיקה גדל במרץ. עבור צלחת בקוטר סטנדרטי 100 מ&quot;מ פטרי, השתמש ~ 20 מ&quot;ל נמס בינוני. אגר התחתונה אפשר להכין כמה שבועות לפני הזמן (אם שמרו על 4 מעלות צלזיוס ללא ייבוש) או ניתן להכין באותו יום. אם מוכן באותו היום כמו ביצוע הכיסוי, עדיף לעשות זאת לפני שלב 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת ולאפשר לו 20-30 דקות כדי לחזק. היזהר שלא להפריע את הצלחת תוך לחיזוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקרושה, במקום 2-5 μl של supernatant (שנוצר בסעיפים 1 ו -2 לעיל) על השכבה. אפשר הצלחות כדי לדגור במשך הלילה בטמפרטורת החדר. להתבונן תוצאות שיא למחרת בבוקר. הערה:עשוי להיות שימושי כדי לבצע ספוט מתוך דילול סדרתי של supernatant. זה יאפשר לחוקרים להבחין בין בקטריופאג ואת פעילות הסליקה bacteriocin. במקרה זה, מומלץ לבצע 1: 5 או 1:10 דילולים. </li></ol>

<ol><li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+of+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li>
<li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth%27s+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li>
<li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li>
<li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colicin+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+and+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li>
<li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+Microbial+Invasions%3A+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li>
<li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li>
<li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li>
<li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li>
<li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+of+Plant-Associated+Bacteria%22%5BJournal%5D)">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li>
<li>Panec, M., Katz, D. S. Plaque Assay Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols">Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols</a> (2013).</li>
<li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Inst+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652(1936).</li>
<li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li>
<li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeng%2C+NCK+%22Bacteriocins%22">Bacteriocins</a>. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li>
<li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

