Name: הפרדת אלקטרופורזה הנימים של חד השבטי הנוגדן isoforms באמצעות נימי Neutral (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: למד את פרוטוקול האלקטרופורזה בנימים לניתוח נוגדנים חד-שבטיים. שיטה זו משפרת את מיומנויות האנליטיקאים במעבדות כימיה אנליטית ומבטיחה הערכה אמינה של תכונות איכות הנוגדנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לווילי על הרשות שניתנה להשתמש במושגים של הפרסום הבא עבור הדרכה זו. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: ניתוח נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטיים על ידי אלקטרופורזה של אזור נימי. אלקטרופורזה. 2013. 34. 1133-1140. זכויות יוצרים Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. עבודה זו נתמכה על ידי CONACyT, מקסיקו, מענק 230551.

<ol><li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li>
<li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li>
<li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li>
<li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic%2C+Electrophoretic%2C+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+identity%2C+charge+variants%2C+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li>
<li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li>
<li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+protein+analysis+in+the+biopharmaceutical+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Intact protein analysis in the biopharmaceutical field.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).</li>
<li>Altria, K. D. Troubleshooting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltria%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Vol+52.+Capillary+Electrophoresis+Guidebook%3A+Principles%2C+Operation+and+Applications%22">Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications</a>. Altria, K. D. , Chapter 10 (1996).</li>
<li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li>
<li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li>
</ol>

המחברים קרלוס א. אספינוזה-דה לה גרזה, רודולפו ד. סלזאר-פלורס, נסטור א. פרז, לואיס פ. פלורס-אורטיז ואמיליו מדינה-ריברו הם עובדים של Probiomed S.A. de C.V., המפתחת, מייצרת ומשווקת מוצרים ביוסימילרים. כל המחברים מעורבים בפיתוח מוצרים ביוסימילרים עבור פרוביומד.

במדריך זה, אנו מדגישים את החשיבות של שיטות נכונות בעת ביצוע CZE מנתח של מבז כדי להגדיל את ההסתברות להצליח. עם זאת, כאשר CZE משמש על בסיס שגרתי, מתעוררות בעיות בלתי נמנע 12. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, חשוב לעקוב אחר ההערות שנכללו ברחבי הפרוטוקול, כפי שהם יעזרו האנליסט להתגבר ולפתור צעדים קשים. שיקול מרכזי להשיג רזולוציה אופטימלית סט של תנאים שניתן הוא הכנה הנכון של פתרון BGE. תהליך זה מצריך שליטה קפדני...

