ניתוח מועיל אפקטים של תוספי תזונה על פונקציות מעיים אפיתל מכשול במהלך ניסיוני קוליטיס

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעות של חומרים מזינים משלימים במודל עכברי של קוליטיס הנגרמת על ידי נתרן דקסטרן סולפט. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אימונולוגיה של המעיים לגבי התפתחות המדע הקליני לאורך הכיוון של ניסוי מודל הקוליטיס. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא בעלות נמוכה, אינה דורשת ציוד מתוחכם ומספקת ניתוח ברור של המורפולוגיה של המעי הגס כולו.

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך מתח חמצוני במעי הגס כתוצאה מגיוס יתר של נויטרופילים. למתן תוספי תזונה על ידי גבאג', תחילה רסנו את העכבר באופן ידני על ידי הקשקוש, והניחו את הזנב בין האצבע השלישית לבסיס האגודל. לאחר מכן, החזיקו את העכבר במצב זקוף, הכניסו את מחט הגאווג' לצד שמאל של הפה של החיה ועקבו בזהירות אחר תקרת הפה כדי לאתר את הוושט.

אם לא נתקלים בהתנגדות, קדם את המחט לכיוון הקיבה. העבירו לאט את כל נפח התוסף, ולאחר מכן הסירו בזהירות את המזרק ומדדו את משקל הגוף של בעל החיים. הקצה ציון של אפס עד ארבע בהתאם לאחוז הירידה במשקל, ולאחר מכן אסוף דגימת צואה טרייה והשתמש באפליקטורים המסופקים כדי למרוח מריחה דקה של דגימה על שקופית מתוך ערכת בדיקת דם סמוי בצואה של גואיאק.

סגור את המכסה בחזית הערכה ופתח את החלון האחורי כדי למרוח שתי טיפות של תמיסת המפתח על החלק האחורי של מיקום הדגימה. קרא את התוצאות לאחר 30 שניות, והקצה ציון של אפס עד ארבע בהתאם לעוצמת האות. לאחר מכן התבונן בדגימת צואה טרייה שנייה כדי להעריך את עקביות הצואה, והקצה ציון של אפס עד ארבע לפי הצורך.

כדי לקבוע את חדירות האפיתל של המעי in vivo, הניחו חיה מורדמת במצב שכיבה ובצעו חתך בקו האמצע כדי לחשוף את המעיים. אתר את הצקום ובצע חתך קטן בקטע הפרוקסימלי של יורדי המעי הגס. לאחר מכן הכנס מחט הזנה בגודל 22 ואבטח את המחט עם קשירה של חוט משי משותף.

יש לשטוף בזהירות נפח שופע של PBS דרך המחט כדי לשטוף את כל הצואה מהמעי הגס, ולאחר מכן התקנת תמיסה כחולה של אוונס עד שהצבע מגיע לפי הטבעת. לאחר 15 דקות, יש לשטוף את הצינור בנפח עודף של PBS עד שהשטיפה הפריאנאלית נקייה. לאחר מכן יש לכרות את המעי הגס ולשטוף את הרקמה עם PBS נוסף, ולאחר מכן מיליליטר אחד של שישה מילי-מולארי N-אצטילציסטאין כדי לחסל כל צבע שנדבק לריר המעי הגס.

כעת חתכו את המעי הגס לאורך ושטפו את הרקמה פעם נוספת עם PBS ו-N-אצטילציסטאין, ואז רשמו את המשקל והאורך של המעי הגס והניחו את הרקמה לשני מיליליטר של N, N-dimethylformamide בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה כדי לחלץ את הצבע שנותר, ומדדו את ריכוזי הצבע באופן ספקטרופוטומטרי ב-610 ננומטר למחרת בבוקר. לאחר שבעה ימים של נתרן דקסטרן סולפט, או קוליטיס הנגרמת על ידי DSS, נתחו את כל המעי הגס ורשמו את אורכו. עבור לחמניות שוויצריות, פתח את המעי הגס לאורך, הסר בזהירות כל חומר צואה, והשתמש במקל עץ דק ועגול או במלקחיים דקים כדי לגלגל את הרקמה כשהרירית פונה פנימה.

