Name: תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למד ליצור רשתות מיקרו-זרימה ביומימטיות תלת-ממדיות מPEGDA באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ולייזר פמטו-שנייה. שיטה זו משפרת הנדסת רקמות ומודלים של מחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר ג'ף קפלן ולמר מייקל מור במרכז ההדמיה הביולוגית של המכון לביוטכנולוגיה בדלאוור על תמיכתם במיקרוסקופיה קונפוקלית. הגישה לציוד מיקרוסקופיה נתמכה על ידי מענקי המכשור המשותף של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (S10 RR0272773 ו-S10 OD016361) ותוכנית המענקים הפדרלית למחקר ופיתוח של מדינת דלאוור (16A00471). מחקר זה נתמך על ידי מענקים מפרס הפיתוח המוסדי (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של ה-NIH (P20GM103446), האגודה האמריקאית לסרטן (14-251-07-IRG), קרן המחקר של אוניברסיטת דלאוור (14A00778), המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT) (RR140013), והספרייה הלאומית לרפואה של ה-NIH (4 R00 LM011390-02).

<ol><li>Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+rules+for+diffusive+drug+delivery+in+tumor+and+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).</li>
<li>Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+tissues+on+a+chip+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Biomimetic tissues on a chip for drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).</li>
<li>Jeon, J. S., Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).</li>
<li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).</li>
<li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2016).</li>
<li>Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Self-Assembled+Microvascular+Networks+with+Microfabricated+PEG-Based+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).</li>
<li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Biomimetic+Patterning+in+Hydrogels+to+Guide+Cellular+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization.</a> Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li>
<li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional%2C+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13 (8), 1489(2013).</li>
<li>Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Hydrogels+with+Immobilized+EphrinA1+for+Therapeutic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).</li>
<li>Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-demanded+release+of+VEGF+from+synthetic%2C+biointeractive+cell-ingrowth+matrices+for+vascularized+tissue+growth%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth.</a> FASEB J. , (2003).</li>
<li>He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+assembly+of+3D+perfusable+microfluidic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).</li>
<li>Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaotic+mixing+in+three-dimensional+microvascular+networks+fabricated+by+direct-write+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly.</a> Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).</li>
<li>Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omnidirectional+Printing+of+3D+Microvascular+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks.</a> Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).</li>
<li>Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Bioprinting+of+Vascularized%2C+Heterogeneous+Cell-Laden+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs.</a> Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).</li>
<li>Dawson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+laws+for+capillary+vessels+of+mammals+at+rest+and+in+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Long.+%5BBiol.%5D%22%5BJournal%5D)">Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise.</a> Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).</li>
<li>Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li>
<li>Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Photoablation+of+Guidance+Microchannels+into+Hydrogels+Directs+Cell+Growth+in+Three+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions.</a> Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).</li>
<li>Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).</li>
<li>Applegate, M. B., Coburn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-based+three-dimensional+multiscale+micropatterning+of+biocompatible+hydrogels+for+customized+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).</li>
<li>Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser-generated+microtracks+in+3D+collagen+lattices%3A+principles+of+MMP-dependent+and+-independent+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PB%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion.</a> PB. 8 (2), (2011).</li>
<li>Naik, P., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Blood-Brain+Barrier+Models%3A+Current+and+Perspective+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies.</a> J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).</li>
<li>Choe, Y., Mayerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+Preparation%2C+Imaging%2C+and+Analysis+Protocols+for+Knife-edge+Scanning+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy.</a> JoVE. (58), (2011).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+transmission+imaging+of+microvascular+networks+using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM.</a> Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).</li>
<li>Chung, J. R., Sung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+Exploration+of+Mouse+Brain+Microstructures+Using+the+Knife-Edge+Scanning+Microscope+Brain+Atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas.</a> Front. Neuroinform. 5, (2011).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).</li>
<li>Slater, J. H., Culver, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived%2C+Biomimetic+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li>
<li>Slater, J. H., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Multifaceted%2C+Micropatterned+Surfaces+and+Image-Guided+Patterning+Using+Laser+Scanning+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography.</a> Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).</li>