נוגדנים חד-שבטיים (מבז) הם חלבונים biotherapeutic עם הגדלת הריבית בשל יכולתם לפעול נגד מספר 1 כרונית ניוונית מחלות. כמו ביומולקולות אחרות, מהבז נוטה לעבור שינויי physicochemical כמה בכל שלבי מחזור החיים שלהם (כלומר, מן ביוסינתזה למוצר הסופי). כזה שינויים כוללים, אך אינם מוגבלים ל: deamidation, glycosylation, חמצון, cyclization, isomerization, צבירה פרוטאוליטים מחשוף 2. לפיכך, שיטות אנליטיות מסוגלת לפתור isoforms המהותי יש צורך לפקח ההטרוגניות מבז ויציבות כדי להקים מפרט איכות. אלקטרופורזה נימים (CE) היא טכנולוגית הפרדה גבוהה ביצועים נשאה outinside של צינור התמזג-סיליקה צר (טווח מיקרומטר) מלא עם אלקטרוליט רקע (BGE). במועד היישום של שדה חשמלי (עד 30,000 V), טעונה מולקולההים נודד לעבר אלקטרודה עם מטען נגדי (כלומר, פרדה מונחה אלקטרו). השימוש במתח גבוה ב CE מאפשר ניתוחים מהירים התייעלות, אשר עדיפים על ג&#39;ל אלקטרופורזה קלסית. אלקטרופורזה אזור נימים (CZE) היא טכניקה מבוססת לספירה בשימוש השיגרתי בתעשיית הביו-פרמצבטיקה להערכת איכות מוצר 3-9. בניגוד מצבים אחרים של לסה&quot;נ (למשל, ג&#39;ל אלקטרופורזה נימי, איזואלקטרית נימי התמקדות) או בשיטות מבוססות כרומטוגרפיה, CZE יכול להתנהל ללא שימוש denaturants או ממשקי-שלב מוצק, המאפשר ניתוח של בהטרוגניות הטבועה מבז קרוב למצב הטבעי שלהם 10 . הפרדת CZE של isoforms מב מתרחשת בתוך נימים התמזג-סיליקה מכוסות פולימר הידרופילי (נימים ניטראליות), והיא מבוססת על ניידות electrophoretic השונה שלהם, אשר נשלטת על ידי תשלום, המוני, גודל וצורה (או נפח הידרודינמית) 11. moieties מב מזוהה כאשרהם מגויסים ועוברים דרך חלון איתור, אשר חשו על ידי גלאי אולטרה סגול (UV) ספיגת ב 214 ננומטר 4. היישום המוצלח של שיטה אנליטית זה יהיה תלוי תשומת לב ראויה פרטים לפני ובמהלך הניסוי. ממלא מקום אחר יגדיל את העלות והזמן לבצע את הניתוח, ובסופו של דבר מוביל כישלון ותסכול מתמידים. כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד מדריך כדי לבצע ניתוח מוצלח של ההטרוגניות מב ידי CZE דרך ההסבר המפורט של הכנת פתרונות ודוגמאות, הכנת מערכת לספירה, שיטות המכשירות להגדיר, רכישת הנתונים, עיבוד נתונים. לצורך הדרכה זו, אלפא גורם נמק אנטי סרטניים רקומביננטי אנושי מלא (אנטי-TNFα) מב משמש כמודל חלבון; עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם אישית בקלות על הניתוח של חלבונים אחרים בהתחשב שינויים קצרים. אdditionally, כמה המלצות כדי להקטין בעיות פוטנציאליות מוצעות. הקורא מוזמן לעקוב אחר הפרוטוקול המוצע בקפדנות, בהסתברות להצליח יגדל.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית בדרגת ACS</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>היסטמין דיהידרוכלוריד</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr> <tr><td>(הידרוקסיפרופיל) מתיל צלולוז&nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-חומצה אמינוקפרואית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50.0 מ"מ, &nbsp; pH 8</td><td>בקמן קולטר</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 פלוס מערכת ניתוח פרמצבטי</td><td>בקמן קולטר</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP נימי ניטרלי&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון, מיקרו, 200 ומיקרו; l</td><td>בקמן קולטר</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>מכסי בקבוקון אוניברסליים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקונים אוניברסליים</td><td>כבל בקמן קולטר</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>, אופטיקה, מודול גלאי UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td></td> ערכת הרכבת מחסניות 144733<td></td></tr><tr><td>, Blank</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>144738</tr></tbody></table>

הפרדת אלקטרופורזה הנימים של חד השבטי הנוגדן isoforms באמצעות נימי neutral

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

חלבונים ביותרפיים, כגון נוגדנים חד-שבטיים (mAbs), הם חלופות אפשריות לטיפול במחלות כרוניות-ניווניות. הפעילות הביולוגית של חלבונים אלה תלויה בתכונותיהם הפיזיקוכימיות. השימוש בטכניקות בעלות ביצועים גבוהים כמו כרומטוגרפיה ואלקטרופורזה נימית תואר לניתוח הטרוגניות פיזיקוכימית של mAbs. כיום, טכניקת אלקטרופורזה של אזור נימי (CZE) מהווה את אחת הבדיקות הנחרצות והרגישות ביותר לניתוח ביומולקולות. חוץ מזה, ההפרדה המונעת אלקטרו ב-CZE נשלטת על ידי תכונות נרחבות של חומר ומציעה את היתרון של ניתוח חלבונים קרוב למצבם המקורי. עם זאת, היישום המוצלח של טכניקה זו לניתוח שגרתי תלוי בכישוריו של האנליסט בשלבים הקריטיים במהלך הכנת המדגם והמערכת. מטרת הדרכה זו היא לפרט את השלבים להצלחה בניתוח CZE של mAbs. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש לפיתוח ושיפור מיומנויות של הצוות המעורב במעבדות כימיה אנליטית של חלבונים.