לאחר מכן הניחו בזהירות את הרקמה בתוך קלטת הטבעה, ואחריה קיבוע עם חמישה מיליליטר של פורמלדהיד 10% בטמפרטורת החדר. זה קריטי להפשיל את המעי הגס בחוזקה מבלי להתקפל כדי למנוע בעיות במהלך חתך הרקמה, מה שעלול לגרום לנזק קליני לרקמות ולפרשנות שגויה כנזק הקשור לקוליטיס. לאחר 48 שעות, שטפו את הדגימה במי ברז למשך 18 שעות, ולאחר מכן התייבשות על ידי סדרת אתנול.

לאחר טבילת האתנול המוחלטת האחרונה, טפל ברקמה בארבע דגירות של שעה בקסילן. לאחר טבילת הקסילן האחרונה, הניחו את הדגימה ב-50 מיליליטר פרפין נוזלי למשך דגירה אחת של 17 שעות ואחת של שלוש שעות. בתום הדגירה של שלוש שעות, טבלו את הדגימה בתבנית פלסטיק רבועה של 22 מילימטר מעוקב בשמונה עד 10 מיליליטר פרפין נוזלי טרי למשך 24 שעות.

כאשר הפרפין התמצק, השתמש במיקרוטום כדי לרכוש קטעי רקמה בעובי של חמישה מיקרון, ולאחר מכן טבל לזמן קצר את החתכים באמבט מים של ליטר אחד המכיל 0.3% ג'לטין והרכיב מיד את הדגימות על שקופיות זכוכית שטופלו בפוליליזין לצביעה של H&E. לניתוח מתח חמצוני, תחילה צור מחסום סביב הרקמה באמצעות עט הידרופובי. לאחר מכן, דגרו שמונה חתכי קריו של רקמות מיקרון בחמישה DHE מיקרו-מולרי מומס במים למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בחושך.

לאחר הדגירה שלוש שטיפות של 15 דקות ב-PBS עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. יבש את הדגימות באוויר והוסף טיפה של אמצעי הרכבה כדי להגן על הקרינה. לאחר מכן התבונן בפלואורסצנטיות האתידיום המחומצן במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר בהגדלה של פי 40.

טיפול DSS מוביל לעלייה מתמדת במדד פעילות המחלה כצפוי, ומגיע לציון מקסימלי ביום השביעי לאחר הזירוז. תוספי תזונה אנטי דלקתיים מעכבים את ההופעה המוקדמת של קוליטיס, בעוד שההשפעות המגנות הן שוליות בלבד בנקודות זמן מאוחרות יותר. התערבות תזונתית עשויה גם למנוע עלייה בחדירות האפיתל של המעי כתוצאה מ-DSS, כמו גם קיצור אורך המעי הגס.

צביעת המטוקסילין ואאוזין של רקמות המעי הגס הדיסטליות המוטבעות בפרפין מגלה כי דגימות ביקורת מדגימות מורפולוגיה תקינה, בעוד שבעלי חיים שטופלו ב-DSS מציגים את הסימנים האופייניים לקוליטיס. יש לציין כי טיפול מקביל בתוספי תזונה מקל בבירור על שינויים מורפולוגיים הנגרמים על ידי קוליטיס עם מורפולוגיה כללית דומה לזו של קבוצת הביקורת. צביעה אימונופלואורסצנטית של רקמת המעי הגס הדיסטלית מצביעה גם על כך שמולקולות הצומת ההדוקות מופנמות במהלך קוליטיס הנגרמת על ידי DSS וכי לוקליזציה משותפת של חלבונים אלה אובדת בחלקה במגעי תאי אפיתל קריפטה.

חשוב לציין, הפנמה זו מצטמצמת כאשר עכברים שטופלו ב-DSS מקבלים את תוסף התזונה האנטי דלקתי והאנטי חמצוני. יתר על כן, גיוס נויטרופילים חזק למעי הגס בתגובה לקוליטיס הנגרמת על ידי DSS מנוטרל על ידי תוספי תזונה, וכתוצאה מכך שיפור במקביל של עקה חמצונית הנגרמת על ידי נויטרופילים והפחתה קלה בייצור ציטוקינים דלקתיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מדידות תא נוטף כדי לנתח את ההתנגדות החשמלית של מחסום האפיתל במעי הגס.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הקוליטיס וחקר המנגנון המולקולרי של פתוגנזה של קוליטיס כיבית במודל עכברי הניתן לשחזור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את התפתחות הקוליטיס ואת ההשפעות המועילות של תוספי תזונה על תפקודי מחסום האפיתל במעי. אל תשכח שעבודה עם בעלי חיים דורשת הקפדה על סטנדרטים אתיים גבוהים כדי למנוע סבל מיותר.