<li>DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+immobilization+of+RGDS+on+hydrogel+surfaces+to+direct+cell+alignment+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration.</a> J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).</li>
<li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically-tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+Hydrogels+for+Dynamic+Tuning+of+Physical+and+Chemical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+two-photon+photodegradation+of+PEG+hydrogels+to+study+and+manipulate+subcellular+interactions+on+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials.</a> Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הקריטיים דריסה של הפונקציות הסטנדרטיות של תוכנת מיקרוסקופ כדי לאפשר את השימוש במסכות וירטואליות עבור מונחי תמונה, שפלה מבוססת ליזר, המאקרו מיקרוסקופ חייב להיות התקנת מניפולציות בזהירות. כיצד ממשקי התוכנה מיקרוסקופ עם המאקרו מיקרוסקופ יכולים לפעמים להיות מנוגדים, ומאמצים רבים הושקעו בקביעת ההגדרות האופטימליות בשתי התוכניות לפתח שיטה זו. הבנה כללית של שימוש במיקרוסקופ confocal ליזר סריקה בסיסית מומלצת, במיוחד עם &quot;הבמה&quot; ו- &quot;הפוקוס&quot; חלונות למציאה ונכונה מיצוב הידרוג&#39;ל ב x, y, z וממדים, לפני שתנסה שפלה מבוססת ליזר. בנוסף, הייצור של ערוץ כניסה הוא קריטי הפרוטוקול; מיני פלורסנט מושעים חייבים להיות מסוגלים להיכנס מערכות microfluidic עבור הדמיה מוצלחת ואפיון רשת. חשוב לציין כי פרוטוקול זה חל על ספציפי laser-מיקרוסקופ סורק confocal מוגדר עם לייזר פעמו femtosecond ספציפיים, שבהם פועלות גירסאות ספציפיות של תוכנה מיקרוסקופ ואת המאקרו מיקרוסקופ (ראה פירוט רשימה של חומרים / ציוד ספציפי). גילינו כי גרסאות חדשות יותר של מאקרו מיקרוסקופ חסרים מלאה פונקציונליות הנדרשים לשליטה מונחה לייזר התמונה. בעוד פלטפורמות מיקרוסקופ אחרות ומקורות ליזר פעמו יכולים לשמש, פרוטוקול זה מתייחס באופן ספציפי במערכת זו ויהיה צורך לבצע שינוי על פי הפלטפורמה, מקור ליזר, ותוכנה מיושמת. העקרונות שבבסיס בכל פרוטוקול זה עדיין חלים, עם זאת. שינוי פוטנציאל לפרוטוקול זה כרוך בשינוי הרכב הידרוג&#39;ל. הנה, השתמשנו 5% wt, 3.4 הידרוג kDa PEGDA, אבל שפלה מבוססת ליזר (למטרות מלבד דור רשת microfluidic) יושם כדי לבזות הוא הידרוג סינטטיים וטבעיים, כולל הפיברין PEGylatedעוגן 21,22, חלבון משי הידרוג 23, ו -24 קולגן. התאמת כוח לייזר, מהירות סריקה, המרווח בין-פרוסות Z, ומספר חזרות יסייעו בקביעת הפרמטרים האופטימלי לפברק רשתות microfluidic בניסוחים הידרוג&#39;ל אחרים. מגבלה נוכחית אחת של הטכניקה היא ההיקף הכולל של הידרוג&#39;ל שיכול להיות מושפל בסכום ריאלי של זמן. כדי ליצור חללים פתוחים או תכונות microfluidic בתוך הידרוג&#39;ל, הלייזר להתעכב זמן חייב להיות בבית או מעל 8.96 מיקרו-שניות / פיקסל (או ומהירות סריקה לייזר של 0.021 מיקרומטר / מיקרו-שניות) בעת שימוש השטף לייזר של 37.7 NJ / מיקרומטר 2. עם הגדרות אלה, זה לוקח 1.4 שעות כדי לבזות כלי בתוך נפח 0.014 מ&quot;מ 3 (כפי שניתן לראות באיור 1). שימוש להתעכב זמן לייזר של 4.48 מיקרו-שניות / פיקסל או מתחת, האנרגיה מועברת לא מספיק השפלה מלא של ניסוח הידרוג&#39;ל משמש כאן. הטמעת הידרוג&#39;ל שונהרכב יכול להתגבר על מגבלה זו. שימוש ג&#39;לים photolabile המכיל רכיבים רגישים לאור 34-36 או הידרוג&#39;ל שיש חתכי multiphoton הגדול 21-24 הם אפשרויות טובות שתאפשרנה את השימוש באנרגיה פחות ו תבאנה שפלה מהר. לעניין מגבלות ממדים, תכונות כבר מפוברקות עד 1.5 מ&quot;מ עמוק בתוך הידרוג&#39;ל 7. השגת העומק היא פונקציה של מרחק העבודה של אובייקטיבית ניתן להגדיל באמצעות מטרות מרחק עבודת אולטרה ארוכות אופטימיזציה עבור הדמית vivo. ערוץ הנמדד הקטן 7 שנוצר באמצעות מטרת טבילה במי 20X (NA1.0) הייתה ברוחב של 3.3 מיקרומטר ועומק של 8.9 מיקרומטר, אשר הוא שוה עם הגודל של הערוצים הקטנים שנוצרו באיור 1. בעוד מעבדות אחרות השתמשו מטרות NA נמוכות 21,23,24, אנו צופים כי רשתות microfluidic עם תכונות קטנות יכולות להיות שנוצרו באמצעות גבוהאה NA מטרות על חשבון מרחק עבודה מופחת. אולם בסופו של דבר, ההחלטה של ​​הטכניקה היא פונקציה של הפונקציה להפיץ את הצבע של קרן לייזר ממוקדת, המאפיינים סריקת לייזר, כמות האנרגיה המועברת על ידי לייזר, ואת המאפיינים לייזר הקליטה של ​​החומר להיות מושפל. יתר על כן, תכונות ליזר (מהירות, השטף, המרווח בין מסכות וירטואליות, ומספר החזרות) חייב להיות מותאמים המבוסס על מאפייני הידרוג&#39;ל (צפיפות crosslink, macromer / משקל מולקולרי מונומר, אחוזים במשקל, וסוג הידרוג&#39;ל: חלבון מבוסס לעומת סינתטיים ), כמו אלו ישנו מטבעו אינטראקציות עם הליזר וכך ההחלטה הסופית של התהליך. כמו האנרגיה מועברת מושפע גם על ידי המטרה בשימוש, אופטימיזציה נוספת נדרשת בעת מעבר בין היעדים. עם כל הכבוד העלויות הכרוכות, גישה מיקרוסקופ עם לייזר פעמו נדרש, ובעוד objec רבים ושוניםעזרי למידה ניתן להשתמש, אלה עם NA גבוהה מרחק עבודה ארוך (הדמית in vivo) יכולים להיות יקרים. מעל ומעבר הפרוטוקול המפורט כאן, רשתות microfluidic שנוצרו באמצעות טכניקה זו יכולה להיות פונקציונליות גם עם ייצור שלאחר ערוץ פפטידים-דבק תא כדי לגרום הדבקת תא האנדותל ו לומן היווצרות 7. בנוסף, השילוב של רצפי פפטיד מתכלה תא עיקר החומר 9 לפני לתעל שפלה עלול לאפשר לחקר נדידת תאים לתוך ודרך הידרוג&#39;ל. לקבלת הרחפה רציפה של רשת microfluidic בתוך הידרוג&#39;ל, הידרוג ניתן photopolymerized בהתקנים fluidic גדול או מעטה, כפי שמודגם איורים 2 ו 3 7. הדור של רשתות כלי דם באמצעות הרכבה עצמית vasculogenic או angiogenic 8-12 מספק גישה פשוטה לגרום vascularization ברחבי נפח הידרוג&#39;ל גדול יחסית. גישה זו אמנם גורמת רשתות fluidic perfusable, קשה לשלוט על גודל ישירות, tortuosity, צפיפות, ואדריכלות ברשת הכוללת. בשל מגבלה זו, פרופיל הזרימה ושיעורי גזירה בכלי הדם עשוי להיות שונים בין ניסויים. לחלופין, טכניקות microfabrication 13-16 לאפשר שליטה ישירה על ארכיטקטורת רשת אבל הם מוגבלים לעתים קרובות על ידי חוסר היכולת שלהם ליצור קטנים, ערוצים בגודל נימים או הייצור של רשתות צפופות המחקות באדריכלות וסקולרית vivo. בעוד טכניקת השפלה הידרוג&#39;ל מבוססי לייזר המפורטים כאן כבר לשנות את ייעודו החדש לייצור microfluidic, הוא מתגבר בו זמנית הן את השליטה אדריכלי ומגבלות מבוססי גודל של שיטות microfabrication הקיימים על ידי המאפשר יצירת רשתות microfluidic biomimetic 3D כי לשחזר את הצפיפות, tortuosity, גודל טווח, ועל אדריכלות הכוללתדואר של כלי דם בגוף חי. יתר על כן, רשתות fluidic מרובים יכול להיווצר הידרוג יחיד, המאפשר חקר התחבורה הבין-רשת 7. עבור יישומי הנדסת רקמות כי שואף יותר מקרוב לשכפל בתהליכי ההובלה vivo במבחנה, רשתות microfluidic-מוטבע הידרוג&#39;ל נפתרו מאוד המפורטות כאן הן גם מתאימות. אנו צופים כי פרוטוקול זה יהיה מועיל בפיתוח בונה רקמות שיותר במדויק לחקות in vivo תחבורה לצריכה כמכשירי הקרנה בסמים במודלי מחלה במבחנה.

