Name: הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: למד ליצור הידרוגלים ממטריקס ריאתי לתרבית תאים תלת-ממדית. שיטת דה-תאית של ריאות חזיר מייצרת סקפולדים הניתנים להתאמה אישית לחקר אינטראקציות תאים במחלות ריאה שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות חוות סמית&#39;פילד על תרומת רקמת הריאה החזירית ללא פגע. אנו רוצים גם להודות לד&quot;ר הו יאנג, ד&quot;ר כריסטינה טאנג והמחלקה לכירורגיה פלסטית VCU עבור ומאפשר לנו להשתמש בציוד שלהם. דגימות הידרוג&#39;ל ורקמות הוכנו עבור SEM במחלקה לאנטומיה VCU מתקן מיקרוסקופית לנוירוביולוגיה נתמך, בין השאר, על ידי מימון NIH-NINDS מרכז Core גרנט 5 P30 NS047463 ו, בין השאר, על ידי טופס מימון גרנט תמיכה במרכז לחקר הסרטן NIH-NCI CA016059 P30. הדמיה SEM של דגימות במתקן אפיון Core ננוטכנולוגיה VCU (NCC). עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע, CMMI 1,351,162.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פִּתָרוֹן </td><td> סינון סטרילי </td><td> כיווני </td></tr><tr><td> DiH 2 O </td><td> כן </td><td> DiH 2 O; סטרילי מסונן </td></tr><tr><td> פתרון 0.1% Triton X-100 </td><td> כן </td><td> מתחת למכסה המנוע קטר להוסיף 100 μl טריטון-X 100 פתרון ל -100 מ&quot;ל DiH 2 O ו להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי. </td></tr><tr><td> 2% פתרון Deoxycholate </td><td> כן </td><td> מתחת למכסה המנוע קטר להוסיף פתרון נתרן Deoxycholate 2 g לכל 100 מ&quot;ל DiH 2 O ו להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> כן </td><td> הוסף 58.44 גרם NaCl 1 ליטר של DiH 2 O; להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי </td></tr><tr><td> פתרון DNase </td><td> כן </td><td> להוסיף 12,000יחידות DNase עד 1 L DiH 2 O; הוסף 0.156 גרם MgSO 4 (נטול מים), ו 0.222 גרם CaCl 2; להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי </td></tr><tr><td> PBS </td><td> כן </td><td> שלב 27.2 גרם Na 2 4 HPO · 7H 2 O (dibasic heptahydrate), 80 גרם NaCl, ו -2 גרם KCl עם 10 L DiH 2 O; להתסיס עד שהיא נמסה; כדי להתאים את pH 7.4; סינון סטרילי </td></tr></tbody></table> טבלה 1: הפתרונות הנדרשים עבור רקמות Decellularization. הפוך את הפתרונות הנ&quot;ל לתהליך decellularization. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. כ 2.5 L יהיה צורך ריאות חזיריות אחד. 1. גיבוש הידרוג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשר חזירים ריאות Decellularization (עיבוד אזכור 9,10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג, ריאה חזירית נורמלית כמקשה אחת, מביית מטבחיים, עם לב vasculature ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי רקמות או אזמל כדי לנתח משם בלב, חיתוך כלי דם קרוב ככל האפשר אל הלב, כלי דם נותרים ישמשו בצעדים מאוחר יותר עבור זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את הרקמה החיבורית סביב קנה הנשימה, הסמפונות, כלי הדם באמצעות אזמל או מספריים. הערה: בדוק הריאה הטובה ביותר להשתמש למשך שארית של ההליך על ידי בחירת ריאות ללא חתכים גדולים או דקירות דרך הצדר וכמויות גדולות של תמט הריאות או חסימה בכלי הדם שעלולות לעכב את האפקטיביות של תהליך decellularization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הריאות לא הטובות עוזב הסמפונות כפי מאוד קשור אליו קנה הנשימה ככל האפשר (לב, רקמת חיבור ואת האונות של הריאה הוסרה עלול להיות מסולק). לא צריך להיות ריאה אחת נותרים מצורפות קנה נשימת כלי הדם. הערה: שמור חלקים עבור היסטולוגיה אם תרצה בכך. 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור הסמפונות מנותקים עם מהדק או תפר pbackflow העודף יימנע. </li></ol><ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות decellularization ושומרים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס עד הצורך (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות משאבת יד cannulated כדי להתאים את עורק הריאה, perfuse רקמת הריאה 3 פעמים עם מים די דרך הן עורק קנה נשימה ריאתי. Perfuse כלי הדם ראשון בכל פעם. בגין עם כ 1 ליטר לתוך כלי הדם ו -1.5 L לתוך קנה הנשימה עבור כל זלוף, אבל כמו פסולת הסלולר מוסר יותר נוזלי ניתן perfused דרך המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול רקמת הריאה ב Triton X-100 הפתרון למשך 24 שעות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון deoxycholate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את קטעי רקמה ב deoxycholate למשך 24 שעות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול רקמות בתמיסה מסוננת NaCl עבור שעה 1 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול רקמות בתמיסה DNase מסונן עבור שעה 1 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה 5 פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משם לנתח רקמות סחוס מורגשות, קנה נשימה וכל tubules 2 מ&quot;מ או גדול בקוטר (נמצא בעיקר סביב hilum מנות המדיאלי של הריאות) מעריכת דרך נשימה, עוזבת אזורי נשימה בלבד (בפריפריה בעיקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח רקמה לתוך 1 סעיפי אינץ או קטנים יותר. כיווניות של הרקמה לא משנה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את רקמות נוזלי במקום עודף 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי. להקפיא את הרקמה ב -80 ° C. הערה: שמור חלקים עבור היסטולוגיה כדי להבטיח הסרה של תאים debri הסלולרהים, אם תרצה בכך. אנו משתמשים H &amp; E, α-galactosidase, PicoGreen, hydroxyproline, ninhydrin, כחול, SDS-PAGE alcian, ו ספקטרומטריית מסה לאפיין. 9 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מכסים משפופרות קפוא המכיל רקמת הריאה decellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר הסינון על פתיחת צינור ומאובטח עם גומייה. הערה: Tube ותכנים עדיין צריך להיות קפוא אחרת למקם -80 ° C עד קפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize הרקמה עד שכל הנוזלים העודפים נעלם, בעזרת מייבש להקפיא לפי ההוראות של היצרן. חנות ב -80 ° C עד מוכן הטחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התחילה להוסיף חנקן נוזלי כדי טחנה במקפיא כדי לקרר בידוד רכיבים פנימיים תנאי עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר בר טחנת מגנטים מצינור טחנה ולהוסיף רקמות כדי לכסות תחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף בר טחן ולהוסיף רקמות ארוזות בצורה רופפת. בר הטחנה עדיין צריך לנוע בחופשיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את צינור הטחנה ו- PLAce ב טחנה במקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו חנקן נוזלי כדי לקו מילוי מקסימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקפיא טחנת כל רקמות לאבקה בסדר (כ 5 דק &#39;, שיעור impaction של ~ 600 דקות -1), בתוך גליל פוליקרבונט עם impactor נירוסטה וכן אטמי סוף נירוסטה באמצעות טחנת במקפיא לפי ההוראות של היצרן. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרו-נקבובי היווצרות קריש (8 מ&quot;ג / מ&quot;ל) (מותאם מ אזכור 9,11) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (w / v) של אבקת decellularized ו -0.1% (w / v) של פפסין 0.01 M HCl, תחת תסיסה מתמדת (אמור להיות מסוגל לראות זרימה ברמה העליונה של נוזל), בטמפרטורת החדר, עבור 48 שעות. הערה: האבקה טעונה באופן סטטי, כך הוספת HCl לאחר האבקה מעניקה את ההזדמנות לשטוף את העודף מקירות הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העיכול של 48 שעות, במקום פתרון ריאגנטים על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות% 10 בקירור (v / v) 0.1 M NaOH, גידולד 11.11% (v / v) 10x PBS (להביא את הפתרון כולו 1x ריכוז), להביא את הפתרון חלבון מתעכל ל- pH הפיזיולוגי של 7.4. הערה: הפתרון כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. בצע קינטיקה gelation באמצעות rheometry 9 אם תרצה בכך. </li></ol></li></ol> 2. Cross-linking הידרוג כדי לשפר את חוזק מכני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות של 1%, 0.1%, ו 0.01% w / פתרון crosslinking נ genipin הוכנו על ידי המסת את הסכום הדרוש של אבקת genipin ב 10% DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון וורטקס כל 15 דקות במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון genipin לכסות הידרוג ECM (100 μL לכל גם צלחת 96-היטב) כי הורכבו בעבר חלק 1.3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו כל הידרוג&#39;ל ECM כדי crosslink למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את הידרוג ECM 3 פעמים עם PBS עד פתרון הכביסה כבר לא כחול. הידרוג crosslinked לאחר מכן ניתן יהיה מוכן אפיון נוסף ו- CEלימודי התרבות השני של השנה. </li></ol> 3. תרבית תאים עם Microporous ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי דו מימדי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בפתרון מ 1.3.3, להוסיף 20 μl של פתרון pregel היטב בכל צלחת תרבות 96-היטב שאינם מטופלים רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לילה במקרר ב 4 ° C כדי לאפשר חלבון ספיחה לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב pregel הפתרון ולשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10,000 תאים / 2 ס&quot;מ לבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדל תקשורת 100 μl לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש תרבית תאים ממדית 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרון מ 1.3.3, resuspend התאים pelleted לריכוז של 1,000,000 תאים / מ&quot;ל ​​של תמיסת pregel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לוותר 16 μl של השעיה pregel תאים לבאר כל צלחת 96-היטב, כדי ליצור ~ 500 מיקרומטר הידרוג&#39;ל עבה עבור תרבית תאים 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30דקות עבור הג&#39;ל על מנת ליצור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של התקשורת לראש הידרוג נוצר לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש תרבית תאי ממדים על ג&#39;לים קשיחות משתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרון מ 1.3.3, פיפטה 100 μl של פתרון pregel לבאר כל צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עבור הג&#39;ל על מנת ליצור. הערה: Cross-linking צעדים מחלק 2 ניתן להשתמש כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10,000 תאים / 2 ס&quot;מ לבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדל תקשורת 100 μl לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Three-Dimensional+Cell+Culture+Matrices%3A+State+of+the+Art%22">Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art</a>. 14, (2008).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaycock%2C+JW+%223D+Cell+Culture%22">3D Cell Culture</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Walker, J. M., Ed, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Epithelial+cell+culture+protocols%22">Epithelial cell culture protocols</a>. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+a+biological+scaffold+material%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function.</a> Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+evaluation+of+gardenia+extract%2C+geniposide+and+genipin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin.</a> J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).</li>
<li>Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+Material+Properties+of+Cardiac+Matrix+Hydrogels+to+Induce+Endothelial+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).</li>
<li>Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+bone+regeneration+using+porcine+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa.</a> J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).</li>
<li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res.+J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPouliot%2C+RA+%22J.Biomed.Mater.Res.A%22">J.Biomed.Mater.Res.A</a>. , (2016).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS One. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%3A+where+we+have+been+and+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomaterials: where we have been and where we are going.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).</li>
<li>Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+initiation+and+growth+of+tumor+cell+lines%2C+cancer+stem+cells+and+biopsy+material+in+mice+using+basement+membrane+matrix+protein+%28Cultrex+or+Matrigel%29+co-injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).</li>
<li>Zhang, W. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstruction+of+lung+alveolus-like+structure+in+collagen-matrigel%2Fmicrocapsules+scaffolds+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+Normal+and+Fibrotic+Human+Lung+Matrices+as+a+Culture+System+for+In+Vitro+Investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).</li>
<li>Matsuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+human+lung+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for human lung stem cells.</a> N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).</li>
<li>Zuo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63%2BKrt5%2B+distal+airway+stem+cells+are+essential+for+lung+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration.</a> Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).</li>
<li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li>
<li>Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

