תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם
3 בינואר 2017
פרוטוקול זה מתאר את היישום של פירוק הידרוג'ל מונחה תמונה ומבוסס לייזר לייצור רשתות מיקרופלואידיות ביו-נוזליות הנגזרות מכלי דם המוטמעות בהידרוג'לים פולי (אתילן גליקול) דיאקרילט (PEGDA). מערכות מיקרופלואידיות ביומימטיות אלו עשויות להיות שימושיות עבור יישומי הנדסת רקמות, יצירת מודלים של מחלות מבחנה וייצור מכשירים מתקדמים "על שבב".
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזר דופק פמטו-שנייה כדי ליצור רשתות מיקרופלואידיות ביומימטיות שמקורן בכלי דם תלת מימדיים המוטמעות בהידרוג'לים של פוליאתילן גליקול דיאקרילט באמצעות פירוק מבוסס לייזר מונחה תמונה. יתרון משמעותי של טכניקה זו הוא היכולת ליצור רשתות מיקרופלואידיות ביומימטיות תלת מימדיות המסכמות במדויק את הצפיפות, הפיתול, טווח הגודל והארכיטקטורה הכוללת של כלי דם in vivo במבנים סינתטיים. גישת ייצור מיקרופלואידית זו תקדם את היכולת שלנו לייצר יותר in vivo כמו מבנים מהונדסי רקמות, מודלים של מחלות ביומימטיות וצפיפות גבוהה במיוחד במכשירי שבב.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהתקנה ויישום נכונים של תוכנת המיקרוסקופ אינם אינטואיטיביים, אלא חיוניים ביצירת הרשתות המיקרופלואידיות הרצויות. רבים משלבי ההכנה מכוסים בפרוטוקול הטקסט, כולל יצירת המסכות הווירטואליות, הגדרת המיקרוסקופ והעלאת המסכות הווירטואליות לתוכנת המיקרוסקופ. כדי לבצע פוטופולימר של ההידרוג'ל PEGDA, יש לחבר תחילה טבעת של דבק דו-צדדי לצלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר עם חור של 20 מילימטר שנחתך מהתחתית.
לאחר מכן, במכסה אדים, הוסף מיליליטר אחד של HBS עם TEOA לצינור צנטריפוגה ענברי מכוסה נייר כסף של שני מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של מלח דיסודיום Eosin Y מילי-מולארי אחד לשפופרת. כעת, הכניסו נפח קטן של NVP לכוס זכוכית באמצעות פיפטה מזכוכית.
מנפח זה, קחו 3.5 מיקרוליטר NVP והעבירו אותו לתערובת. לאחר מכן, הוסף 10 מיליגרם של 3.4 קילו-דלטון PEGDA לצינור שני מכוסה נייר כסף. לאחר מכן, הוסיפו 0.2 מיליליטר מהתערובת כדי ליצור תמיסת פרה-פולימר PEGDA במשקל של 5%.
כעת, מערבל את תמיסת הקדם-פולימר עד להמסה מלאה של ה-PEGDA. לאחר מכן, פיפטה 60 מיקרוליטר על תבנית PDMS מבלי להכניס בועות. כעת, מרכז כיסוי זכוכית אקרילטי-40 מילימטר מספר 1.5 מעל התמיסה במרווחי ה-PDMS.
לאחר מכן הנח את המכלול מתחת למקור אור לבן מכויל לספק 95 מילי-וואט. רפאו את הפולימר למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הזרימו מים מזוקקים בין התבנית לכיסוי כדי להפריד את ההידרוג'ל מה-PDMS ולשטוף את ההידרוג'ל.
לאחר מכן, יבש בזהירות את שולי הכיסוי מבלי לנדף מים מההידרוג'ל. כעת, הדביקו את הכיסוי לצלחת הפטרי המוכנה. קצת לחץ עוזר.
לאחר מכן, טבלו את ההידרוג'ל במים מזוקקים. הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי של סריקת הלייזר כמתואר בפרוטוקול הטקסט והתחל בתצורת הדמיית ההידרוג'ל. לאחר מכן, התאימו את צלחת ההידרוג'ל והפטרי לתוספת הבמה והניחו אותה על הבמה.
לאחר מכן, מלאו את צלחת הפטרי בלפחות חמישה מיליליטר מים מזוקקים והורידו את יעד הטבילה במים ממש מעל ההידרוג'ל מבלי ליצור איתו מגע. כעת, לחץ בשידור חי כדי להפעיל את קו לייזר הארגון. לאחר מכן, התמקדו בהידרוג'ל עד שניתן יהיה לראות את אות ה-Eosin Y בצד העליון של ההידרוג'ל.