איור 2 מציג את פרופיל זרם חשמלי טיפוסי של אצטט ליתיום 200 מ&quot;מ EACA, 30 מ&quot;מ, BGE pH 4.8 עם מדגם אנטי TNFα מב מדולל טריס חיץ (50 מ&quot;מ, ה- pH 8.0). כפי שניתן לשים לב, הזרם הוא יציב לאורך כל ניתוח יכול להתנדנד בין ערכים של 30 עד 35 מיקרו-אמפר. איור 3 מציג את CZE electropherogram של מדגם ריק שבו השיא זוהה תואם את התקן הפנימי היסטמין. צפוי עבור היסטמין להיות זמן נדידה של 3.7 עד 4.1 דקות. איור 4</str...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורזה מקיף של אזור נימי להערכת הטרוגניות פיזיקוכימית מהותית של נוגדנים חד-שבטיים כתכונה איכותית.

הפרדת אלקטרופורזה הנימים של חד השבטי הנוגדן isoforms באמצעות נימי Neutral

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

כיום, טכניקת אלקטרופורזה של תאים בנימים מהווה את אחת השיטות בעלות הרזולוציה והרגישות הגבוהות ביותר לניתוח של ביו-מולקולות כגון נוגדנים מונוקלונליים. עם זאת, היישום המוצלח של טכניקה זו תלוי בידע ובמיומנויות של האנליסט בשלבים הקריטיים במהלך הכנת הדגימות והמערכת. מדריך זה נועד להסביר כיצד לבצע ניתוח מוצלח, וכולל הסבר מפורט מאוד על הכנת התמיסות והדגימות, הכנת מערכת האלקטרופורזה הנימית, הגדרת שיטת המכשירים, וקבלת החלטות ועיבוד נתונים.בסך הכל, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לפיתוח ושיפור המיומנויות של הצוות המעורב בהכנת מעבדות לכימיה אנליטית. שקלו כמות של HPMC כדי להגיע לריכוז סופי של 0.05% ב-100 millileters. כיוון ש-HPMC הוא פולימר אלסטי בסיסי, כשלב ראשון, שפכו את האבקה לתוך כוס כימית מזכוכית, והוסיפו 80 milliliters של מים באיטיות כדי לפרק את גושי האבקה.לאחר מכן, שטפו את מגש ההרטבה במים כדי להסיר שאריות אבקה. הוסיפו את שאר הריאגנטים כבדרך כלל וערבבו את התמיסה. התאימו את ערך ה-pH ל-4.8 באמצעות חומצה אצטית בריכוז 50%.המתינו חמש דקות להתייצבות התמיסה. לאחר מכן, התאימו את ה-pH לפי הצורך. הוסיפו מים עד להשגת נפח סופי של 100 milliliters.סננו את תמיסת ה-BG שהוכנה דרך ממברנה ניטרופילית, ושפכו אותה לבקבוק זכוכית. לבסוף, סמנו את בקבוק הזכוכית באופן מתאים, ואחסנו אותו בקירור. על מנת להכין את הדגימה, כשלב ראשון הוסיפו 162 µl של תמיסת trace buffer לשפופרת של 1.5 ml.לאחר מכן, הוסיפו 18 µL של דגימת map שהוכנה מראש בריכוז של 10 mg/mL. כשלב שלישי, הוסיפו 20 µL של תמיסת היסטמין בריכוז של 1% שהוכנה מראש, כדי להגיע לנפח דגימה סופי של 200 µL. בשלב הבא, הכינו את הדגימה למשך חמש שניות.סבבו בצנטריפוגה למשך חמש שניות. שאבו את כל נפח הדגימה. העבירו את הנוזל כלפי מעלה אל תוך מיקרו-מבחנה כדי למנוע היווצרות בועות.לבסוף, סגרו את הבקבוקון ושמרו אותו בקירור. כבו את מכשיר ה-CE על ידי לחיצה על מתג ההפעלה. פתחו את הדלת הקדמית.הנח מגבון ניגוב חדש מתחת לבלוק הממשק. שטוף את האלקטרודות דרך בלוק הממשק במים באמצעות בקבוק שטיפה. הנח למים לטפטף דרך החורים וייבש את בלוק הממשק ביסודיות.