מערכת כלי הדם, מורכבת משני לימפטי cardiovasculature, הצורות ביותר רשתות צפופות חיוניות להובלת חומרי מזון וחמצן ולמען הסרת פסולת המטבולית. בהתאם לכך, תאים השוכנים ברקמות vascularized הם אף פעם לא יותר מ 50-100 מיקרומטר הרחק מספינת 1. היכולת לשחזר באדריכלות וסקולרית vivo במבחנה היא קריטית מודל מדויק vivo בתהליכי הובלה באמצעות מבנים מהונדסים. עם כונן אחרון לפתח איבר על שבב התקנים 2 עבור תפוקה גבוהה סמי הקרנת 3,4 ומחלות דוגמנות 5,6, שיטות ליצור רשתות microfluidic כי לשחזר in vivo-כמו תחבורת ב הידרוג הסינטטי או טבעי ציור עניין משמעותי. כדי לשפר את ביומימטיקה microtissues של בשימוש במכשירים אלו, פיתחנו שיטה השפלה הידרוג&#39;ל דימוי מודרך, מבוססי לייזר אשר מנצל שלוש dimensional (3D) תמונת ערימות של כלי דם יליד כתבניות כדי ליצור רשתות microfluidic נגזרת וסקולרית המוטבעת PEGDA הידרוג 7. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ ליזר confocal סריקה זמין מסחרי מצויד ליזר פעמיו femtosecond לפברק נגזר-וסקולרית, רשתות microfluidic biomimetic ב הידרוג PEGDA באמצעות מונחי מערכות הדמיה, שפלה מבוססת ליזר. גישות שוטפות fluidize הידרוג כוללות אינדוקציה של vasculogenic 8-10 או טכניקות 10-12 האנדותל תא עצמי הרכבת microfabrication angiogenic ליצור ערוצים מוגדרים מראש עבור endothelialization 13-16. בעוד רשתות עצמיות התאסף לשחזר את הצפיפות ואדריכלות מורכבת של microvasculature, הם לעתים קרובות יותר חדירים מאשר רשתות vivo ב 11,17,18 אשר עשוי להיות בעייתיים בתחבורת דוגמנות עבור יישומי הקרנה בסמים. רשתות עצמית התאספו מורכב physiologically רלוונטי, כלים בגודל נימים, אבל הם יכולים להיות קשים לשלב עם זרימת נוזל בתפזורת בשל מגבלות ביצירת כלי עורקיק בגודל גדול יותר. מאחר ואין שליטה ישירה על ההרכבה של רשתות אלה, הארכיטקטורה הסופית יכולה להשתנות ממדגם לדגום, מה שהופך אותו קשה לייצר רשתות שוב ושוב עם תכונות זרימה ותחבורה אותו הנוזל. כדי ליצור 3D, רשתות microfluidic-מוטבע הידרוג&#39;ל עם גיאומטרית דיר ואדריכלות מוגדרת היטב, מספר טכניקות microfabrication פותחו, כולל הרכבת מודולרי 13, הדפסת 3D של חומרי הקרבה 16, הרכבה ישירה לכתוב 14, מכל עברי הדפסה 15. יישום שיטות אלו, אדריכלות microfluidic, ולכן תכונות נוזלי זרימה ותחבורה, יכול להיות מפוברק שוב ושוב על פני מבנים רבים. המגבלה העיקרית של גישות אלה, עם זאת, היא חוסר היכולת ליצור microfרשתות luidic עם תכונות נימים בגודל, 4 עד 10 מיקרומטר 19. רוב טכניקות microfabrication מוגבלות לעתים קרובות תכונות החל 150 עד 650 מיקרומטר בקוטר 13,16. כמה טכניקות קיימות מסוגלות לייצר רשתות היררכיות עם ערוצי פני מגוון בקוטר רחב, 10 עד 300 מיקרומטר להרכבה ישיר לכתוב 14, ו -18 כדי 600 מיקרומטר להדפסת omnidirectional 15, אך הם מוגבל ביכולת שלהם לייצר רשתות צפופות או לייצר רשתות microfluidic מרובות בסמיכות בתוך אחת לבנות 7. כדי להתגבר על כמה מגבלות אלה, פיתחנו טכניקה השפלה הידרוג&#39;ל דימוי מודרך, מבוססי לייזר המאפשר ייצור הדיר של biomimetic, רשתות microfluidic היררכית כי לשחזר את הארכיטקטורה של microvasculature in vivo. כדי לעשות זאת, 790 ננומטר, 140 femtosecond (FS) לייזר פעמו ההפעלה ב 80 MHz הוא i רסטר-סרקn הרצויה במקומות 3D בתוך הידרוג&#39;ל, כפי שהוגדר על ידי תמונות של כלי הדם בגוף החי. אנו משערים כי התהליך השפל פועל באמצעות ההתפלגות האופטית-induced הליזר של מים, היווצרות הפלזמה כתוצאה, הרחבת thermoelastic המהירה הבאה של מים, והפגיעה ברמה המקומית של הידרוג&#39;ל כמו המים מתרחבים 20. מנגנון זה שונה מעט מן השפלה מבוססת ליזר של הידרוג מבוסס חלבון 21-24. בניגוד PEGDA, אשר יש multiphoton חתך נמוך, חלבונים יש לעתים קרובות multiphoton גדול חתך ולכן מפורק באמצעות שבירה כימית multiphoton נגרמת קליטה 23. כדי ליצור רשתות microfluidic מונחי תמונה, תריס הליזר נשלט על ידי מסכות וירטואליות הנגזרת תמונה, אשר מורכבות מפסיפס של אזורים של עניין 9 המגדירים את ארכיטקטורת microfluidic. בגישה זו, אנו הדגמנו את היכולת לפברק microfluid biomimetic 3D נגזר וסקולריתרשתות ic, אשר לשחזר את הארכיטקטורה הצפופה ומפותלת של כלי דם in vivo, כדי מקומית לשלוט הנקבוביות של הידרוג על ידי שינוי כמות האנרגיה המועברת במהלך שפלה. יש לנו גם הצלחנו לייצר שתי רשתות microfluidic עצמאיות המשתלבות בסמיכות (15 מיקרומטר) אבל אף פעם לא להתחבר 7 ישירות. יש לנו גם הוכיח את יכולתו endothelialize microchannels לייזר מושפל דרך functionalization השפלה פוסט עם רצף