כדי לעזור למצוא את ההידרוג'ל, נסה להגדיל באופן זמני את אחוז ההספק או את גודל החור סמן את מיקומי החלק העליון והתחתון של ההידרוג'ל, ושל תחתית הבאר. לאחר מכן השתמש בג'ויסטיק כדי לנוע לרוחב ולמצוא את שולי הבאר.
בחלון המיקוד, שחרר את מישור המיקוד למטה 150 מיקרון בתוך ההידרוג'ל באמצעות החץ למטה ליד תיבת המיקום Z. השלב הבא הוא קריטי. אפס את המיקום X ו-Y בחלון הבמה, ולאחר מכן מחק את כל המיקומים המסומנים האחרים וסמן רק את המיקום המאופס.
כעת, כדי להתחיל בתהליך יצירת ערוץ כניסה, צלם תחילה תמונה ולאחר מכן באמצעות כפתור המלבן בחלון האזורים מתאר את האזור שיהיה הכניסה לרשת כלי הדם. לאחר מכן עברו לתצורת היווצרות הערוצים. הפרטים מסופקים בפרוטוקול הטקסט.
ברגע ששם, בחלון מחסנית Z, לחץ על הכפתורים המרכזיים בהיסט העליון ומעלה כדי למרכז את ערימת Z במיקום הנוכחי. ואז תלוי כמה גדול הכניסה צריך להיות, הגדר את מספר הפרוסות במרווח של אחת. כעת, בדוק שהמהירות מוגדרת לשלוש ושאחוז ההספק מוגדר ל-100.
לאחר מכן המשך בשמירת התצורה ולחץ על כפתור התחל ניסוי. כדי לדמיין את ההידרוג'ל במהלך השפלה של הערוץ, הגדל את מאסטר הרווח בחלון הערוצים אם האזור בשדה הראייה שחור, או הקטן את מאסטר הרווח אם האזור לבן. לאחר הפירוק, ודא שהכניסה נוצרה על ידי חזרה לתצורת הדמיית ההידרוג'ל ולחיצה על חי.
ראשית, תחת חלון האזורים, טען כל קובץ ovl מערימת Z של מסכות וירטואליות ולחץ על כפתור החץ כדי לראות את ההחזר על ההשקעה בשדה הראייה. לאחר מכן, לחץ בשידור חי כדי לסרוק את תצורת הדמיית ההידרוג'ל והשתמש בג'ויסטיק או בחלון הבמה כדי למקם את ההידרוג'ל כך שהכניסה תתחבר למיקום הנכון בתוך רשת כלי הדם. לאחר מכן, שחרר את מישור המיקוד למיקום הראשון במאקרו המיקרוסקופ שנמצא נמוך ב-50 מיקרון ממיקום ה-Z הממורכז הקודם באמצעות גודל הצעד בחלון המיקוד ולחיצה על החץ למטה.
שוב, זה קריטי כעת לאפס מחדש את מיקומי X ו-Y, למחוק את כל המיקומים המסומנים האחרים ולסמן רק את המיקום הזה כנקודת האפס החדשה. הקפד לשמור תצורה חדשה זו. כעת, תחת תצורת היווצרות הערוצים, בחר רק את סדרת הזמן וחלונות ההלבנה.
לאחר מכן, פתח את המאקרו ובחר בכרטיסיית השמירה. בחר את המתכון שהוכן בעבר ולחץ על החל. הקפד לא ללחוץ על חנות, אחרת המתכון יוחלף.
לאחר אימות ההגדרות, שמור שוב את תצורת היווצרות הערוץ ולאחר מכן לחץ על עדכן במאקרו המיקרוסקופ. לחץ על לא כדי להחליף את רשימת המיקום הנוכחי ולאחר מכן לחץ על התחל במאקרו המיקרוסקופ כדי להתחיל במתכון. לאחר השלמת תהליך הפירוק, השתמש בתצורת הדמיית ההידרוג'ל בעוצמת לייזר נמוכה יותר כדי לאפשר צפייה בדקסטרן המסומן ב-FITC, שיש לו אות בהיר יותר מהאות המקורי של Eosin Y של ההידרוג'ל.