אחד ההיבטים של ביולוגיה הנפרדים הוא הארגון-העצמי של מולקולות לתוך מבנים היררכיים לבצע משימה ספציפית. 13 במעבדה, הרכבה עצמית תלויה בגורמים רבים כגון ריכוז מלח, pH, ומשך העיכול. כפי שניתן לראות, נוצר הידרוג&#39;ל מתארגנת מעצמה כאשר חלבונים solubilized לחזור לטמפרטורה פיזיולוגית. הידרוג נוצר מסוגל לקדם מצורף הסלולר ושגשוגם במבחנה. תגובה תאית לאותות biophysical מ ECM לא ניתן לחקור באמצעות פולימרים...

תרגום תוצאות במבחנה למרפאה הוא אחד הנושאים המאתגרים ביותר העומדים בפני חוקרים ביו-רפואיים. מחקר במבחנה על פלסטיק תרבית רקמות קל יותר, נוח יותר ושומר על כדאיות תאים גבוהה. 1 גישה זו היא נקודת התחלה סבירה, אך לתוצאות יש תרגום קליני מוגבל. יותר ויותר, מעבדות משלבות מבנים תלת מימדיים כדי להחליף את השיטות הדו-ממדיות המסורתיות. ביקורות זמינות עבור סביבות תלת מימדיות רבות, החל מפיגומים ביולוגיים ועד פיגומים פולימריים. 2.3
מסגרות ביולוגיות יכולות לחקות מאפיינים של סביבות in vivo מכיוון שהן מכילות רבים ממרכיבי החלבון והגליקוזאמינוגליקן של המטריצה המקורית ומספקות אתרי קשירה מוכרים לתאים להיצמד אליהם ולזהותם. חומרים שמקורם במטריצה חוץ-תאית (ECM) הוכחו כפיגומים מסוגלים להצמדת תאים והתפשטותם. 4 אתגר אחד המגביל את היישום של פלטפורמות הידרוג'ל ECM נובע מהתכונות המכניות החלשות מטבען לאחר הג'לציה. לרקמה ילידית יש לעתים קרובות תכונות מכניות גבוהות יותר מהידרוג'לים. חומרים צולבים שאינם רעילים יכולים להגביר את התכונות המכניות של הידרוג'לים כדי לחקות טוב יותר את סביבת הרקמות המקומיות. Genipin הוא צולב טבעי שאינו רעיל שמקורו בצמחי גרדניה עם יכולת להתאים מקרוב את התכונות המכניות של ECM עם שינויים בריכוז הג'יפין5,6. 
כמעט כל התאים בגוף מתקיימים ב-ECM שהם מייצרים או מתחזקים על פיו. התמקדות חדשה בחשיבות האוניברסלית של ECM בארגון, במצב ובתפקוד בכל איבר או מערכת הציתה את הייצור של פלטפורמות מבוססות מטריצה לחקירה חוץ גופית. תת-רירית המעי הדק של חזיר היא הפיגום הטבעי הנחקר ביותר, והוא שימש לחידוש גידים, רצועות, שרירי שלד4 ואפילו עצם7. מטריצות מאיברים אחרים ומינים תורמים הוכיחו גם פוטנציאל טוב להתחדשות רקמות. השימוש ברכיבי ECM זרים גורם לבעיות מינימליות באימונומודולציה. לאחר חיסול החומר התאי המארח, ה-ECM הנותר יהיה דומה בתכולת חומצות האמינו ובארגונו לכל מיני היונקים האחרים8. ישנו קו מחשבה הולך וגובר שהדרך הטובה ביותר לבחון אינטראקציות תאים-ECM במבחנה היא להשתמש בפיגומי ECM ספציפיים לאיברים. כל איבר מספק הרכב ייחודי של חלבונים ופרוטאוגליקנים ליצירת נישות תאיות. נישות מספקות פירוק מבני, פונקציונלי ואפילו אנזימטי של המטריצה החוץ-תאית התורמת לאיתות ביופיזי. כדי להשיג מיקרו-סביבה במבחנה הדומה ביותר למיקרו-סביבה in vivo, שימוש ב-ECM ספציפי לרקמה ימטב את הנישות התאיות למחקר. 
מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה להקמת פיגום הידרוג'ל ייחודי ל-ECM של הריאות. שיטה זו מספקת פלטפורמה למחקר במבחנה על אינטראקציות בין תאי ריאה ל-ECM.