הפפטיד ligating integrin, ארגינין-גליצין-אספרטית חומצה-סרין (rgds), כדי לקדם את הידבקות תא האנדותל ו לומן היווצרות 7. עם פרוטוקול זה, הדור של רשתות microfluidic מורכבים הידרוג PEGDA מתאפשר באמצעות מונחי תמונה, שפלה מבוססת ליזר באמצעות מיקרוסקופ זמין מסחרי נגיש בקמפוסים רבים. ככל שתהליך השפלה מונחה על ידי מסכות דיגיטליות, וירטואליות, Fabrica זהטכניקת tion היא נוחה עבור עיצוב יצירה של רשתות microfluidic, המאפשר את השימוש בו במגוון רחב של יישומים. אנו צופים כי השיטה המתוארת כאן תהיה כדאית ביותר בעיצוב מכשירים יצורים ואנושיים-על-שבב biomimetic יכולת שכפול תהליכים ביולוגיים חשובים תחבורה בתחבורת תרופת דוגמנות 2. טכניקת ייצור זו עשויה גם להיות עניין של דור מודלים במבחנה המחלה, כולל גרורות סרטן 5,6 ומודלים המחסום שבין הדם למוח 25. כפי שפלה הידרוג&#39;ל מבוסס ליזר כבר השתמשה בעבר כדי ליצור מסלולים עבור הדרכתו של תולדה עצבית 21-23, הארכת מונחי התמונה של טכניקה זו יכולה להיות שימושית אסטרטגיות הנדסת רקמות מתקדמות למצב תאי סידורי מרחביים 3D המוגדר על ידי משתמש.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>נקרא "תוכנת תכנות" בפרוטוקול; עיין במקור 9 לפרטים על האלגוריתם</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td><td>NIH</td><td>גרסה 1.51a</td><td>בשם "תוכנת עיבוד תמונה" בפרוטוקול</td></tr><tr><td>LSM 780 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>בשם "מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר" בפרוטוקול; עבור הידרוג'ל מבוסס לייזר השפלה</td></tr><tr><td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>גרסה 6.0</td><td>בשם "תוכנת מיקרוסקופ" בפרוטוקול; לשימוש ב-Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td><td>בשם "מיקרוסקופ מאקרו" בפרוטוקול; לשימוש ב-Zeiss LSM-780 (בשילוב עם Zen)</td></tr><tr><td>Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 מ"מ</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>לשימוש ב-Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II Modelocked Ti:S לייזר</td><td>קוהרנטי</td><td></td><td>בשם "לייזר פועם בעל עוצמה גבוהה" בפרוטוקול</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine (TEOA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>דליק; מגרה את העור והעיניים; לעבוד עם במכסה אדים</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 מ"ל כוסות סינון ואקום עם 0.2 ומיקרו; m PES ממברנה</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td>מסונתז בבית</td><td></td><td>מתייחס למקור 33 לשיטות סינתזה; אחסן תחת ארגון</td></tr><tr><td>Eosin Y מלח דיסודיום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>חנות מתחת לארגון; מסרטן; עבודה עם במכסה אדים</td></tr><tr><td>סרט מצופה כפול 3M, 9500PC, 6.0 מיל</td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td></td><td>גיבוי FLX000620 לטיפול בסרט מצופה כפול</td></tr><tr><td>דגם SC פלוטר (חותך דבק)</td> <td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>משמש לחיתוך דבק בצורות טבעת לחיבור כיסויים לצלחות פטרי</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ עם חור 20 מ"מ</td><td>MatTek Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>תאורה בעוצמה גבוהה (מקור אור לבן)</td> <td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td>מד כוח</td><td>ניופורט</td><td>1916-R</td><td>מזהה הספק ב-524 ננומטר בעת שימוש במקור אור לבן</td></tr><tr><td>גלאי שרביט פרופיל דק</td><td>ניופורט</td><td>918D-ST</td><td>לשימוש עם מד כוח</td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>המשמשת לייצור תבניות PDMS; עיין במקור 7 לשיטות</td></tr><tr><td>TMPSA פונקציונלי #1.5 Coverslips, 40 מ"מ עגול</td><td>מסונתז בבית</td><td></td><td>מתייחס למקור 7 לשיטות</td></tr><tr><td>Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td><td>יכול להשתמש ב-dextrans מתויג חלופי; 2,000 kDa אינו מתפזר בקלות למזרק הידרוג'ל 5% 3.4 kDa PEGDA</td></tr><tr><td>1 מ"ל, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק Acrodisc, 0.2 ומיקרו; m Supor Membrane, חלבון נמוך מחייב</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>דביק-שקופיות VI0.4&nbsp; </td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>מכשירים מיקרופלואידיים שניתן להשתמש בהם לאחסון הידרוג'לים</td></tr></tbody></table>

