הפרדת אלקטרופורזה הנימים של חד השבטי הנוגדן isoforms באמצעות נימי Neutral

כיום, טכניקת אלקטרופורזה של תאים בנימים מהווה את אחת השיטות בעלות הרזולוציה והרגישות הגבוהות ביותר לניתוח של ביו-מולקולות כגון נוגדנים מונוקלונליים. עם זאת, היישום המוצלח של טכניקה זו תלוי בידע ובמיומנויות של האנליסט בשלבים הקריטיים במהלך הכנת הדגימות והמערכת. מדריך זה נועד להסביר כיצד לבצע ניתוח מוצלח, וכולל הסבר מפורט מאוד על הכנת התמיסות והדגימות, הכנת מערכת האלקטרופורזה הנימית, הגדרת שיטת המכשירים, וקבלת החלטות ועיבוד נתונים.

בסך הכל, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לפיתוח ושיפור המיומנויות של הצוות המעורב בהכנת מעבדות לכימיה אנליטית. שקלו כמות של HPMC כדי להגיע לריכוז סופי של 0.05% ב-100 millileters. כיוון ש-HPMC הוא פולימר אלסטי בסיסי, כשלב ראשון, שפכו את האבקה לתוך כוס כימית מזכוכית, והוסיפו 80 milliliters של מים באיטיות כדי לפרק את גושי האבקה.

לאחר מכן, שטפו את מגש ההרטבה במים כדי להסיר שאריות אבקה. הוסיפו את שאר הריאגנטים כבדרך כלל וערבבו את התמיסה. התאימו את ערך ה-pH ל-4.8 באמצעות חומצה אצטית בריכוז 50%.

המתינו חמש דקות להתייצבות התמיסה. לאחר מכן, התאימו את ה-pH לפי הצורך. הוסיפו מים עד להשגת נפח סופי של 100 milliliters.

סננו את תמיסת ה-BG שהוכנה דרך ממברנה ניטרופילית, ושפכו אותה לבקבוק זכוכית. לבסוף, סמנו את בקבוק הזכוכית באופן מתאים, ואחסנו אותו בקירור. על מנת להכין את הדגימה, כשלב ראשון הוסיפו 162 µl של תמיסת trace buffer לשפופרת של 1.5 ml.

לאחר מכן, הוסיפו 18 µL של דגימת map שהוכנה מראש בריכוז של 10 mg/mL. כשלב שלישי, הוסיפו 20 µL של תמיסת היסטמין בריכוז של 1% שהוכנה מראש, כדי להגיע לנפח דגימה סופי של 200 µL. בשלב הבא, הכינו את הדגימה למשך חמש שניות.

סבבו בצנטריפוגה למשך חמש שניות. שאבו את כל נפח הדגימה. העבירו את הנוזל כלפי מעלה אל תוך מיקרו-מבחנה כדי למנוע היווצרות בועות.

לבסוף, סגרו את הבקבוקון ושמרו אותו בקירור. כבו את מכשיר ה-CE על ידי לחיצה על מתג ההפעלה. פתחו את הדלת הקדמית.

הנח מגבון ניגוב חדש מתחת לבלוק הממשק. שטוף את האלקטרודות דרך בלוק הממשק במים באמצעות בקבוק שטיפה. הנח למים לטפטף דרך החורים וייבש את בלוק הממשק ביסודיות.

הסר בזהירות את עודפי המים מהאלקטרודות באמצעות הניגוב. הקפד לא לגעת באלקטרודות במהלך הליך זה. הסר את הניגוב ממערכת החזקת הדגימה.

נקו את פני השטח של מגשי הדגימות בעזרת מטלית נקייה טבולה במים. נקו גם את פני השטח של מגשי התמיסות (buffer). החליקו את מגשי התמיסות כלפי מעלה, הרימו את מערכת החזקת הדגימות, ונקו את פני השטח שלהם באמצעות המטלית.

החזירו את מגשי הבופר למקומם. לאחר מכן, נקו ביסודיות את בלוק הממשק. נקו את מוט הסגירה ואת בית מנורת ה-UV.