טכניקת הכיסוי הרך אגר המתוארת כאן יושמה נרחבת במשך עשרות שנים רבות על ידי חוקרים מעוניינים ופאג&#39;ים או bacteriocins. היתרונות העיקריים של גישה זו הם כי הוא פשוט, זול יחסית קל לפרש. על ידי שילוב של כיסוי רך אגר עם ממטרים PEG ו דילול סדרתי, סוכני מיקרוביאלית ניתן לחלק גבוה לעומת סוכנים משקל מולקולרי נמוך, בשכפול הדנ&quot;א לעומת סוכנים שאינם בשכפול הדנ&quot;א (כלומר בקטריופאג לעומת tailocin, בהתאמה). לבסוף, שילוב של מניפולציה גנטית ממוקדת (מחיקות שלמות) של bacteriocin המשוערת או לוקוסי prophage יכול לקבוע את זהותה בתקיפות של תרכובת נתונה אנטגוניסטית. השתמשנו לאחרונה בשיטה זו כדי לתאר בקטריופאג הנגזרות חדש bacteriocin הרווחת בקרב Pseudomonas syringae זנים 9. תקשורת הצמיחה ותנאים מצוינים עבודה בפרוטוקול זה גם עבור Pseudomonas סאיםringae ו יספיק סביר עבור חיידקים גראם-שלילי אחרים הגדלים במרץ בתנאים אלה. עם זאת, חוקרים בשיטה זו ירצו לייעל את העיתוי, בינוני התרבות, שיטת אינדוקציה, וטמפרטורת דגירה של המערכת שלהם. הפרמטרים הקריטיים כוללים גרימת התרבות לייצר תוך בשלב צמיחת הלוגריתמים, כמו גם זריעת הכיסוי רך אגר עם תרבות בשלב לוגריתמים מספיק כדי להבטיח חלוקת חיידקים אחידה, אבל לא התרבות יתר, אשר מטשטשת אזורי סליקה פוטנציאליים. ישנם bacteriocins רב שאינם מושרים במסגרת תגובת ה- SOS, אלא הם המושרה באמצעות מערכות חישה קוורום מבוסס פפטיד (במיוחד bacteriocins גראם חיובי 15), ובכך, חוקר אולי כדאי להקרין כמה שיטות אינדוקציה שונות (כגון שינוי תוכן תזונתי של גרימה בינונית, או המאפשרים דגירה ממושכת של זן הייצור). בעת שימושבטכניקה זו, הכיסוי רך אגר חייב להיות נמס ביסודיות ומתוחזק על 55-60 מעלות צלזיוס לפני התוספת של זן הזריעה. היו לנו כמה בניסויים שבם-אגר הרך לא הותך ביסודיות (אם כי מבחינה ויזואלית זה נראה) וגרם שכבה עם מראה מגורען. תוצאות מ שכבה מגורענת עדיין יכולות להיות וניתנות לפרשנות בדרך כלל, עם זאת, זה תלוי את הכח של העיכוב (עיכוב החלש יהיה קשה יותר כדי לצפות). השתנו סופי, בלבול שיש להביא בחשבון בעת ​​השימוש בטכניקה זו היא שהטמפרטורה של אגר המותך מותרת מספיק זמן להתקרר לפני חיסון עם זן הזריעה, כדי למנוע הרג את מתח הזריעה. כדי למנוע בעיה זו, אנו להבטיח את אגר רך חם, אבל לא חם, לגעת. ברוח דברים אלה, יש לנו גם ציינו כי אם אנחנו נותנים זמן מספיק בשביל תרבות זריעה להסתגל אגרתי המותך, לפני מזיגת הכיסוי, אנחנו מחלצים גרמו חיידקי עניים בדרך כללrowth, מה שהופך פרשנות של עיכוב ספציפי קשה או בלתי אפשרי לפרש. זו הסיבה שאנו מאפשרים 10-15 שניות נוספות של דגירה בין vortexing ושופך השכבה. Trade-off בין השמירה על אגר במצב מותך לחלוטין (חם עדיף) אך לא חשף את מתח הזריעה (חם הוא לא טוב יותר) הוא אחת כי סביר להניח שאתה צריך להיקבע על ידי חוקר באמצעות ניסוי וטעייה. אם צעד ממטרי PEG משמש, זה יהיה מועיל לכלול שליטה שלילית שבו מדיום מרק סטרילית מעובד זהה supernatant התרבות. פעולה זו תבטיח כי הרג הפעילות אינה תוצאה של PEG שיורית או כלורופורם בתוך supernatant המדגם. כפי שניהם ופאג&#39;ים ו bacteriocins נוטים להיות מאוד ספציפי, אין זה נדיר להיתקל אין פעילות הרג לכאורה עם שילוב של זנים נתונים. זה יכול לנבוע ממגוון מחדש זן ספציפימנגנוני sistance, אחד להיות כי המתח הבוחן או חסר או יש גרסה לא מוכרת של הקולטן דרושי מיקוד ידי bacteriocin או bacteriophage נתונים. שיטה חלופית, שיטת הקרנת bacteriocin תוארה על ידי קאוואי et al. , אבל סובל חסרונות ולא אומצה 16 נרחב. באופן ספציפי, טכניקה זו מחייבת התבוננות דגימות מרק במרווחי זמן שיכול להיות מעיק, ואינה מאפשרת לאפליה בין פעילויות הרג בקטריופאג נגזרות bacteriocin הנגזרת. המגבלות העיקריות של טכניקה זו היא כי הוא אינו מתאים גם עבור אורגניזמים שאינם גדלים וחסון (ובכך יחסרו אזורי סליקה להבחין בקלות) או כי prophages הנמל או bacteriocins שלא מיוצרים וחסונה בתנאי מעבדה. לאימוצו של הטכניקה הזו כדי לזהות bacteriocins מיוצר דגימות סביבתיות הן ירחיב את תוכנית השירותבטכניקה זו ולהקל להבין טוב יותר את התפקיד של bacteriocins בתוך סביבה טבעית.