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות microfluidic הנגזרות דם

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

פרוטוקול מפורט זה מתאר את יישום מונחי תמונה, השפלה הידרוג&#39;ל מבוססי לייזר עבור ייצור של רשתות microfluidic הנגזרות וסקולרית מוטבע הידרוג PEGDA. כאן אנו מתארים יצירת מסכות וירטואליות המאפשרות שליטה מונחה ליזר תמונה; photopolymerization של הידרוג&#39;ל PEGDA micromolded, מתאים ייצור רשת microfluidic ואת זרימת לחץ מונחה ראש; ההתקנה והשימוש מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר זמינים מסחרית זיווג עם פעמו Ti femtosecond: לייזר S לגרום השפלה הידרוג&#39;ל; ואת ההדמיה של רשתות microfluidic מפוברקות באמצעות מיני פלורסנט מיקרוסקופיה confocal. חלק גדול מן הפרוטוקול מתמקד ההגדרה הנכונה והיישום של מאקרו תוכנת מיקרוסקופ מיקרוסקופ, כמו אלה הם צעדים מכריעים באמצעות מיקרוסקופ מסחרי למטרות ייצור microfluidic המכילים מספר המורכבויות. המרכיב מודרך הדימוי של techniqu זהדואר מאפשר ליישום ערימות תמונת 3D או מודלי 3D שנוצר על ידי משתמש, ובכך לאפשר לעיצוב microfluidic יצירתי עבור הייצור של מערכות microfluidic המורכבות של כמעט כל תצורה. עם השפעה צפויה בהנדסת רקמות, השיטות המתאימות בפרוטוקול זה יכול לסייע בייצור של מבני microtissue biomimetic מתקדמים עבור יצורים ו-אדם על-a-chip מכשירים. מאת מחק את האדריכלות, tortuosity המורכבת, גודל, וצפיפות in vivo כלי הדם, תהליכי הובלה ביולוגיים חיוניים יכולים להיות משוכפלים שני המושגים הללו, מה שמובילים דוגמנות במבחנה מדויקת יותר על הפרמקוקינטיקה סמים ומחלות.

