Name: הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: למדו למדוד את pH הפאגוזום והציטופלזמה בנייטרופילים אנושיים ומכרסמים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית וצבע SNARF-1. שיטה זו מאפשרת ניטור שינויים דינמיים בנפח ובחומציות הוואקולה הפאגוציטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה באדיבות על ידי קרן וולקאם, מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה ומלגת הזיכרון של אירווין יופה.

בהצהרת אתיקה: כל עבודת החיה נערכת עם הרישיון והאישור של משרד פן בריטניה. השתתפות אדם במחקר זה אושר על ידי ועדת UCL המשותפת / UCLH על האתיקה של מחקר אדם. כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת. 1. הכנת ג אלביקנס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול דיסק קנדידה (ראה רשימת חומרים) על צלחת אגר YPD לפי הוראות היצרן. פיק מושבה ולהוסיף אותו 15 מ&quot;ל של מרק YPD. דגירה זה חממה רועד ב 30 ° C ו 200 סל&quot;ד עד שהמרק הוא מעונן (בדרך כלל על 2 ימים, או לריכוז של בערך מעל 1 x 10 9 / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה המדיום קנדידה מחדש להשעות אותו 50 מ&quot;ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). צנטריפוגה ב 3000 XG במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל 50 מ&quot;ל של מדיום PBS / קנדידה באמבט מים שחומם מראש ל 60 מעלות צלזיוס, כך הצינור כולו הוא יםubmerged עבור 1 h. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר כי קנדידה הם-הרג חום, פס מדגם לצלחת אגר YPD ו דגירה לילה בשעה 30 ° C. התאם את-הרג חום (HK) ריכוז קנדידה כדי 5-9 x 10 8 / מ&quot;ל, תלוי צמיחה קנדידה, ולאחסן אותו 1 aliquots מ&quot;ל ב -20 ° C במקפיא. הערה: כל ספירת התאים בפרוטוקול זה בוצעה באמצעות דלפק תא אוטומטי. </li></ol></li></ol> 2. S-1 צימוד חום-הרג (HK) קנדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquot של carboxy-S-1 אסתר succinimidyl (50 מיקרוגרם) על ידי דילול אותו 100 μL של sulfoxide דימתיל בדרגה גבוהה (DMSO). וורטקס היטב כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל של 1 x 10 8 קנדידה HK ב 0.1 M סודיום ביקרבונט (pH 8.3) בצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של carboxy-S-1 טיפה אחת בכל פעם, כדי קנדידה HK תוך ערבוב על מערבולת בערך 2000 סל&quot;ד (בינוני עד מהיר). גלישת אלומיניום foil סביב הצינור ולמקם אותו על רולר בטמפרטורת החדר למשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים HK Candida- S-1 (HKC-S-1) על ידי צנטריפוגה ב 2250 XG במשך 10 דקות כל אחד. בשנתי השטיפות הראשונות, להשעות את הגלולה ב 15 מיליליטר של 0.1 M סודיום ביקרבונט (pH 8.3). לאחר לשטוף השלישי, להשעות אותו 1 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזן (BSS) חיץ (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת HKC-S-1 ההשעיה לתוך צינורות ב 100 aliquots μL ולאחסן אותם ב -20 ° C. הערה: צינורות משתמשים עם משטח נמוך מחייב חומר, ואם אפשר, כפי HKC-S-1 חלקיקים יכולים להיצמד לקיר של צינורות צנטריפוגה נורמלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Opsonize HKC-S-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור נויטרופילים האדם, להוסיף 100 μL של נסיוב אדם IgG ל 100 μL של HKC-S-1 מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור נויטרופילים עכבר, להוסיף 50 μL של סרום עכבר רגיל 50 μL של בסרום חיסוני עכבר קנדידה (המופקים עכברי C57B6 מוזרקים עם קנדידה HK) 5 כדי 100 μLשל HKC-S-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים אותו על-שייקר חום ב 37 ° C ו- 1100 סל&quot;ד במשך 60-90 דקות, ולאחר מכן על רולר C 4 ° עבור 2 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש פעמים לשטוף במאגר BSS על ידי צנטריפוגה ב 17,200 XG במשך 1 דקות כל אחד. גלולה ב 100 μL של חיץ BSS. </li></ol></li></ol> 3. בידוד של נויטרופילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור נויטרופילים בדם ההיקפי האנושי, לקחת 15 מ&quot;ל של דם על ידי venipuncture מתורם בריא ולמקם אותו לתוך מזרק 20 מ&quot;ל המכיל 90 μL של 1000 פתרון נתרן הפרין IU / מ&quot;ל ​​(60 μL של הפרין / 10 מ&quot;ל של דם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה פיפטה, להזריק 1.5 מ&quot;ל של פתרון dextran 10% לתוך המזרק. הפוך אותו בעדינות 3 פעמים ולהשאיר אותו עומד זקוף על הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 30-60 דקות, עד שהדם מתפרקים לשני חצאים, עם שכבת מעיל באפי העליון כי הוא בצבע קש שכבה בתחתית המכיל אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בעדינות את השכבה העליונה באמצעות מחט או להסיר אותו עם קצה פיפטה. שים את זה אניצינור נה 15 מ&quot;ל. להימנע מלקחת את השכבה האדומה. בעזרת פיפטה מ&quot;ל 5, להוסיף 3-4 מ&quot;ל של מדיום שיפוע צפיפות (ראה רשימת חומרים) לחלק התחתון של הצינור מתחת לשכבת מעיל באפי להשיג שתי שכבות נפרדות. צנטריפוגה ב 913 XG במשך 10 דקות. הערה: אם נויטרופילים עכבר באמצעות (ראו התייחסות 17 לעכבר נויטרופילים בידוד), להשתמש השעית התא כי כבר סמוקה ממח העצם במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant, ומשאיר מאחור גלולה אדומה. בעדינות מערבולת להפריע גלולה. להוסיף 7 מ&quot;ל של מזוקקים, לעקר H 2 O ל גלולה ו להפוך עבור 20 s כדי להשעות את גלולה. להוסיף 7 מ&quot;ל של סליין 2x ו להפוך כמה פעמים כדי לערבב, lysing בתאי הדם האדומים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG 300 5 דק &#39;. יוצקים את supernatant מחדש להשעות גלולה במאגר BSS כ 4 x 10 6 / מ&quot;ל. הערה: למיקרוסקופיה האופטימלי של התאים, לשמור על ריכוז השעית תא בין 1.5-6 x 10 6 </sup&gt; / מ&quot;ל. </li></ol> 4. הכנת שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לטפל צלחת מיקרוסקופיה 8 היטב (ראה רשימת חומרים) עם 200 μL של L- ליזין פולי (פתרון 0.01%) בכל טוב עבור 40-60 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את L- ליזין פולי (ניתן לעשות שימוש חוזר) ולשטוף את הבארות פעמיים עם 200 μL של H 2 O. מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של תאי השעיה מוכנות בשלב 3.6 זה טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquot של 5 (ו-6) acetoxymethyl S-1 -carboxy (S-1-AM) אסתר (50 מיקרוגרם) על ידי הוספת 100 μL של DMSO בדרגה גבוהה כדי צינור אחד. וורטקס לערבב. כאשר אינו בשימוש, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור קטן, להוסיף 1.7 מ&quot;ל של חיץ BSS ו- 20 μL של S-1-AM. וורטקס לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות פעמיים עם 200 μL של חיץ BSS, ולאחר מכן להחליף את החיץ עם הפתרון S-1-AM. יש להיזהר שלא להפריע בשכבה של תאים המחוברים לתחתית הבאר ידי בעדינות pipettingלאורך הקירות של הבארות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה 25 לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות פעמיים עם 200 μL של חיץ BSS. כדי לבחון מעכב, לפצות על &quot;תערובת מאסטר&quot; של התרופה המתאימה חיץ BSS. לשטוף את הבארות פעמי הפתרון המעכב. הערה: הקפד להשתמש באותה כמות של הרכב התרופה (למשל, DMSO או אתנול) בבקרה גם שימש מעכב. אם בוחנים את ההשפעה של כלוריד אבץ, להשתמש במאגר BSS חסר KH 2 PO 4 (את HEPES יכול חיץ הפתרון לבד), כמו אבץ משקעים עם פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate HKC-S-1 opsonized (סעיף 6.2) למשך כ 3 שניות על מיקרומטר משרעת 5. להוסיף 10 μL היטב כל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות, כדי לאפשר phagocytosis, מה שהופך את התא מוכן להיות צלם עבור תמונות של phagocytosis. </li></ol> 5. מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ confocal, להתאים את אורך הגל לייזר כך thעל התאים נרגשים ב 555 ננומטר ואת הפליטה מזוהית על ידי שני ערוצים, או גלאי: 560-600 ננומטר ומעל 600 ננומטר. הערה: פרמטרים מיקרוסקופ ספציפיים יהיו שונים עבור כל מיקרוסקופ צריכים להיות מותאמת על ידי החוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את התאים בעזרת עדשה 63X עם שמן. השתמש בתמונת אריח-סריקה על הגדרה רציפה כדי להציג את משבצת המרכז. באמצעות עוצמת הקרינה ורווח של ערוצי גלאי, לשנות את הפוקוס ואת עוצמת הלייזר ואת הרווח של שני הערוצים כדי לייעל את התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצל את התמונה באמצעות הגדרות כדי להציג שני הערוצים; לבדוק שאין רוויה של עוצמת קרינה בציטופלסמה או וקואולות. רוויה מופיעה כנקודות אדומות. להפחית את עוצמת הלייזר כך שיש מספר מינימלי של נקודות אדומות, אבל התאים phagosomes הם חכמים מספיק כדי לראות בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשתהיה מרוצה, לחץ על &quot;התחל ניסוי.