לאחרונה, חלה התעניינות משמעותית להעמקת ההבנה שלנו של אקולוגיה של חיידקים (בעיקר microbiomes של סביבות שונות), כמו גם תרכובות אנטיבקטריאלי חדשות להשתמש במאבק פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה 1,2. נושא מקשר בין האינטרסים אלה הוא הבנת אינטראקציות אנטגוניסטית בין זני חיידקים בסביבתם הטבעית. ישנן דרכים רבות בהן חיידקים להרגיז המתחרים 3. Bacteriocins, קבוצה מגוונת של תרכובות חלבוניים, אנטיבקטריאלי, נחקרו ארוכות על תפקידם בתיווך אנטגוניזם interbacterial, עם שני המינים הנחקרים ביותר להיות Pseudomonas aeruginosa 4,5 ו Escherichia coli 6, פתוגנים אנושיים חשובים. בנוסף bacteriocins, המושרה prophages יכול גם פועלים כסוכני anticompetitor, המאפשר זן לפלוש לתוך נישה כי כבר יישבו 7. Pseudomonas syringae הוא פתוגן צמח ידוע לייצר מערך סוכני מיקרוביאלית, כולל bacteriocins חלבון היחיד 8, נגזרות זנב בקטריופאג bacteriocins 9 (המכונה tailocins), כמו גם מטבוליטים משניים שאינם חלבוניים 10. לאחרונה חלה התעניינות בהבנה כיצד antimicrobials אלה משפיע על האקולוגיה של האורגניזם הזה, כמו גם איך הם יכולים להיות רתומים לשלוט צמח מחלה 11. שיטת שימוש נרחבת ללימוד הוא bacteriocins ו בקטריופאג היא טכניקת הכיסוי הרכה-אגר. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Gratia בשנת 1936 על מנת לסייע בתהליך ספירת 12,13 bacteriophage. כאן אנו מתארים את יישום שיטת הכיסוי הרך-אגר, בשילוב עם מניפולציה גנטית ממוקדת פוליאתילן גליקול (PEG) ממטרים, שחר להבחנה בתוך שלושה סוכנים מיקרוביאלית שונים (א בקטריופאג, bact משקל מולקולרי גבוהeriocin, וכן bacteriocin משקל מולקולרי נמוך) המיוצר על ידי זן חיידקים אחד. היתרון של גישה זו הוא כי זה יחסית פשוט וזול, וזו הסיבה, למרות היותו זה בהחלט &quot;לואו-טק&quot;, הוא עדיין שימוש נרחב.

<table><tbody><tr><td>מיטומיצין C</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-3514</td><td>מסרטן. השתמש ב-PPE מתאים (כלומר כפפות, מגן עיניים ומסכת פנים), במיוחד בעת הכנת תמיסת המלאי.</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34854</td><td>רעיל מאוד, סכנה נשימתית. יש להשתמש ב-PPE (כפפה ומגן עיניים) מתאימים, לטפל במיכלים פתוחים בתוך קולט אדים כימיים.&nbsp;</td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול (PEG)</td><td>אמרסקו</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>אגר בדרגה בקטריולוגית</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

הטכניקה כיסוי רך אגר פותחה במקור לפני למעלה מ -70 שנה ויש בו נעשה שימוש נרחב מספר תחומי מחקר מיקרוביולוגי, כולל עבודה עם ופאג&#39;ים ו bacteriocins, סוכנים אנטיבקטריאלי חלבוניים. גישה זו היא זולה יחסית, עם דרישות משאבים מינימאליות. טכניקה זו מורכב תצפית supernatant מן זן תורם (מחסה פוטנציאל תרכובת רעילה (ים)) על גבי כיסוי אגר רך הקרושה כי הוא זרע עם זן מבחן בקטריאלי (שעשוי להיות רגיש אל התרכובת הרעילה (ים)). ניצלנו בטכניקה זו כדי להקרין ספריה של Pseudomonas syringae זנים להרג intraspecific. על ידי שילוב גישה זו עם צעד ממטר ומחיקות גן ממוקדות, תרכובות רעילות מרובות המיוצרות על ידי הזן הזהה יכולות להיות מובחנות. שני הסוכנים אנטגוניסטית התאוששו בדרך כלל באמצעות טכניקה זו הם ופאג&#39;ים ו bacteriocins. סוכנים שני אלה יכולים להיות מובחנים באמצעותשתי בדיקות נוספות פשוט. ביצוע דילול סדר על supernatant המכיל בקטריופאג יגרום הפלאק בודד אהיה פחות במספרים עם דילול גדול יותר, ואילו דילול סדרה של supernatant המכיל bacteriocin יגרום אזור קרחת הופך אחיד יותר עכור עם דילול גדול יותר. בנוסף, בקטריופאג יפיק אזור סליקה כאשר הבחין על שכבה אגרה רכה טריה זורעת עם הזן הזהה, ואילו bacteriocin לא יצר אזור סליקה כאשר הועבר מדשאה אגרה רכה טריה, בשל הדילול של bacteriocin.