הסר בזהירות את עודפי המים מהאלקטרודות באמצעות הניגוב. הקפד לא לגעת באלקטרודות במהלך הליך זה. הסר את הניגוב ממערכת החזקת הדגימה.נקו את פני השטח של מגשי הדגימות בעזרת מטלית נקייה טבולה במים. נקו גם את פני השטח של מגשי התמיסות (buffer). החליקו את מגשי התמיסות כלפי מעלה, הרימו את מערכת החזקת הדגימות, ונקו את פני השטח שלהם באמצעות המטלית.החזירו את מגשי הבופר למקומם. לאחר מכן, נקו ביסודיות את בלוק הממשק. נקו את מוט הסגירה ואת בית מנורת ה-UV.בסיום, הקפידו לבחון את המערכת לפני השימוש. שטפו את מנופי הפתיחה במים באמצעות בקבוק שטיפה. נקו את פני השטח שלהם ביסודיות בעזרת ניגוב חד-פעמי שאינו משיר סיבים, כדי להסיר אבק ומלחים שהצטברו.לבסוף, ודאו שאתם בודקים אותם לפני ההתקנה. נקו את שני קצות כבל הסיב האופטי בעזרת מטלית מיקרופייבר לחה במים ואשרו את פעולת תא האור בין הקצוות. הוציאו קפילרה ניטרלית חדשה מאריזתה.העבירו כעת קצה אחד של צינור ההגנה של הנימי אל שולחן העבודה. פתחו ויישרו את צינור הפלסטיק, ומשכו את הנימי החוצה מהצינור בזהירות. הדביקו פיסת נייר לשולחן העבודה עם סימני המדידה הבאים.יישרו את חלון הנימי לנקודת האפס של סימוני המדידה בסנטימטרים באופן הבא: לאחר מכן, קבעו את קצוות הנימי לספסון העבודה בעזרת סרט דביק. סמנו את קצוות הנימי שני מילימטרים מחוץ לסימוני המדידה. חתכו את מכסה ההגנה מקצה הנימי הרחוק ביותר מהחלון.טבל את קצה הנימי בתוך מבחנת CE מלאה במים כדי למנוע נזק בלתי הפיך לציפוי הפנימי של הנימי. הוצא את הנימי מהמבחנה והכנס קצה זה בזהירות לצד היציאה של המחסנית. ברגע שהנימי מופיע בצד השני, משוך את הכמות הדרושה עד שחלון הנימי יהיה ממורכז ביחס לחלון המחסנית באופן הבא.לאחר מכן, הפכו את המחסנית והחדירו את פקק הפתח לחלון המחסנית, תוך לחיצה עד להישמעו נקישה המעידה על נעילה במקום. היזהרו לא לשבור את חלון הנימי במהלך הליך זה. ודאו שאור עובר דרך החלון כאשר הוא נחשף למקור אור רחב.החדירו את הקפילריה לתוך צינור הקירור שהוכן מראש, כאשר הצינור המותקן מראש אינו פתוח וכולל אטם O-ring. דחפו את הקפילריה דרך הצינור עד שהיא מופיעה בצדו השני. לאחר מכן, הכניסו את קצה הצינור לצד היציאה של המחסנית, והדקו את אגוזי הצינור.הכנס את קצה הכניסה של הנימי לצד הכניסה של המחסנית. ברגע שהנימי מופיע בצד השני, משוך אותו כפי שנדרש. לאחר מכן, הכנס את קצה הצינור לצד הכניסה של המחסנית והדק את אומות הצינור.גזרו את כיסוי ההגנה בקצה הנימי הקרוב ביותר לחלון. התקינו את תפסני קיבוע התא מעל קצות הנימים, תוך לחיצה עד להקשמה במיקום כפי שמוצג. גזרו את קצות הנימים מתחת לקווי הייחוס בלוחות הארכת הנימים.יש לבחון את קצות הנימיים באמצעות זכוכית מגדלת. אם קצות הנימיים אינם חלקים, יש להחליק אותם באמצעות אבן הליטוש (cleven stone). הכניסו את טבעת ה-O של הפתח לתוך החור הכחול של הפתח.הכנס אותו בזהירות באמצעות כלי להכנסת ה-o-ring. לבסוף, התקן מבחנות CE מלאות במים בתוך בית המחסנית, והכנס את המחסנית לביתה באופן מיידי כאשר קצוות הנימיים מוכנסים למבחנות, ואחסן בקירור. כוון את נפח הפ pipette.