<table><tbody><tr><td>טריטון X-100&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP151-100</td><td>השתמש במכסה אדים עם מגן עיניים וכפפות.</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6750-100 גרם</td><td>השתמש במכסה המנוע עם מגן עיניים וכפפות.</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M7506-500 גרם</td><td>ללא</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1016-500 גרם</td><td>ללא</td></tr><tr><td>DNase</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5025-150KU</td><td>ללא</td></tr><tr><td>HCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>258148-500 מ"ל</td><td>השתמש עם מגן עיניים וכפפות.</td></tr><tr><td>פפסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6887-5G</td><td>השתמש במכסה אדים עם מגן עיניים וכפפות.</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP359-500</td><td>לשימוש עם מגן עיניים וכפפות.</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako Chemicals</td><td>078-03021</td><td>השתמש במכסה אדים עם מגן עיניים וכפפות.</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>איכות ביולוגית</td><td>119-069-151</td><td>ללא</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-448</td><td>ללא</td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N / A</td></tr><tr><td>משאבת יד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10-239-1</td><td>N / A</td></tr><tr><td>בוגר</td><td>VitLab</td><td>445941</td><td></td></tr><tr><td>Cryomill</td><td>SPEX</td><td>6700</td><td>השתמש בכפפות קריוגלאב ועין הגנה.</td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>FTS FlexiDry</td><td></td><td>השתמש בכפפות.</td></tr><tr><td>ריאומטר</td><td>דיסקברי</td><td>HR-2</td><td>השתמש בכפפות ובהגנה על העיניים.</td></tr></tbody></table>