השילוב של הכיסוי אגר הרך ממטרי PEG יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין סוכני מיקרוביאלית שונים המיוצרים על ידי אותו הזן. איור 1 מציג שני זנים של פ syringae (A ו- B) כי מעוכבים על ידי זן שלישי מאותו המין. שני הזנים, לעומת זאת, מעוכבים על ידי bacteriocins השונה. אזור סליקת זן מפגין קצה חד, ואילו אזור סליקת B מתח הוא גדול, והוא מציג גבול הלא חדה. מניפולציות גנטיות בתוך הזן לייצר באופן ספציפי להשבית גם את tailocin (tailocin לקוי) או משקל מולקולרי נמוך bacteriocin (bacteriocin לקוי) לאשר כי זני A ו- B רגישים bacteriocins הברור. איור 2 מראה כי הרג בתיווך בקטריופאג ניתן להבחין בין antimicrobials הלא בשכפול הדנ&quot;א האחר על ידי השוואת סדרת דילול. מכיוון שגם bacteriocins וprophage יכול להיגרם על ידי טיפול C mitomycin, פעילותם של שני חומרים אלה יכולים להידמות הדוק זה לזה (במיוחד אם הפאג מופעל בשפע). במקרה של סליקה בתיווך בקטריופאג, דילול של supernatant יפתור לתוך הפלאק בודד (אזורי סליקה) בעוד סליקת bacteriocin בתיווך לא תפתור לתוך הפלאק כזה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> איור 1: הבחנה פנוטיפי של סוכני מיקרוביאלית מרובים המיוצרים על ידי הזן הזהה. זן הוא רגיש bacteriocin משקל מולקולרי גבוה (tailocin) אך לא משקל מולקולרי נמוך אלטרנטיבה bacteriocin, כפי שמעידים חוסר סליקת זן tailocin הלקוי, אך לא זן bacteriocin הלקוי. לעומת זאת, זן B הוא חסר רגישות tailocin, אבל הוא רגיש bacteriocin המשקל המולקולרי הנמוך. Tailocin הוא efficiently התאושש הבאים ממטרים PEG, בעוד bacteriocins משקל מולקולרי נמוך אינם. WT = סוג בר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> איור 2: הבחנה בין אי-בשכפול הדנ&quot;א antimicrobials ופאג&#39;ים. (א) דילול של כייל גבוה של תוצאות ופאג&#39;ים פלאק הבודד שהופכים פחות רב (למעלה כייל גבוה, בתחתית כייל נמוכה). (ב) דילול של תוצאות bacteriocins בסליקה פחות אחיד כי אינו פותר לתוך הפלאק בודד. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אנו מתארים שיטה פשוטה לסינון תרביות חיידקים לייצור תרכובות מעכבות כלפי חיידקים אחרים.