הוסיפו את נפח המים הנכון לפתח הכניסה של הבאפר (buffer inlet) בקואורדינטות המגש A1, B1 ו-F6, ולפתח היציאה של הבאפר (buffer outlet) בקואורדינטות המגש A1, B1, C1, E6 ו-F6. הוסיפו HCl 0.1 normal לפתח הכניסה של הבאפר בקואורדינטות המגש C1 ו-E6. הוסיפו BGE לפתח הכניסה של הבאפר בקואורדינטות המגש D1 ו-E6, ולפתח היציאה של הבאפר בקואורדינטה D1. לבסוף, סגרו את כל מבחנות ה-CE במגשי הכניסה והיציאה של הבאפר. במהלך הפרוצדורה, הימנעו מהרטבת מכסי המבחנות כדי למנוע דליפת פחמן. פתחו את הדלת הקדמית של מכשיר ה-CE.ראשית, התקינו את גלאי ה-UV והדקו אותו על ידי סיבוב הבורג עם כיוון השעון. הרימו את הדלת הפנימית, והתקינו את מנופי הפתיחה על ידי לחיצה עליהם כלפי מעלה אל תוך בלוק הממשק. הכניסו את כבל הסיב האופטי לתוך התפס וסובבו אותו עם כיוון השעון.חברו את הקצה השני לגלאי. טפלו בכבל הסיב האופטי בזהירות, כיוון שכיפוף עלול לגרום לשבירתו. הניחו את מגש הדגימות בתוך מערכת החזקת הדגימות והלבישו אותו למקומו.בהתאם לאותו הליך, מקמו את מגשי התמיכה במערכת החזקת הדגימות. הרימו את מוט הסגירה ומקמו את מחסנית הנימיים בבלוק הממשק. לחצו על מוט הסגירה בשני קצותיו והדקו את הכפתורים על ידי סיבוב עם כיוון השעון.סגור את הדלת הפנימית, וסגור את הדלת הקדמית. לבסוף, הדלק את מכשיר ה-CE על ידי לחיצה על מתג ההפעלה. צור את שיטת התנאי למכשיר.הגדירו את הפרמטרים בצוות התנאים ההתחלתיים, כולל המתח, המחסנית, טמפרטורת אחסון הדגימה והגדרות ההפעלה (trigger). בחרו ב-2014 כארך הגל לרכישה. הגדירו את הפעולות שיבצע המכשיר על ידי הגדרת הפרמטרים בתאים מתוכנתי זמן.כולל את ההגדרות הספציפיות לכל אחד משלבי השטיפה, ההזרקה וההפרדה. בצעו הליך זה כדי ליצור את שיטות ההרצה של ההתנייה (conditioning) וכיבוי המכשיר. השלב הבא הוא יצירת רצף (sequence) חדש.תכנת את הקפילריה לה acondicioning (התנייה) באמצעות שיטת ההתנייה. אם הקפילריה בשימוש בפעם הראשונה, תכנת ארבע חזרות. אחרת, תכנת שתי חזרות.לאחר מכן, תכנתו את הדגימות המיועדות לניתוח באמצעות שיטת ההרצה. לבסוף, תכנתו את הנימיא לאחסון באמצעות שיטת הכיבוי. ניתוח אלקטרופורזה נימית הושלם תוך 30 דקות.התוצאה הראשונה תואמת לסטנדרט הפנימי של היסטמין כמדד לביצועי המערכת התקינים. לאחר מכן מופיעות צורות בסיסיות, ראשיות וחומציות מובחנות של הנוגדן החד-שבטי הנבדק. ההפרדה כולה מתבצעת תחת זרם קבוע של כ-30 microamperes.לאחר הרצת הניסוי, ייצאו את הנתונים הגולמיים מתוכנת ה-grab וייבאו אותם באמצעות תוכנת empower לצורך עיבוד. אחוז התוכן של כל צורת קרח מתקבל לאחר אינטגרציה של קו ירידה אנכי של פרופיל האלקטרופורגרמה. כאן הצגנו מדריך מפורט שלב אחר שלב לביצוע ניתוח של פעילויות מונוקלונליות שנוצרו באמצעות אלקטרופורזה של תאים בנימיות.בנוסף למספר המלצות להפחתת בעיות פוטנציאליות, הפרוטוקול המוצג הנוכחי מציע את היתרון של התאמה קלה לניתוח של חלבונים אחרים, באמצעות ביצוע שינויים קלים בפרמטרי המוליכות וה-pH.