&quot; תמונת סריקה 9 אריח נוצרת. שמור את התמונה כקובץ מורכב המומלץ על ידיהתוכנה המכילה תמונה מורכבת של שני הערוצים (לא JPEG או TIFF). </li></ol> 6. ניסויי כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית עקומת סטנדרט pH עם קנדידה לבד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החוצצים בין pH 3.0 כדי 13.0, לפי טבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot אחד (100 μL) של HKC-S-1. לסובב אותו על 1 דקות ב g 17,200 x. Resuspend אותו 500 μL של חיץ שהוקצו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ טווח pH הנמוך ביותר, להוסיף את ההשעיה לאחד טרום יחס טוב (משלב 4.2). מניחים את השקף על מיקרוסקופ confocal על הבמה מחוממת מוגדר 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הקרינה בכל דקה במשך 10 דקות. חזור עבור כל חיץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומת סטנדרט Saponin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד 1 x 10 7 נויטרופילים האנושי 5 resuspend אותם 1 מ&quot;ל של חיץ pH הנמוך ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השיטה המתוארת בסעיף 4 למדידת ppH hagosomal ב נויטרופילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם ההשעיה קנדידה עבור 20 דקות, להוסיף 0.3% saponin (15 μL של 10% במלאי לאחד טרום יחס טוב (משלב 4.2)) על הצלחת, ואז דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. קח תמונה כל דקה במשך 10 דקות. חזור עבור כל חיץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומות סטנדרטיות pH Cytosolic באמצעות הגבוהה K + / nigericin טכניקה 5, 18, 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור מאגרים שמתואר בטבלה 1, מ pH 4.0 כדי 13.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את פעולות 4.1-4.7, עוזב נויטרופילים רק הבארות טרום טיפול - כל טוב להכיל חיץ שונה. מוסיף את השקף אל הבמה המחוממת 37 מעלות צלזיוס ולהקליט את הקרינה בכל דקה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: זה עלול לקחת קצת זמן עבור ה- pH cytosolic לייצב עם הפתרון החיצוני, אך לאחר נקודה זו, ערך היחס S-1 הופךקָבוּעַ. מדידת HKC-S-1-התאים בכל ניסוי יכולה לשמש כביקורת לבדוק שכל מעכבים הוסיפו לא להפריע הקרינה הנפלטת S-1 או להשפיע על רמת החומציות של עור החיץ. </li></ol></li></ol> ניתוח תמונה 7. הערה: הנה, הוראות לניתוח תמונה (לכמת הקרינה) באמצעות ImageJ התוכנה החופשי מסופקת. שימוש ImageJ מומלץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד והתקן גרסה ImageJ&gt; 1.46r בהתאם להנחיות של היזם (https://imagej.nih.gov/ij/). התקן את קובץ קוד המשלים מצורף עם פרוטוקול זה נקרא &quot;מדידת Phagosomal.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תמונה J ו לטעון את קובץ התמונה שנבחרה לניתוח על הכלים. כדי לשלב את שני הערוצים, להשתמש Image&gt; צבע&gt; הפוך מרוכבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור קובץ בו כדי לאחסן תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כלי הקו בסרגל הכלים ולחצו לחיצה כפולה על מנת להגדיל את הרוחב ל &amp; #34; 2 &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר קו לרוחב של phagosome, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על &quot;pH מידה&quot;. עוצמת הממוצע של שני ערוצי נרכש, ואת היחס שלהם מחושב באופן אוטומטי על ידי קובץ קוד ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שסיים את המדידות, לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור &quot;לשמור את הקובץ.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את שטח phagosome, השתמש בסמל הרביעי יחד בסרגל הכלים לצייר ביד חופשית מסביב לאזור. לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור &quot;אזור מידה.&quot; הערה: התוצאות נשמרות בקובץ יומן נוצר בתיקייה הנבחרת. התוצאות עשויות להיות מעובד באמצעות גיליון אלקטרוני, R, או תוכנה מקבילה. הקשר בין יחס קרינת pH הוא כ sigmoidal, ואת ערכי היחס שנוצרו על ידי ניתוח ImageJ ניתן להמיר pH באמצעות פונקצית סיגמואיד כללית או לוגיסטית או על ידי ליניארי או אינטרפולציה שגם מעוקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד הציטופלסמה, למתוח קו על פני הציטופלסמה לבין לחץ לחיצה ימנית על &quot;pH מידה&quot;. </li></ol>