בסיום, הקפידו לבחון את המערכת לפני השימוש. שטפו את מנופי הפתיחה במים באמצעות בקבוק שטיפה. נקו את פני השטח שלהם ביסודיות בעזרת ניגוב חד-פעמי שאינו משיר סיבים, כדי להסיר אבק ומלחים שהצטברו.

לבסוף, ודאו שאתם בודקים אותם לפני ההתקנה. נקו את שני קצות כבל הסיב האופטי בעזרת מטלית מיקרופייבר לחה במים ואשרו את פעולת תא האור בין הקצוות. הוציאו קפילרה ניטרלית חדשה מאריזתה.

העבירו כעת קצה אחד של צינור ההגנה של הנימי אל שולחן העבודה. פתחו ויישרו את צינור הפלסטיק, ומשכו את הנימי החוצה מהצינור בזהירות. הדביקו פיסת נייר לשולחן העבודה עם סימני המדידה הבאים.

יישרו את חלון הנימי לנקודת האפס של סימוני המדידה בסנטימטרים באופן הבא: לאחר מכן, קבעו את קצוות הנימי לספסון העבודה בעזרת סרט דביק. סמנו את קצוות הנימי שני מילימטרים מחוץ לסימוני המדידה. חתכו את מכסה ההגנה מקצה הנימי הרחוק ביותר מהחלון.

טבל את קצה הנימי בתוך מבחנת CE מלאה במים כדי למנוע נזק בלתי הפיך לציפוי הפנימי של הנימי. הוצא את הנימי מהמבחנה והכנס קצה זה בזהירות לצד היציאה של המחסנית. ברגע שהנימי מופיע בצד השני, משוך את הכמות הדרושה עד שחלון הנימי יהיה ממורכז ביחס לחלון המחסנית באופן הבא.

לאחר מכן, הפכו את המחסנית והחדירו את פקק הפתח לחלון המחסנית, תוך לחיצה עד להישמעו נקישה המעידה על נעילה במקום. היזהרו לא לשבור את חלון הנימי במהלך הליך זה. ודאו שאור עובר דרך החלון כאשר הוא נחשף למקור אור רחב.

החדירו את הקפילריה לתוך צינור הקירור שהוכן מראש, כאשר הצינור המותקן מראש אינו פתוח וכולל אטם O-ring. דחפו את הקפילריה דרך הצינור עד שהיא מופיעה בצדו השני. לאחר מכן, הכניסו את קצה הצינור לצד היציאה של המחסנית, והדקו את אגוזי הצינור.

הכנס את קצה הכניסה של הנימי לצד הכניסה של המחסנית. ברגע שהנימי מופיע בצד השני, משוך אותו כפי שנדרש. לאחר מכן, הכנס את קצה הצינור לצד הכניסה של המחסנית והדק את אומות הצינור.

גזרו את כיסוי ההגנה בקצה הנימי הקרוב ביותר לחלון. התקינו את תפסני קיבוע התא מעל קצות הנימים, תוך לחיצה עד להקשמה במיקום כפי שמוצג. גזרו את קצות הנימים מתחת לקווי הייחוס בלוחות הארכת הנימים.

יש לבחון את קצות הנימיים באמצעות זכוכית מגדלת. אם קצות הנימיים אינם חלקים, יש להחליק אותם באמצעות אבן הליטוש (cleven stone). הכניסו את טבעת ה-O של הפתח לתוך החור הכחול של הפתח.

הכנס אותו בזהירות באמצעות כלי להכנסת ה-o-ring. לבסוף, התקן מבחנות CE מלאות במים בתוך בית המחסנית, והכנס את המחסנית לביתה באופן מיידי כאשר קצוות הנימיים מוכנסים למבחנות, ואחסן בקירור. כוון את נפח הפ pipette.

