הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

המטרה הכוללת של שיטה זו לייצור הידרוג'לים מותאמים אישית היא לחקור תאים ותנאי תרבית המשכפלים את המורכבות של המטריצה החוץ-תאית של הריאות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הריאות כגון כיצד תאי ריאה מתקשרים עם ECM בתנאים בריאים ופתולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שההידרוג'לים של ECM לריאות מותאמים ליישום שלך בתרבית דו-ממדית או תלת-ממדית.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל המורכבות של טכניקות הדסלולריזציה, לפעמים דורשות מספר אנשים ותשומת לב לפרטים כדי לייעל את כמות הרקמה הקיימת. עבור פרוטוקול זה, יש ריאה חזירית מוכנה לדה-סלולריזציה. פרטים על הכנתו ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט.

לאחר הכנת הריאה, השתמש במשאבה ידנית שעוברת קנולציה כך שתתאים לעורק הריאה. ראשית, יש להחדיר כליטר מים לתוך כלי הדם, ולאחר מכן 1.5 ליטר לקנה הנשימה. עשה זאת שלוש פעמים, והגדל את נפח המים המוזרמים עם הסרת הפסולת התאית.

לאחר מכן, יש להחדיר את הטישו עם Triton X-100, גם באמצעות המשאבה הידנית. לאחר מכן, טבלו את הרקמה באמבט של תמיסת Triton X-100 בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות יש לשטוף את כלי הדם וקנה הנשימה שלוש פעמים במים מזוקקים.

לאחר השטיפה, השתמש במשאבה הידנית כדי להחדיר את הטישו עם דאוקסיכולאט. ואז לטבול רקמה לתוך דאוקסיכולט למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. למחרת יש לשטוף את הטישו שלוש פעמים במים מזוקקים, כמו קודם.

לאחר השטיפות, השתמש במשאבה הידנית כדי להחדיר את הרקמה בנתרן כלורי מסונן. לאחר מכן טבלו את הרקמה בנתרן כלורי מסונן למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר האמבטיה, יש לחלחל את כלי הדם וקנה הנשימה שלוש פעמים במים מזוקקים לשטיפה.

לאחר השטיפה, יש לטפטף את הרקמה בתמיסת DNase, ולאחר מכן לטבול אותה בתמיסת DNase למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שעה, יש לחלחל את כלי הדם וקנה הנשימה חמש פעמים באמצעות PBS, לא מים. כעת, רק באמצעות רקמה לבנה אטומה, נתחו את כל הצינורות בקוטר של שני מילימטרים או יותר.

הם נמצאים בעיקר סביב החלקים ההילומיים והמדיאליים של הריאות. השאירו את אזורי הנשימה שלמים, שנמצאים בעיקר בפריפריה. לאחר הסרת הצינורות, נתחו את הרקמה לחלקים של סנטימטר אחד או פחות.

הכיוון של בלוקים אלה אינו חשוב. לאחר ניקוז גושי הרקמות, העבירו אותם לצינור חרוטי של 50 מיליליטר והקפיאו אותם בחום של 80 מעלות צלזיוס. ניתן להקצות כמה בלוקים להיסטולוגיה כדי לאשר את הסרת התאים והפסולת.

כדי לעבד את רקמת הריאה לאבקה נטולת תאים, החזר את הכיסוי על צינור הרקמה הקפוא בנייר פילטר, ואבטח אותו עם רצועה אלסטית. לאחר מכן, ליופיליזציה של הרקמה עד שכל עודפי הנוזלים נעלמים באמצעות מייבש הקפאה לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, אחסן את הרקמה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לטחון אותה.

כדי להכין את הטחנה, טען אותה תחילה בחנקן נוזלי, והשאיר מקום לצינור הטחנה. לאחר מכן, מצינור הטחנה, הסר את מוט הטחנה המגנטי וכסה את תחתית הצינור ברקמה. לאחר מכן, החלף את מוט הטחנה וארוז באופן רופף עוד רקמה כדי למלא את הצינור.

לאחר מכן, סגור את צינור הטחנה, הכניס אותו למקפיא/טחנה ומלא את הטחנה בחנקן נוזלי עד לקיבולת המקסימלית שלה. כעת, הפעל את הטחנה במשך כחמש דקות בקצב אימפקט של כ-600 לדקה. לאחר מכן, אחסנו את האבקה נטולת התאים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס, עד לצורך.

כדי להכין את החומר הטרום-ג'ל, הוסף אבקת רקמות מפורזת ופפסין לצינור חרוטי. לאחר מכן הוסף 0.01 חומצה הידרוכלורית מולרית לשפופרת, לריכוז סופי של 1% אבקת רקמה נטולת תאים, ו-0.01% פפסין. שמור תמיסה זו תחת ערבוב מתמיד בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות כדי לעכל את הרקמות.