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים 2F5 באמצעות ליגנדות DsRed-2F5-Epitope או DFE. נוגדנים חד שבטיים מטוהרים 2F5 הם תרופות חיוניות באימונותרפיה.

כרומטוגרפיית זיקה מבוססת DFE: טכניקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים 2F5 מדגימה גולמית באמצעות תנאי אלוציה מבוססי חוזק יוני גבוה

סרטון זה מדגים טכניקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים מתרבית תרבית המתקבלת מתרבית תאים המייצרת נוגדנים. התהליך כולל שימוש במטריצה של חרוזי אגרוז מוצלבים עם חלבון A מצומד, אשר משתק את הנוגדנים בסופרנאטנט שעל החרוזים, ומאפשר הפרדה יעילה ממזהמים. על ידי החלת חיץ אלוציה עם pH נמוך, האינטראקציה בין חלבון לנוגדן A מתרופפת, מה שמקל על איסוף שברים המכילים נוגדנים.

טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים

סרטון זה מדגים פרוטוקול אימונואסאי של אלקטרופורזה נימית לאיתור סמן ביולוגי חלבוני הקשור לטרשת אמיוטרופית צידית (ALS) מטסיות דם אנושיות. אישור נוכחותו של חלבון הסמן הביולוגי ALS מושג באמצעות הפרדה מבוססת גודל של חלבוני טסיות הדם ואחריה זיהוי כימילומינסנטי.

אלקטרופורזה נימית Immunoassay לזיהוי סמנים ביולוגיים חלבונים

ראגנטים מבוסס-נים באמצעות פלטפורמה מסחרית כדי למדוד את היעד חלבונים מן ההכנות חלבון הכולל הוא הפגין. בנוסף, הפרמטרים וזמינותו של זמן החשיפה, לריכוז החלבון נוגדן דילול הממוטבות מערכת מודל של התרבות תאים.

הליך ואסטרטגיות אופטימיזציה מפתח שיטה אוטומטית נימי מתכלה מבוסס על Electrophoretic

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

התמקדות לגירויי כאב נימי הוא שיטת התפוקה נוגדן מבוסס, העדינה, גבוהה, המאפשרת אפיון מפורט של חלבונים ו שלהם איזופורמים של דגימות ביולוגיות קטן מאוד. להלן מתאר פרוטוקול זיהוי, כימות של חלבונים ספציפיים, איזופורמים שלהם באופן אוטומטי ו- robotized.

זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי

פרוטוקול מפורט לטיהור וניתוח מאוחר יותר של נוגדן חד שבטיים מתוך נוזל שנקטפו לתרבות התא (HCF) של microbioreactors חקנים אוטומטיים תוארה. השימוש בניתוח כדי לקבוע תכונות איכות קריטיות (CQAs) ולמקסם את נפח מדגם מוגבל כדי לחלץ מידע חיוני מוצג גם.

טיהור וניתוח של נוגדן חד שבטיים מן הסינית שחלות אוגר תאים באמצעות מערכת Microbioreactor חקן אוטומטי

פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט ומהיר להערכת המצב האוליגומרי של חלבון GTPase MxA דמוי דינמין מליזאטים של תאים אנושיים באמצעות שילוב של PAGE שאינו דנטורציה עם ניתוח כתמים מערביים.

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של נוגדן טיפולי מערכת ביטוי יונקת. השיטות שתוארו כוללות הכנת DNA וקטור, transfection היציבה והתאמת סרום ללא של קו תא 293 כליות עוברי אנושי, להקים תרבויות בקנה מידה גדולות טיהור באמצעות כרומטוגרפיה זיקה.

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

למד את פרוטוקול האלקטרופורזה בנימים לניתוח נוגדנים חד-שבטיים. שיטה זו משפרת את מיומנויות האנליטיקאים במעבדות כימיה אנליטית ומבטיחה הערכה אמינה של תכונות איכות הנוגדנים.

הפרדת אלקטרופורזה הנימים של חד השבטי הנוגדן isoforms באמצעות נימי Neutral

גלה סרטונים נוספים