לפני הכנסת הדקסטרן המסומן בפלורסנט, נדפו מעט מים מהבאר בהידרוג'ל. לאחר מכן פיפטה פנימה 10 מיקרוליטר של דקסטרן מסונן עם תווית FITC. ההליך המתואר שימש להמרת נפח גדול של תמונות מיקרו-וסקולריות לסדרה של מסכות וירטואליות ליצירת רשת מיקרופלואידית מונחית תמונה.
הרשת המיקרופלואידית שהתקבלה הושוותה לכלי הדם in vivo ממנה היא נגזרה. פירוק ההידרוג'ל המבוסס על לייזר מונחה תמונה איפשר ייצור של רשתות מיקרופלואידיות ביומימטיות תלת מימדיות המסכמות את הגודל, הפיתול והארכיטקטורה המורכבת של כלי הדם in vivo. ראשי לחץ ומשאבות מזרקים שימשו שניהם ליזום זרימת נוזלים ברשתות מיקרופלואידיות משובצות אלה.
חרוזי דקסטרן 70 קילודלטון ו-10 מיקרון נצפו נעים משמאל לימין על ידי זרימה המושרה על ידי ראש לחץ. לחלופין, זרימה מונעת על ידי משאבת מזרק החלה על ידי פוטופולימריזציה של הידרוג'ל בתוך מכשיר מיקרופלואידית משני. באמצעות אותו פרוטוקול המתואר כאן, יושם פירוק מבוסס לייזר כדי לייצר רשת נגזרת כלי דם דו-ממדית בהידרוג'ל ביתי לזרימה מונעת משאבת מזרק ושפע של 65 קילו-דלטון דקסטרן.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר המצויד בלייזר דופק פמטו-שנייה כדי ליצור רשתות מיקרופלואידיות ביומימטיות באמצעות פירוק הידרוג'ל מבוסס לייזר מונחה תמונה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי יש להתאים ולבצע אופטימיזציה של פרמטרי הלייזר כולל העוצמה, אורך הגל ומהירות הסריקה על סמך פירוק ניסוח ההידרוג'ל
.תודה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפירוק הידרוג'ל מבוסס לייזר בהנחיית תמונה כדי ליצור רשתות מיקרופלואידיות ביו-מימטיות ממקור וסקולרי בתוך הידרוג'לים מסוג PEGDA. טכניקה זו שואפת לשפר הנדסת רקמות, מידול מחלות in vitro ופיתוח של התקני on-a-chip מתקדמים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביומטריאלים
- הנדסת רקמות
רקע
- רשתות מיקרופלואידיות יכולות לחקות את מערכת כלי הדם in vivo.
- הידרוג'לים מסוג PEGDA נמצאים בשימוש נפוץ בהנדסת רקמות.
- טכניקות מונחות-דימות משפרות את הדיוק של ייצור מיקרופלואידי.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית חיונית להדמיה של מבני הידרוג'ל.
מטרת המחקר
- ליצור רשתות מיקרופלואידיות ביו-מימטיות המשחזרות ארכיטקטורה וסקולרית.
- לקדם את הפיתוח של מבני רקמה מהונדסת.
- ליצור מודלים in vitro לחקר מחלות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיה קונפוקלית עם לייזר בפולסים של פמטושנייה לבדיקת דהגדרציה של הידרוג'ל.
- הכנת הידרוג'ל PEGDA ופוטו-פולימריזציה.
- הגדרת תוכנת המיקרוסקופ לצילום מדויק.
- יצירת רשתות כלי דם באמצעות דהגדרציה מבוקרת.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של רשתות מיקרופלואידיות תלת-ממדיות.
- שחזור מדויק של צפיפות ומבנה כלי דם.
- פוטנציאל מוכח ליישומים משופרים בהנדסת רקמות.
- הנחיה חזותית שיפרה את ההקמה ואת ביצוע הפרוטוקול.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה ליצירת מבנים ביומימטיים.
- טכניקות מונחות-דימות הן קריטיות להשגת התוצאות הרצויות.