לאחר 48 שעות, הניחו את התמיסה על קרח למשך חמש דקות. כעת התאם את ה-pH של התמיסה ל-7.4 באמצעות נתרן הידרוקסיד קר של 0.1 מולארי, ולאחר מכן הביא את ריכוז ה-PBS של התמיסה ל-1X על ידי הוספת 10X PBS. יש לנו ניסיון מסוים עם שינוי זמנים ורמת החומציות של הפרה-ג'ל.

יש גמישות מסוימת בטווח שניתן להשתמש בו, אך המאפיינים יכולים להשתנות באופן דרמטי אם ההליך משתנה בדרכים קלות. התמיסה אינה נחשבת לטרום-ג'ל וניתן להשתמש בה לציפוי צלחות לא מטופלות ליצירת הידרוג'לים ליצירת תאים עליהם, ליצירת הידרוג'לים ליצירת תאים, או שניתן לשנות אותה עוד יותר לפני יצירת הידרוג'לים כדי להגביר את קשיחות ההידרוג'לים. כדי לתרבית תאים על ציפוי ג'ל מיקרו-נקבובי דו מימדי, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת טרום ג'ל לבארות של צלחת תרבית רקמות לא מטופלת של 96 בארות.

לאחר מכן, מקררים את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כך שהחלבונים ייספגו בצלחת. למחרת, שאפו את תמיסת הג'ל ושטפו את הבארות עם PBS. לאחר מכן, הוסף 3, 200 תאים לכל באר והגדל את נפח המדיה בכל באר ל-100 מיקרוליטר.

לאחר מכן ניתן לדגור את הצלחות. לתרבית תאים תלת מימדית עם תאים בתוך הג'ל המיקרו-נקבובי, השעו מחדש את התאים המעניינים במיליון למיליליטר בתמיסת פרה-ג'ל. לאחר מכן, הוציאו במהירות 16 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר של צלחת של 96 בארות ליצירת תרבית תאים תלת מימדית בעובי של כ-500 מיקרון.

הג'ל ייווצר תוך 30 דקות לאחר הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר היווצרות הג'לים, הוסף מדיה לבארות עד לסימני 100 מיקרוליטר. לתרבית תאים תלת מימדית עם תאים על גבי הג'ל המיקרו-נקבובי, הוסף את 100 המיקרוליטר של תמיסת הקדם-ג'ל לבארות של צלחת 96 בארות לא מטופלת.

לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לג'לציה. לאחר היווצרות הג'לים, הוסיפו 3,200 תאים במדיה של 100 מיקרוליטר על גבי ההידרוג'לים והמשיכו לדגור על הצלחת. הידרוג'לים הופקו מריאות רגילות של חזירים, חולדות ועכברים בשיטה המתוארת.

בדיקות ריאולוגיות אישרו כי למעלה מ-90% מהג'ל מתרחש בדקות הראשונות לאחר שהגיעו ל-37 מעלות צלזיוס. ההידרוג'לים שנוצרו היו יציבים לתקופות ארוכות ב-PBS, אך החיבור וההתפשטות של התאים עשויים להשתנות עם הזמן. תמיסת הפרה-ג'ל נבדקה כקידוד לשיפור חיבור התאים.

החיבור וההתפשטות של תאי אנדותל וריד הטבור האנושי נמדדו באמצעות MTTSA. שיפורים נצפו על ידי ציפוי הבארות ב-ECM. בייצור ג'לים תלת מימדיים, הוספת ג'ניפין הגדילה את קישור ההידרוג'ל.

באמצעות טאטוא תדרים על ריאומטר, קשיחות ההידרוג'ל הייתה בקורלציה ישירה לריכוז הג'ניפין, כאשר הריכוז החציוני והרלוונטי ביותר היה 0.01%בבדיקת הג'לים הנוקשים יותר, התפשטות התאים נמדדה כגבוהה יותר על ידי MTTSA על הג'לים עם קישור צולב מוגבר. לאחר השליטה, ניתן לבצע דה-סלולריזציה תוך שמונה שעות במשך ארבעה ימים. ניתן להכין את תמיסת הפרה-ג'ל תוך שעה אחת במשך יומיים, וניתן לבצע את היווצרות הג'ל תוך שעתיים במשך יומיים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו AFM, כתמים מערביים, צביעה ואימונוהיסטוכימיה על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו מודול אלסטי, הרכב חלבון ותגובה תאית לחומר.