הוסיפו את נפח המים הנכון לפתח הכניסה של הבאפר (buffer inlet) בקואורדינטות המגש A1, B1 ו-F6, ולפתח היציאה של הבאפר (buffer outlet) בקואורדינטות המגש A1, B1, C1, E6 ו-F6. הוסיפו HCl 0.1 normal לפתח הכניסה של הבאפר בקואורדינטות המגש C1 ו-E6. הוסיפו BGE לפתח הכניסה של הבאפר בקואורדינטות המגש D1 ו-E6, ולפתח היציאה של הבאפר בקואורדינטה D1. לבסוף, סגרו את כל מבחנות ה-CE במגשי הכניסה והיציאה של הבאפר. במהלך הפרוצדורה, הימנעו מהרטבת מכסי המבחנות כדי למנוע דליפת פחמן. פתחו את הדלת הקדמית של מכשיר ה-CE.

ראשית, התקינו את גלאי ה-UV והדקו אותו על ידי סיבוב הבורג עם כיוון השעון. הרימו את הדלת הפנימית, והתקינו את מנופי הפתיחה על ידי לחיצה עליהם כלפי מעלה אל תוך בלוק הממשק. הכניסו את כבל הסיב האופטי לתוך התפס וסובבו אותו עם כיוון השעון.

חברו את הקצה השני לגלאי. טפלו בכבל הסיב האופטי בזהירות, כיוון שכיפוף עלול לגרום לשבירתו. הניחו את מגש הדגימות בתוך מערכת החזקת הדגימות והלבישו אותו למקומו.

בהתאם לאותו הליך, מקמו את מגשי התמיכה במערכת החזקת הדגימות. הרימו את מוט הסגירה ומקמו את מחסנית הנימיים בבלוק הממשק. לחצו על מוט הסגירה בשני קצותיו והדקו את הכפתורים על ידי סיבוב עם כיוון השעון.

סגור את הדלת הפנימית, וסגור את הדלת הקדמית. לבסוף, הדלק את מכשיר ה-CE על ידי לחיצה על מתג ההפעלה. צור את שיטת התנאי למכשיר.

הגדירו את הפרמטרים בצוות התנאים ההתחלתיים, כולל המתח, המחסנית, טמפרטורת אחסון הדגימה והגדרות ההפעלה (trigger). בחרו ב-2014 כארך הגל לרכישה. הגדירו את הפעולות שיבצע המכשיר על ידי הגדרת הפרמטרים בתאים מתוכנתי זמן.

כולל את ההגדרות הספציפיות לכל אחד משלבי השטיפה, ההזרקה וההפרדה. בצעו הליך זה כדי ליצור את שיטות ההרצה של ההתנייה (conditioning) וכיבוי המכשיר. השלב הבא הוא יצירת רצף (sequence) חדש.

תכנת את הקפילריה לה acondicioning (התנייה) באמצעות שיטת ההתנייה. אם הקפילריה בשימוש בפעם הראשונה, תכנת ארבע חזרות. אחרת, תכנת שתי חזרות.

לאחר מכן, תכנתו את הדגימות המיועדות לניתוח באמצעות שיטת ההרצה. לבסוף, תכנתו את הנימיא לאחסון באמצעות שיטת הכיבוי. ניתוח אלקטרופורזה נימית הושלם תוך 30 דקות.

התוצאה הראשונה תואמת לסטנדרט הפנימי של היסטמין כמדד לביצועי המערכת התקינים. לאחר מכן מופיעות צורות בסיסיות, ראשיות וחומציות מובחנות של הנוגדן החד-שבטי הנבדק. ההפרדה כולה מתבצעת תחת זרם קבוע של כ-30 microamperes.

לאחר הרצת הניסוי, ייצאו את הנתונים הגולמיים מתוכנת ה-grab וייבאו אותם באמצעות תוכנת empower לצורך עיבוד. אחוז התוכן של כל צורת קרח מתקבל לאחר אינטגרציה של קו ירידה אנכי של פרופיל האלקטרופורגרמה. כאן הצגנו מדריך מפורט שלב אחר שלב לביצוע ניתוח של פעילויות מונוקלונליות שנוצרו באמצעות אלקטרופורזה של תאים בנימיות.

בנוסף למספר המלצות להפחתת בעיות פוטנציאליות, הפרוטוקול המוצג הנוכחי מציע את היתרון של התאמה קלה לניתוח של חלבונים אחרים, באמצעות ביצוע שינויים קלים בפרמטרי המוליכות וה-pH.