- פרוטוקול זה יכול לסייע להישגים במידול מחלות ובמכשירים על שבב (on-chip).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ייצור של רשתות מיקרופלואידיות ביומימטיות המשכפלות ארכיטקטורה וסקולרית in vivo, ובכך תומכות במידול מדויק יותר in vitro של פרמקוקינטיקה של תרופות ומנגנוני מחלה. באמצעות שחזור הצפיפות, העקמומיות והארכיטקטורה הוסקולרית במבנים סינתטיים, הוא מקדם את הפיתוח של פלטפורמות human-on-a-chip לבדיקות פרה-קליניות. הגישה מונחית-תמונה המבוססת על לייזר מגבירה את הביטחון הניבוי בתיקוף מטרות וזיהוי מולקולות מובילות, על ידי אספקת סביבות פלואידיות רלוונטיות פיזיולוגית לסריקת תרכובות ומחקרים מכניסטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בסביבות דמויות-כלי דם המשחזרות המודינמיקה ותובלה של מסה in vivo.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מתן אפשרות לצפייה בהשפעות של תרכובות תחת תנאי זרימה רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך ניבוי: משפר את הביטחון במעורבות המטרה ובמודולציה של המסלול על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במערכות תרבית סטטיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק פלטפורמות מיקרופלואידיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור להערכה כמותית של חדירות תרכובות, דיפוזיה ותגובה תאית תחת זרימה מבוקרת.
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה ניתנת להרחבה של רשתות ממקור כלי דם עבור יישומים של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) בתהליכי גילוי תרופות.
- מוכנות הבדיקה: מקל על שימוש חוזר בפלטפורמה על פני מספר מסעות ניסויים באמצעות ייצור יציב, מונחה-תמונה, של ארכיטקטורות כלי דם תלת-ממדיות מורכבות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי יצירת מערכות מיקרופלואידיות רלוונטיות למחלה המדמות רשתות כלי דם אנושיות לצורך פרופיל פרימקו-קינטי ופארמקו-דינמי.
- התאמה לסממנים ביולוגיים: תומך בזיהוי ובתיקוף של סממנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות דימוי בזמן אמת של סממנים פלואורסצנטיים והובלת חרוצים תחת זרימה המונעת על ידי לחץ או משאבה.
- קידום מותאם סיכונים: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מכניסטית של טיפולים המכוונים לכלי דם במבני מיקרו-רקמה דמויי אנוש.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרה מוקדם, דרך זיהוי מוביל ועד להערכה פרה-קלינית, ובכך מספקת יכולת הניתנת לשימוש חוזר ליצירת סביבות דומות לכלי דם המשפרות את הרלוונטיות הפיזיולוגית לאורך השלבים השונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי אפשור תצפית בזמן אמת על תהליכים ביולוגיים בתוך רשתות כלי דם תלת-ממדיות תחת זרימה.
- סריקה: מספק מערכות מיקרופלואידיות מוכנות לבדיקה עם גיאומטריה סטנדרטית ודפוסי דגרדציה הניתנים לשחזור עבור סריקה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר קריאות כמותיות באמצעות מעקב אחר חרוזי דקסטראן פלואורסצנטיים להערכת דינמיקת זרימה, חדירות ותובעת תאית תחת תנאים מבוקרים.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני על ידי שכפול של ארכיטקטורת כלי הדם האנושית לשיפור החיזוי של התנהגות תרופות in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה לייצור מונחית-תמונה וניתנת להגדרה, הניתנת להתאמה למודלי כלי דם מגוונים ולתכנונים ניסיוניים שונים במגוון פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי באמצעות סביבות פלואידיות רלוונטיות פיזיולוגית המפחיתות תוצאות חיוביות שגויות בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות בקרת לייזר מונחית תמונה וייצור מבוסס מסכה וירטואלית.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים עבור מועמדים המכוונים לכלי דם, ובכך מפחית כישלונות בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים על התנהגות תרכובות במערכות מיקרופלואידיות דמויות אנוש.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית, בטיחות לייזר ופוטוכימיה של הידרוגלים לצורך הקמה וביצוע מוצלחים.
- תלוי במיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקת לייזר בעל יכולת פולסים של פמטושנייה ותוכנה תואמת לבקרה מבוססת מאקרו.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של יצירת מסכות וירטואליות ותצורת המיקרוסקופ לצורך ייצור רשתות הדיר.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול לניסוחים שונים של הידרוגלים או לתבניות כלי דם.
- מוגבל על ידי הצורך באופטימיזציה קפדנית של עוצמת הלייזר, אורך הגל ומהירות הסריקה, בהתאם להרכב ההידרוגלו והספיגים של סף הפירוק.
שאלות נפוצות בתחומי הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Preparation and Photopolymerization of a PEGDA Hydrogel
3:23
Preparing a Hydrogel for Microfluidic Network Formation via Laser-based Degradation
6:25
Generating and Visualizing the Microfluidic Network
8:40
Results: Comparing Fabricated Networks with Their In Vivo Counterparts and Initiating Fluid Flow
10:05
Conclusion