<ol><li>Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+as+electrochemical+generators+to+produce+ion+fluxes+and+turgor+in+fungi%2C+plants+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans.</a> Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).</li>
<li>Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+neutrophils+kill+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">How neutrophils kill microbes.</a> Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).</li>
<li>Cross, A. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NADPH+oxidase+of+professional+phagocytes+-+Prototype+of+the+NOX+electron+transport+chain+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems.</a> BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).</li>
<li>Demaurex, N., El Chemaly, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+voltage-gated+proton+channels+in+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes.</a> J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).</li>
<li>Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkalinity+of+neutrophil+phagocytic+vacuoles+is+modulated+by+HVCN1+and+has+consequences+for+myeloperoxidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity.</a> PLoS One. 10 (4), 0125906(2015).</li>
<li>Reeves, E. P., Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K%2B+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).</li>
<li>Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+ion+efflux+regulates+adherence%2C+spreading%2C+and+respiratory+burst+of+neutrophils+stimulated+by+tumor+necrosis+factor-alpha+%28TNF%29+on+biologic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces.</a> J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).</li>
<li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li>
<li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Indicators+of+Ion+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Indicators of Ion Concentrations.</a> Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li>
<li>Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+pK+a+of+Fluorescein+to+Optimize+Binding+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays.</a> Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).</li>
<li>Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-dependent+fluorescein+chlorination+by+stimulated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils.</a> J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).</li>
<li>Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Phagosome+pH+by+Ratiometric+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (106), e53402(2015).</li>
<li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).</li>
<li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> J Vis Exp. (109), e53622(2016).</li>
<li>Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+new+pH-sensitive+fluoroprobe+%28carboxy-SNARF-1%29+for+intracellular+pH+measurement+in+small%2C+isolated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl+%C3%BCgers+Archiv+EJP%22%5BJournal%5D)">Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells.</a> Pfl ügers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).</li>
<li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leuko+Biol%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).</li>
<li>Morgan, D., Capasso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+proton+channels+maintain+pH+in+human+neutrophils+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).</li>