כדי להדגים את יישום מונחי תמונה, שפלה הידרוג&#39;ל מבוסס ליזר כדי ליצור רשת microfluidic נגזרת וסקולרית 3D, השתמשנו ערימת תמונת 3D של כלי דם במוח עכבר אשר נרכשה באמצעות מיקרוסקופיית פיפיות סכין (KESM) 26, 27 . אזור 3D נבחר של בסיס נתוני כלי דם הגדול הוסב לסדרת מסכות וירטואליות ליצירת רשת microfluidic מונחי תמונה, כפי שתואר לעיל. לאחר ייצור, רשת microfluidic וכתוצאה מכך היה perfused עם תמיסה של FITC שכותרתו, 2,000 dextran kDa צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. מחסנית תמונה של כלי הדם in vivo, אשר הגדיר את ארכיטקטורת הרשת (איור 1 א ו- C) ואת רשת microfluidic מפוברק (איור 1B ו- D) שימשו להפקת-תחזיות Z (איור 1 א &#39;וב&#39;) ואת הדמיות 3D (איור 1 ג ו D </strong&gt;). השוואת התמונות מדגים שהנחו הדימוי, השפלה הידרוג&#39;ל מבוססי לייזר מאפשר ייצור של רשתות microfluidic biomimetic 3D כי לשחזר את הגודל, tortuosity, ואדריכלות מורכבת של כלי הדם בגוף החי. הטכניקה ניתנת ייצור של רשתות המכילות מגוון רחב של קטרים; בתוך איור 1, ערוצי החל 3.3 כדי 28.8 מיקרומטר קוטר נוצרו. ראוי לציין, כי מבנה מלבני הגדול בפינה השמאלית העליונה של האיור 1B ובפינה השמאלית של 1D האיור הוא ערוץ הכניסה להציג תזרים לתוך הרשת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> איור 1: כלי דם נגזר Microfluidic רשת. סדרת מסכות וירטואליות, הנגזרת ערימת תמונה של כלי דם במוח העכבר (A ו- C), שמשה Fabricate רשת microfluidic biomimetic 3D המוטבע הידרוג&#39;ל PEGDA (B ו- D) באמצעות מונחי תמונה, שפלה מבוססת ליזר. רשת microfluidic היה perfused עם 2,000 kDa FITC שכותרתו dextran צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. Z-תחזיות (A ו- B) ו הדמיות 3D (C ו- D) של שתי הרשתות להדגים את היכולת ליצור רשתות microfluidic כי לשחזר את הצפיפות, ארגון, ואדריכלות כוללת של כלי דם בגוף חי. החץ (D) מסמן את כניסת המלבני נוצרה כדי להציג את dextran. סרגל הסולם מייצג 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יישמנו שתי שיטות, ראשי לחץ משאבות מזרק, ליזום נוזל fנמוך ברשתות microfluidic המוטבעים אלה. לדוגמה, ערוץ מלבני 30 על ידי 30 מיקרומטר היה מפוברק להתחבר שתי בארות הידרוג PEGDA micromolded (איור 2 א), עם זרימת הנוזל מונע באמצעות לחץ לאספקת 7. שנוצר שמאל היטב, שרוולי המושרה זרימת דרך microchannel ולתוך גם מימין. באיור 2 א, חזית ראשונית של tetramethylrhodamine (TRITC) -labeled, 70 dextran kDa נצפה עובר דרך הערוץ באמצעות מיקרוסקופיה הזמן לשגות. מאוחר יותר, באיור 2B, כדור קלקר פלורסנט בקוטר 10 מיקרומטר זרמו מהאגף השמאלי היטב, דרך הערוץ, אל הבאר מימין. עם משך הזרימה המבוקר על ההיקף כולל של הווה נוזל micromolded גם על הכניסה, ואת בספיקה בשליטת השיפוע ההידרוסטטי שנוצר בין הכניסה ויציאה היטב, זרימת מונחת שרוולים ב הידרוג micromolded מספקת שיטה פשוטה להזרמהduction, ללא צורך דיור חיצוני או משאבת מזרק. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> איור 2: תזרים ראש-לחץ מונע בתוך הידרוג&#39;ל Micromolded PEGDA. PEGDA היה micromolded לגבש הידרוג&#39;ל המכיל שתי בארות המחוברים ביניהם באמצעות microchannel מוטבע. ראש הלחץ נוצר שמאל גם ליזום זרימת TRITC שכותרתו, 70 dextran kDa (A1-A3) ואת כדור קלקר 10 מיקרומטר (B1-B3) באמצעות 30 על ידי 30 מיקרומטר ערוץ מלבני מאחד היטב אַחֵר. סרגל הסולם מייצג 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לחלופין, כדי ליצור זרימת נוזל קבועה בתוך רשתות microfluidic, משאבת מונחת מזרק fיכול להיות יזם נמוך ידי photopolymerizing הידרוג הפנימי של המכשיר microfluidic משנית עם ויציאות יציאה עבור התממשקות משאבת מזרק. באיור 3 א, מכשיר microfluidic זמין מסחרי, מראש מפוברק מוצג עם להקת 1 מ&quot;מ של הידרוג&#39;ל photopolymerized לרוחב המכשיר 7. שפלת ליזר מבוסס יושמה לפברק ערוצים ורשתות microfluidic ב הידרוג שוכן באמצעות אותו הפרוטוקול המתואר כאן הידרוג בודד. זרימת משאבה שנוצרה מזרק ניתן לראות באיור 3 ב, שם ערוץ גלילי בקוטר 20 מיקרומטר היה מפוברק הידרוג&#39;ל שוכן מכשיר microfluidic. באפיק בקוטר 20 מיקרומטר זה, כדורי קלקר ניאון 2 מיקרומטר פרט נפתרים בקלות ללא זרימת נוזל (איור 3B1), ואילו כאשר s flowrate 5 μL / מוחל, הספירות לעבור דרך שדה הראייה, כפי שמעידים קווים מפוספסים (איור 3B2 &lt;/ Strong&gt;). אותה גישה זו שימשה לגרום זרימת באמצעות רשת 2D, נגזר-וסקולרית לפקח זרימת שכותרתו TRITC, 65 dextran kDa דרך הרשת דיפוזיה לתוך הידרוג&#39;ל שמסביב (איור 3 ג). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> איור 3: מזרק משאבה-Driven זרימה PEGDA הידרוג polymerized מעטה Microfluidic. זמין מסחרי, מכשיר microfluidic מראש מפוברק (א) עם 17 x 3.8 x 0.53 מ&quot;מ (x, y, z) microchannel בתים הידרוג&#39;ל photopolymerized 1 x 3.8 x 0.53 מ&quot;מ (x, y, z) PEGDA, שמסומן על ידי חץ שחור. ערוץ גלילי בקוטר 20 מיקרומטר היה מושפל דרך הידרוג&#39;ל, ותחומי פוליסטירן 2 מיקרומטר הוזרמו דרך המכשיר (B). התחומים נפתרים בבירור ללא זרימת נוזל (B1), אך הם מופיעים פסים בכל flowrate 5 μL / s(B2). בעוד הידרוג&#39;ל שוכן, 2 ד וסקולרית נגזרות רשת הייתה מפוברקת TRITC שכותרתו, 65 dextran kDa נשאב דרך הרשת (C). זמן לשגות מיקרוסקופי שמש לפקח על dextran הניאון כפי שהוא מלא את הערוצים מתפזרים לתוך הידרוג&#39;ל שמסביב. חיצים לבנים ב (ב) ו- (ג) לציין את כיוון זרימת הנוזל. בר הכיול (C) מציין את עוצמת dextran הניאון. ברי הסולם מייצגים 20 מיקרומטר (B1) ו- (B2) ו -50 מיקרומטר (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

פרוטוקול זה מתאר את היישום של פירוק הידרוג'ל מונחה תמונה ומבוסס לייזר לייצור רשתות מיקרופלואידיות ביו-נוזליות הנגזרות מכלי דם המוטמעות בהידרוג'לים פולי (אתילן גליקול) דיאקרילט (PEGDA). מערכות מיקרופלואידיות ביומימטיות אלו עשויות להיות שימושיות עבור יישומי הנדסת רקמות, יצירת מודלים של מחלות מבחנה וייצור מכשירים מתקדמים "על שבב".