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לסרוק חומרים המיוצרים על ידי זן חיידקי אחד, אשר מעכבים זן חיידקי שני. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות במספר תחומים מיקרוביולוגיים, אך היא שימושית במיוחד באקולוגיה מיקרובית, להבנת אינטראקציות חיידקיות אנטגוניסטיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא זולה, קלה לביצוע וקלה לפירוש.את ההליך תדגים ארת'ה, סטודנטית במעבדה. כדי להתחיל בניסוי, יש להחדיר מושבה בודדת של P syringae לתוך 3 milliliters של מצע King's Medium B נוזלי, או KB. יש לדגרה את התרבית למשך לילה. למחרת בבוקר, יש לדלל את תרבית המצע ביחס של 1 ל-100 לתוך 3 milliliters של מצע KB טרי.דגרו את התרבית במשך שלוש עד ארבע שעות עם ניעור בטמפרטורת החדר. ודאו כי חלה עלייה ניכרת בעכירות התרבית, ולאחר מכן הוסיפו Mitomycin C. לאחר מכן, דגרו את התרבית למשך לילה עם ניעור בטמפרטורת החדר. למחרת, השקיעו מלמיליטר אחד עד שניים של תרביות שעברו השראה באמצעות Mitomycin C במיקרו-צנטריפוגה שולחנית.יש להסיר ולעקר את העל-נוזלים של התרבית על ידי העברת העל-נוזל דרך מסנן בעל נקביות של 0.22 micrometer. יש להוסיף נתרן כלוריד עד להשגת ריכוז של one molar, ולהוסיף פוליאתילן גליקול, או PEG 8000, לריכוז סופי של 10%, אל העל-נוזל הסטרילי. יש להפוך את הדגימות שוב ושוב עד להמסה מלאה של נתרן הכלוריד וה-PEG.דגרו את הדגימות באמבט קרח למשך שעה אחת. לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה. לאחר הסבוב, שפכו את הסוپرנאטנט ותלו את המשקע בבופר באמצעות פיפטינג חוזר.הסר PEG ששאר במערכת באמצעות שתי חילוצים רצופים עם נפח שווה של כלורופורם. ערבב את הכלורופורם יחד עם המשקע שהושעה מחדש וסחרר (vortex) את התערובת למשך 15 שניות. לאחר מכן, סבב את התערובת בצנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך חמש דקות.העבירו את הפאזה המימית העליונה למבחנה חדשה עבור מיקרוצנטריפוגה. חזרו על חילוץ זה פעמיים, עד שלא ייראה ממשק לבן בין הפאזה המימית לפאזה האורגנית. הניחו לכלורופורם השיורי להתאדות מה上נאטים המnotinly בחלל עבודה עם מנדף (fume hood).החדר מושבה אחת של זן P syringae לתוך שלושה מיליליטרים של מצע KB, ודגור את התרבית למשך לילה עם ניעור בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, דלל את התרבית ביחס של 1 ל-100 לתוך מצע KB רענן. דגור את התרבית למשך שלוש עד ארבע שעות עם ניעור בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכן אגאר-מים סטרילי על ידי אוטוקלבינג של סספנסיות של אגאר במים אולטרה-טהורים.שמרו את האגר הרך המותך באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס לפני השימוש. באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית, העבירו 3 מיליליטר של אגר רך למבחנת תרבית סטרילית. החזירו את מבחנת התרבית לאמבט המים כדי לשמור עליה במצב מותך.לפני מזיגת שכבת הכיסוי, יש להמתין להתקררות האגר המומס, אך אין להניח לו להתמצק. חיוני שהאגר יישמר במצב חם ומומס לחלוטין לפני ההזריעה. במידה ולא כך יקרה, לשכבת הכיסוי יהיה מראה גרגירי ויהיה קשה יותר לפרש את התוצאות.בתוך מ 빠르게 מנקודה סטרילית, יש להוסיף 100 µL מתרבית זן הבדיקה אל האגר הרך ולערבב באמצעות וורטקס. יש לסובב את התרבית ידנית למשך 10 עד 15 שניות, ולאחר מכן לשפוך אותה לתחתית של צלחת אגר. יש להטות את הצלחת לכל הכיוונים כדי להבטיח שהאגר הרך מכסה באופן אחיד את האגר התחתון.כסו את המצע והמתינו 20 עד 30 דקות להת굳דות. היזהרו לא להטריף את המצע בזמן ההת굳דות. לאחר ההת굳דות, טפטפו שני עד חמישה µL של על-משקע (supernatant) על השכבה העליונה.השאירו את הפלטות לדגירה למשך הלילה בטמפרטורת החדר. צפו בתוצאות ורשמו אותן למחרת בבוקר. בשימוש בשיטה זו, שני זנים של P syringae נעיכבים על ידי בקטריוצינים שונים.זן A רגיש לבקטריוצין Tailocin בעל משקל מולקולרי גבוה, אך אינו רגיש לבקטריוצין חלופי בעל משקל מולקולרי נמוך. לעומת זאת, זן B אינו רגיש ל-Tailocin, אך הוא רגיש לבקטריוצין בעל המשקל המולקולרי הנמוך. ניתן להפיק את ה-Tailocin ביעילות לאחר שיקוע PEG, בעוד שבקטריוצינים בעלי משקל מולקולרי נמוך יותר אינם מופקים באופן זה.הריגה המתווכת על ידי בקטריופאגים נבדלת מחומרים אנטי-מיקרוביאליים לא-משכפלים אחרים באמצעות השוואה של סדרת דילול. במקרה של פינוי המתווך על ידי בקטריופאגים, דילול של הנוזל העליון התפרק לפlaques בודדים, או אזורי פינוי, בעוד שפינוי המתווך על ידי בקטריוצין לא התפרק לפlaques דומים. ניתן להשתמש בהליך זה כסריקה ראשונית לזיהוי גורמים מעכבים, וניתן לשלב אותו עם מניפולציות גנטיות בהמשך כדי לזהות או לאשר את מקור הפעילות הזו.