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3d

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

כאן אנו מציגים שיטה לקביעת הידרוג תרבות רכיב תאים מרובה עבור תרבית תאי ריאות במבחנה. החל רקמת ריאה בריאה כמקשה אחת מן חזירי, חולדה או עכבר, הרקמה perfused ו שקוע דטרגנטים כימיים הבאים כדי להסיר את פסולת הסלולר. השוואת היסטולוגית של הרקמה לפני ואחרי עיבוד מאשרת הסרה מעל 95% של מכתים galactosidase דנ&quot;א אלפא גדילים כפול מרמזת רוב פסולת הסלולר מוסר. לאחר decellularization, הרקמה lyophilized ואז cryomilled לאבקה. אבקת מטריקס מתעכלת במשך 48 שעות בתמיסת עיכול פפסין חומצי ולאחר מכן לנטרל כדי ליצור את פתרון pregel. Gelation של פתרון pregel יכול להיגרם על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש מייד הנטרול הבא או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות. ציפוי יכול להיווצר באמצעות הפתרון pregel על צלחת שאינם מטופלים עבור גמצורף ell. תאים יכולים להיות תלוי pregel לפני הרכבה עצמית כדי להשיג תרבות 3D, מצופה על פני השטח של ג&#39;ל נוצר שממנו התאים יכולים להעביר דרך הפיגום, או מצופים על הציפויים. שינויים אל המתווה שהוצג יכול להשפיע טמפרטורה gelation, כוח, או בגדלים מקטעי חלבון. מעבר היווצרות הידרוג&#39;ל, נוקשות הידרוג&#39;ל ניתן להעלות באמצעות genipin.

באמצעות שיטה זו, הפקנו הידרוג מן החזיר רגיל, חולדה, וריאות עכבר (איור 1). ריאות מעובד לספק מוערכת של 5 מ&quot;ג, 40 מ&quot;ג, ו -10 גרם של אבקת ECM בהתאמה. סקירה כללית של התהליך מוצג באיור 2. חזותי מפתח בתהליך כולל: מראה לבן של הריאות אחרי שטיפת deoxycholate; לאחר היווצרות pregel, הפתרון צריך להיות אטום הפתרון אמור להופיע הומוגנית במשך חודשים אם מאוחסן ב 4 ° C.. כללנו שולחן תקלות בסיסי שיעזרו לזהות מקורות השגיאה לא...

זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

המטרה הכללית של שיטה זו להכנת הידרוג'לים מותאמים אישית היא לחקור תאים ותנאי תרבית המשכחבים את המורכבות של המטריצה החוץ-תאית (ECM) של הריאה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הריאתי, כגון האופן שבו תאי ריאה מקיימים אינטראקציה עם ה-ECM בתנאים בריאים ובמצבים פתולוגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להתאים את הידרוג'לי ה-ECM של הריאה ליישום הספציפי שלך בתרבית דו-ממדית (2D) או תלת-ממדית (3D).בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו ייתקלו בקשיים בשל מורכבותן של טכניקות הדה-צלולריזציה (הסרת תאים), אשר לעיתים דורשות מספר אנשי צוות וירידה לפרטים כדי למקסם את כמות הרקמה החיונית. עבור פרוטוקול זה, הכינו ריאה של חזיר המוכנה לתהליך הדה-צלולריזציה. פרטים על הכנתה ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב.לאחר הכנת הריאה, השתמש במשאבה ידנית עם קנולה המתאימה לעורק הריאתי. ראשית, בצע פרפוזיה של כלית אחת של מים אל תוך מערכת כלי הדם, ולאחר מכן 1.5 ליטר אל תוך הקנה. חזור על פעולה זו שלוש פעמים, תוך הגדלת נפח המים המפורפוזים ככל ששרידי התאים מוסרים.בשלב הבא, בצעו פרפוזיה לרקמה עם Triton X-100, שוב באמצעות משאבת היד. לאחר מכן, השקיעו את הרקמה באמבט של תמיסת Triton X-100 בטמפרטורה של 4 °C למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, שטפו את כלי הדם ואת הקנה שלוש פעמים במים מזוקקים.לאחר השטיפות, השתמש במשאבה הידנית כ

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

טכניקות פשוטות מתוארים לייצור מהיר של microfabricated מערכות תרבות עצביים באמצעות מכשיר micromirror דיגיטלי ליתוגרפיה הקרנת דינמי מסכה על מצעים תרבות קבוע התא. אלה מערכות תרבות יכול להיות נציג נוסף של ארכיטקטורה ביולוגי טבעי, ואת הטכניקות המתוארות יכול להיות מותאם עבור יישומים רבים.