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בלייזר בפולסים של פמטושנייה כדי לייצר רשתות מיקרופלואידיות ביו-מימטיות תלת-ממדיות ממקור כלי דם, המוטמעות בתוך הידרוג'לים של polyethylene glycol diacrylate, באמצעות דגרדציה מודרכת בתמונה באמצעות לייזר. יתרון משמעותי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר רשתות מיקרופלואידיות ביו-מימטיות תלת-ממדיות המשחזרות במדויק את הצפיפות, העקמומיות (tortuosity), טווח הגדלים והארכיטקטורה הכללית של כלי דם in vivo בתוך מבנים סינתטיים. גישה זו לייצור מיקרופלואידי תקדם את יכולתנו לייצר מבנים של הנדסת רקמות הדומים יותר למצב in vivo, מודלים ביו-מימטיים של מחלות ומכשירים בעלי צפיפות גבוהה במיוחד על שבב (on a chip).הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שההגדרה וההטמעה הנכונות של תוכנת המיקרוסקופ אינן אינטואיטיביות, אך הן חיוניות ליצירת הרשתות המיקרופלואידיות הרצויות. רבים משלבי ההכנה מפורטים בפרוטוקול הכתוב, כולל יצירת המסכות הווירטואליות, הגדרת המיקרוסקופ והעלאת המסכות הווירטואליות לתוכנת המיקרוסקופ. כדי לבצע פוטו-פולימריזציה של הידרוג'ל PEGDA, הצמידו תחילה טבעת של דבק דו-צדדי לצלחת פטרי של 60 millimeter שבתחתיתה נחתך חור בקוטר 20 millimeter.בשלב הבא, בתוך מבתח, הוסיפו 1 ml של HBS עם TEOA לשפופרת צנטריפוגה ענברית בנפח 2 ml המכוסה ברבדית אלומיניום. לאחר מכן, הוסיפו לשפופרת 10 µl של Eosin Y disodium salt בריכוז 1 mM. כעת, העבירו בעזרת פיפטת זכוכית נפח קטן של NVP לתוך כוס כימית מזכוכית.מתוך נפח זה, קח 3.5 µL של NVP והעבר אותו לתערובת. לאחר מכן, הוסף 10 mg של PEGDA במשקל 3.4 kDa לשפופרת שנייה המכוסה ברדיד אלומיניום. לאחר מכן, הוסף 0.2 mL מהתערובת כדי להכין תמיסת prepolymer של PEGDA בריכוז של 5% משקל לנפח.כעת, ערבבו את תמיסת הפרה-פולימר במכשיר vortex עד להמסה מלאה של ה-PEGDA. לאחר מכן, העבירו בפיפט 60 µL אל תוך תבנית PDMS ללא היווצרות בועות. כעת, מרכזו זכוכית כיסוי (coverslip) מאקרילית במידה של 40 mm ובמספר 1.5 מעל התמיסה על גבי תומכי ה-PDMS.לאחר מכן, הניחו את המכלול תחת מקור אור לבן המכויל לספק 95 milliwatts. השלימו את פולימריזציית הפולימר במשך שלוש דקות. לאחר מכן, זרימו מים מזוקקים בין התבנית לכיסוי הזכוכית כדי להפריד את ההידרוג'ל מה-PDMS ושטפו את ההידרוג'ל.לאחר מכן, ייבשו בזהירות את קצוות הזכוכית למחסה (coverslip) ללא ספיגה של מים מההידרוג'ל. כעת, הצמידו את הזכוכית למחסה לצלוחית הפטרי המוכנה. הפעלת לחץ קל מסייעת להצמדה.לאחר מכן, טבול את ההידרוג'ל במים מזוקקים. הגדר את מיקרוסקופ הקונפוקל לסריקת לייזר כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט והתחל בתצורת ויזואליזציה של הידרוג'ל. לאחר מכן, התאם את ההידרוג'ל ואת צלחת הפטרי למתאם השולחן והנח אותם על השולחן.בשלב הבא, מלאו את צלחת הפטרי בלפחות five milliliters של מים מזוקקים והורידו את עדשת השקיעה במים עד למרחק קצר מעל ההידרוג'ל, מבלי לבוא איתו במגע. כעת, לחצו על live כדי להפעיל את קו לייזר הארגון. לאחר מכן, התמקדו בהידרוג'ל עד שניתן יהיה לראות את אות ה-Eosin Y בצדו העליון של ההידרוג'ל.כדי לסייע באיתור ההידרוג'ל, נסו להעלות באופן זמני את אחוז ההספק או את גודל ה-pinhole. סמנו את המיקומים של החלק העליון והתחתון של ההידרוג'ל, ואת תחתית הבאר. לאחר מכן, השתמשו בג'ויסטיק כדי לנוע באופן רוחבי ולאתר את קצוות הבאר.בחלון המיקוד, הורד את מישור המיקוד ב-150 microns בתוך ההידרוג'ל באמצעות החץ למטה לצד תיבת מיקום Z. השלב הבא הוא קריטי. אפס את מיקומי X ו-Y בחלון הבמה, לאחר מכן מחק את כל שאר המיקומים המסומנים וסמן רק את המיקום שאופס.כעת, כדי להתחיל בתהליך היצירה של תעלת כניסה, צלם תחילה תמונה ולאחר מכן, באמצעות כפתור המלבן בחלון האזורים (regions), סמן את האזור שיהווה את הכניסה לרשת כלי הדם. לאחר מכן, עבר להגדרות יצירת התעלה. פרטים נוספים מופיעים בפרוטוקול הכתוב.לאחר מכן, בחלון Z stack, לחצו על כפתורי המרכז למעלה ומעל ה-offset כדי למרכז את ה-Z stack במיקום הנוכחי. לאחר מכן, בהתאם לגודל הנדרש של ה-inlet, הגדירו את מספר הפרוסות (slices) עם מרווח של אחת. כעת, ודאו שהמהירות מוגדרת ל-3 ושאחוז ההספק מוגדר ל-100%.לאחר מכן המשיכו לשמירת התצורה ולחצו על כפתור התחלת הניסוי. כדי להדמיות את ההידרוג'ל במהלך פירוק התעלה, הגדילו את ה-gain master בחלון הערוצים אם האזור בשדה הראייה שחור, או הקטינו את ה-gain master אם האזור לבן. לאחר הפירוק, ודאו כי הכניסה נוצרה על ידי חזרה לתצורת הדמיית ההידרוג'ל ולחיצה על live.ראשית, תחת חלון האזורים (regions), טענו קובץ ovl כלשהו ממעריכת ה-Z של המסכות הווירטואליות ולחצו על כפתור החץ כדי לראות את ה-ROIs בשדה הראייה. לאחר מכן, לחצו על live כדי לסרוק את תצורת הוויזואליזציה של ההידרוג'ל והשתמשו בג'ויסטיק או בחלון הבמה כדי למקם את ההידרוג'ל כך שהכניסה תתחבר למיקום הנכון בתוך הרשת הווסקולרית. בשלב הבא, הורידו את מישור המיקוד לעמדה הראשונה במאקרו של המיקרוסקופ, שהיא 50 microns למטה ממיקום ה-Z המרכזי הקודם, באמצעות גודל הצעד (step size) בחלון המיקוד ולחיצה על החץ כלפי מטה.שוב, זהו שלב קריטי שבו יש לאפס מחדש את מיקומי ה-X וה-Y, למחוק את כל שאר המיקומים המסומנים, ולסמן רק מיקום זה כנקודת האפס החדשה. ודאו שאתם שומרים תצורה חדשה זו. כעת, תחת תצורת יצירת הערוצים, בחרו רק בחלונות של סדרות זמן (time series) והלבנה (bleaching).בשלב הבא, פתחו את המקרו ובחרו בלשונית השמירה. בחרו במתכון שהוכן קודם לכן ולחצו על apply. הקפידו לא ללחוץ על store, אחרת המתכון יידרס.לאחר אימות ההגדרות, שמור שוב את תצורת יצירת הערוץ ולאחר מכן לחץ על update במאקרו של המיקרוסקופ. לחץ על no כדי לדרוס את רשימת המיקומים הנוכחית, ולאחר מכן לחץ על start במאקרו של המיקרוסקופ כדי להתחיל את הפרוטוקול. לאחר השלמת תהליך הפירוק, השתמש בתצורת ויזואליזציה של ההידרוג'ל בעוצמת לייזר נמוכה יותר כדי לאפשר צפייה ב-dextran מסומן ב-FITC, אשר בעל אות חזקה יותר מאות ה-Eosin Y הטבעי של ההידרוג'ל.לפני הכנסת הדקסטראן המסומן פלואורסצנטית, ספגו מעט מים מהבאר בתוך ההידרוג'ל. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 10 µL של דקסטראן מסומן FITC מסונן. הפרוצדורה המתוארת שימשה להמרת נפח גדול של תמונות מיקרו-וסקולריות לסדרה של מסכות וירטואליות ליצירת רשת מיקרו-פלואידית בהנחיית תמונה.הרשת המיקרופלואידית שהתקבלה הושוותה לכלי הדם במצב in vivo מהם היא נגזרה. פירוק ההידרוג'ל מבוסס הלייזר בהנחיית תמונה אפשר את ייצורן של רשתות מיקרופלואידיות ביו-מימטיות בתלת-ממד המשחזרות את הגודל, העקמומיות (tortuosity) והארכיטקטורה המורכבת של כלי דם במצב in vivo. כדי ליצור זרימת נוזלים ברשתות מיקרופלואידיות מוטמעות אלו, נעשה שימוש הן בראשי לחץ והן במשאבות מזרק.דקסטראן של 70 kilodalton המסומן פלואורסצנטית וחרוזי פוליסטירן של 10 micron נצפו נעים משמאל לימין על ידי זרימה המושרית על ידי לחץ הידראולי. לחלופין, זרימה המונעת על ידי משאבת מזרק הופעלה באמצעות פוטו-פולימריזציה של הידרוג'ל בתוך התקן מיקרופלואידי משני. תוך שימוש באותו פרוטוקול המתואר כאן, יושמה לאחר מכן דגרדציה מבוססת לייזר כדי לייצר רשת דו-ממדית ממקור כלי דם בתוך הידרוג'ל מאוחסן עבור זרימה המונעת על ידי משאבת מזרק ופרפוזיה של דקסטראן של 65 kilodalton.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש במיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר המצויד בלייזר פולסים פמטושנייה, כדי ליצור רשתות מיקרופלואידיות ביו-מימטיות באמצעות פירוק הידרוג'ל מבוסס לייזר בהנחיית תמונה. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה תוך שעתיים עד שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי יש להתאים ולאפטם את פרמטרי הלייזר, כולל ההספק, אורך הגל ומהירות הסריקה, בהתאם להרכב ההידרוג'ל שמפורק.תודה ובהצלחה בניסוייכם.