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאשר עובדים עם התקשורת ריאגנטים המשמשים מיקרואורגניזמים תרבות, הטכניקה aseptic חייב להיות מתורגל כדי להבטיח זיהום ממוזער. מגוון שיטות ציפוי משמשים באופן שגרתי כדי לבודד, להפיץ, או חיידקים למנות ו הפאג, אשר כולם לשלב נהלים השומרים על עקרות של חומרים ניסיוניים.

טכניקות מעבדה אספטיים: שיטות ציפוי

מקור: Rugjee, K. N., et al. הקמת מערך תפוקה גבוהה לסינון מולקולות קטנות המווסתות איתות c-di-GMP ב-Pseudomonas aeruginosa.  J. Vis. Exp. (2016).סרטון זה מדגים את ההקרנה של מאפנני di-GMP מחזוריים באמצעות חיידקים מהונדסים גנטית המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשליטת מקדם רגיש ל-c-di-GMP. הקרינה נמדדת בצלחת מרובת בארות המכילה תרכובות בדיקה שונות. תרכובות המעכבות ייצור c-di-GMP מובילות להפחתת הקרינה. לאחר מכן הנתונים מנותחים כדי לזהות מודולטורים פוטנציאליים של איתות c-di-GMP בחיידקים.

סינון של מאפנני di-GMP מחזוריים באמצעות חיידקים המבטאים חלבון מדווח פלואורסצנטי 

מקור: Hockett, K. L., ו-Baltrus, D. A. שימוש בטכניקת שכבת האגר הרכה לסינון תרכובות מעכבות שנוצרות על ידי חיידקים. J. Vis. Exp. (2017)הסרטון הזה מדגים את ההליך לזיהוי הריגה מתווכת בקטריוצין על ידי זיהוי סופרנטנט מזן תורם שנגרם על ידי אנטיביוטיקה על שכבת אגר רכה המכילה זן בדיקה. אזורים נקיים שנוצרים לאחר הדגירה מעידים על עיכוב חיידקים.

מבחן שכבת אגר רכה לזיהוי הרג בתיווך בקטריוצין ב-Pseudomonas syringae

סרטון זה מציג את בדיקת עיכוב הגדילה הנדחה, המשמשת לחקר האופן שבו תרכובות אנטי-מיקרוביאליות המיוצרות על-ידי סוג אחד של חיידקים משפיעות על זן חיידקים מתחרה אחר.

בדיקת עיכוב גדילה נדחית להערכת ההשפעה של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות שמקורן בחיידקים

התחרות בסטרפטוקוקוס פנאומוניה מתווכת על ידי בקטריוצין, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים קטנים עם פעילות מעכבת כלפי פנאומוקוק ומינים קשורים אחרים. כאן אנו מתארים בדיקת שכבת-על חיידקית אופטימלית המאפשרת אפיון של פעילות בקטריוצין וספקטרום מעכב, חסינות ספציפית לבקטריוצין וזיהוי פפטידים לחישת מניין מופרשים.

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

ניתן להשתמש בבדיקת עיכוב הגדילה הנדחית כדי להעריך את השפעת התחרות על ידי חיידק מבודד אחד על אחר. עיכוב מכומת על ידי מדידת אזור הפינוי סביב המבודד המייצר מעכב, או מוערך באופן איכותי על ידי קביעת היקף העיכוב הנראה לעין.

צמיחה נדחית Assay העיכוב לכמת את ההשפעה של antimicrobials הנגזר חיידקים על תחרות

מחקר זה מציג את הפיתוח של מתודולוגיות הניתנות לשחזור לחקר מעכבי ביופילם והשפעותיהם על Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

בנייר שיטה זה, אנו מציגים אסטרטגיית סינון בתפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות כימיות, כגון אוסמוליטים, שיש להן השפעה משמעותית על התמדה חיידקית.

הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

למד שיטת מסך לזיהוי תרכובות מעכבות בחיידקים באמצעות שכבת אגר רכה. השיטה מאפשרת לחקור אינטראקציות אנטגוניסטיות בין זני P syringae ולזהות חומרים פעילים בקלות ובעלות נמוכה.

השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

גלה סרטונים נוספים