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

אנו מתארים ייצור של יריעות הידרוג'ל בתבנית מיקרו בתהליך פשוט, הניתן להרכבה ולתפעל בצורה עצמאית. באמצעות יריעות הידרוג'ל מודולריות אלה, ניתן ליצור מערכת תרבית תאים תלת מימדית פשוטה בקנה מידה מאקרו עם מיקרו-סביבה תאית מבוקרת.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

הדמיה תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) הוא כלי רב עוצמה עבור מחקרים בביולוגיה של התא בזמן אמת. הנה שיטת תאי הדמית סריג ב פיסיולוגי תלת ממדי (3D) microenvironments הידרוג'ל באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הקונבנציונלי מוצגת. מניתוח עבור בדיקות ratiometric סריג המניב יחסי ליניארי על פני טווח ההפעלה מתואר.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של microcryogels אלסטית macroporous תלת-ממד על-ידי שילוב מיקרו-מלאכותית עם טכנולוגיית cryogelation. בעת טעינת עם תאים, נוצרים 3D microtissues, אשר יכול להיות מוזרק בקלות בתוך vivo כדי להקל על הטיפול משובי או לצרפן מערכים להקרנה תפוקה גבוהה סמים ' במבחנה .

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

המודלים הנוכחיים של תרבות bilayer אינן מאפשרות לימודים פונקציונלי במבחנה המחקים ויוו microenvironments. שימוש בפוליאתילן גליקול שיטה תבניות תחמוצת אבץ, פרוטוקול זה מתאר את התפתחות קרום המרתף ביונים ודק במיוחד עם נוקשות tunable, נקבוביות, והרכב ביוכימי המחקה באופן הדוק ויוו מטריצה חוץ-תאית.

תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול

Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

פיתחנו מודל סרטן השד הטרוגנית המורכבת מונצחים הגידול פיברובלסט ותאי נעוץ bioink alginate/ג'לטין bioprintable. המודל recapitulates microenvironment הגידול ויוו ואסטמה ומקילה על היווצרות הגידול multicellular spheroids, מניבים תובנות מנגנוני נהיגה tumorigenesis.

Bioprintable Alginate/ג'לטין הידרוג 3D במבחנה דגם מערכות זירוז היווצרות ספרואיד תא

השיטה המוצגת כוללת מתיחה חד-אקסיאלית של הידרוג'לים רכים תלת-ממדיים המוטמעים בגומי סיליקון תוך מתן אפשרות למיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. אפיון של זני הידרוג'ל חיצוניים ופנימיים, כמו גם יישור סיבים מודגמים. המכשיר והפרוטוקול שפותחו יכולים להעריך את התגובה של תאים למשטרי זנים שונים.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה ניסיונית להערכת ההשפעות של רמזים מכניים וביוכימיים על תגובות כימותרפיות של תאי גליובלסטומה שמקורם בחולה בתרביות מטריצה-מימטיות תלת-ממדיות באמצעות התקן תאורת UV מותאם אישית המאפשר פוטו-קרוסלינקינג בתפוקה גבוהה של הידרוג'לים עם תכונות מכניות הניתנות לכוונון.

מערכי הידרוג'ל מאפשרים תפוקה מוגברת לסינון השפעות של רכיבי מטריצה וטיפולים במודלים תלת-ממדיים של גידולים

מאמר זה מתאר כיצד להדפיס ביו-ממד הידרוג'לים פוטו-ממדיים כדי לחקור התקשות מטריצה חוץ-תאית והפעלת פיברובלסטים.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית הידרוג'לים פוטו-ממדיים לחקר הפעלת פיברובלסטים

למד ליצור הידרוגלים ממטריקס ריאתי לתרבית תאים תלת-ממדית. שיטת דה-תאית של ריאות חזיר מייצרת סקפולדים הניתנים להתאמה אישית לחקר אינטראקציות תאים במחלות ריאה שונות.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

גלה סרטונים נוספים