image-guided-laser-based-fabrication-vascular-derived-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

אנו מציגים שיטה לתצהיר מיקרופלואידית של ג'יניפין ופיברונקטין דפוסיים על מצעי PDMS, המאפשרת כדאיות מורחבת של רקמות צפופות תאי שריר חלק בכלי הדם. שיטת ייצור רקמות זו משולבת עם טכנולוגיית סרט דק שרירי כלי דם קודמת למדידת התכווצות כלי הדם לאורך מסלולי זמן רלוונטיים למחלה.

טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films

כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

רקמות מהונדסות מסתמכות במידה רבה על רשתות כלי דם נאותות כדי לספק חומרים מזינים וגזים חיוניים ולהסיר פסולת מטבולית. בעבודה זו, פרוטוקול זריעה צעד אחר צעד של תאי אנדותל ותאי תמיכה יוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בפלטפורמת תפוקה גבוהה לחקר התנהגות כלי שיט מתפתחת בסביבה תלת-ממדית מבוקרת.

זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

בפרוטוקול זה, בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, שיכולה לשכפל סביבה מיקרו-וסקולרית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשכפל את כל מפל ההידבקות/הגירה של לויקוציטים, מועסקת כדי לחקור אינטראקציות של תאי לויקוציטים-אנדותל במחלות דלקתיות.

מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

דשים מהונדסים דורשים רשת כלי דם פונקציונלית משולבת. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לייצור דש רקמה מודפס בתלת-ממד המכיל רשת כלי דם היררכית ואת האנסטומוזות המיקרו-כירורגיות הישירות שלה לעורק עצם הירך של החולדה.

ייצור דשים וסקולריים מהונדסים באמצעות טכנולוגיות הדפסה בתלת-ממד

פרוטוקול זה מציג מודל גידול-על-שבב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לביצוע מחקר סרטן אנושי בסיסי ותרגומי בתפוקה גבוהה, קידום בדיקות סקר לתרופות, מידול מחלות וגישות רפואה מותאמת אישית עם תיאור של נהלי העמסה, תחזוקה והערכה.

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבניית מערכת איבר-על-שבב (OOC) שנועדה לחקות כריתת ריאות. מערכת זו חוקרת את המתאם הפוטנציאלי בין פגיעה בגליקוקליקס לסיבוכים לאחר כריתת ריאות.

מידול הגליקוקליקס האנדותל לאחר כריתת ריאות בשבב נוזלי תלת מימדי - גישה לייצור מערכת איבר-על-שבב מבוססת כלי דם

למד ליצור רשתות מיקרו-זרימה ביומימטיות תלת-ממדיות מPEGDA באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ולייזר פמטו-שנייה. שיטה זו משפרת הנדסת רקמות ומודלים של מחלות.

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

גלה סרטונים נוספים