<li>Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+measurements+in+Ehrlich+ascites+tumor+cells+utilizing+spectroscopic+probes+generated+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ.</a> Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).</li>
<li>Levine, A. P., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NADPH+Oxidase+and+Microbial+Killing+by+Neutrophils%2C+With+a+Particular+Emphasis+on+the+Proposed+Antimicrobial+Role+of+Myeloperoxidase+within+the+Phagocytic+Vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole.</a> Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).</li>
<li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li>
<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+%28C-SNARF-4%29+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li>
<li>Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+measurement+of+intracellular+pH+in+cultured+human+keratinocytes+using+carboxy-SNARF-1+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry.</a> Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).</li>
<li>Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/096843289390031U">Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1.</a> Micron. 24 (6), 551-556 (1993).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10508230">Measurement of Intracellular Calcium.</a> Physiol Rev. 79 (4), (1999).</li>
<li>Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+methods+for+the+measurement+and+manipulation+of+cytosolic+free+calcium+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).</li>
<li>Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+cytoplasmic+and+phagosomal+consequences+of+human+neutrophil+exposure+to+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis.</a> Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).</li>
<li>Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC6+channel+translocation+into+phagosomal+membrane+augments+phagosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).</li>
<li>Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+intracellular+pH+and+Ca2%2B+using+the+fluorescence+of+SNARF-1+and+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

לאחר הגדרת הריאגנטים המתאימים, הגדרות המיקרוסקופ וניסויי הכיול, שיטה זו פשוטה יחסית לביצוע. השלבים הקריטיים כוללים: תיוג הקנדידה ב-S-1 כדי להבטיח שאין עומס יתר של הצבע, כיול וניתוח התמונה.
S-1 הוא ריאגנט המתאים לסביבות pH אלקליות יותר, שהוא חשוב במיוחד עבור נויטרופילים21 אך מגביל את השימוש בו בסוגי תאים מסוימים. עבור סביבות חומציות יותר, כגון פגוזומים של מקרופאגים, SNARF-4 או S-4, מתאים יותר בגלל ה-pKa22 הנמוך יותר שלו. יתר על כן, לקריאות ציטופלזמיות מדויקות יותר, עדיף להשתמש ב-S-4, מכיוון שהעקומה הסטנדרטית עבור S-1 מראה שיחסי הקרינה מתחילים לרמה מתחת ל-pH 6 (איור 3). צבעים אחרים, כגון 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF) או pHrodo Red עשויים גם הם להתאים יותר בהקשר שצפוי להיות חומצי. עם זאת, צביעת הציטופלזמה עדיין נחוצה לזיהוי נכון של הפאגוזומים המכילים קנדידה.
מאפיין חשוב של אינדיקטור pH פגוזומי הוא שהוא אינו משתנה באופן בלתי הפיך על ידי הסביבה הפגוזומלית התגובתית. נראה ש-S-1 עמיד בפני הסביבה הנויטרופילית. זה מוצג על ידי לוין ואחרים.5 (ראה סרטון משלים 4 בהתייחסות5) המדגימים את הפגוציטוזה ושחרור לאחר מכן של חלקיק קנדידה המסומן S-1 על ידי נויטרופיל Hvcn1-/- . כאשר החלקיק עובר פגוציטוזה, החלקיק הופך מצהוב/כתום לאדום (pH ניטרלי עד אלקליין), אך כאשר החלקיק משתחרר על ידי הנויטרופיל, הוא חוזר לצבעו המקורי.
חשוב להזכיר כמה מהמגבלות הקשורות לשימוש ב-S-1. העובדה שלצבע זה יש שני ספקטרום פליטה המאפשרים מדידה רציומטרית היא יתרון, אך יש צורך בציוד מיוחד לרכישת תמונות; המיקרוסקופ המשמש לניסויים חייב להיות מסוגל להקליט שתי תמונות בו זמנית או עם עיכוב זמן לא משמעותי. המחברים מניחים שלחוקר המנסה פרוטוקול זה יש ניסיון בשימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית, או שיש לו גישה לאיש מקצוע מיומן. איננו יכולים לפרט את כל הפרמטרים הספציפיים של המיקרוסקופ מכיוון שהם יהיו שונים עבור כל מיקרוסקופ וצריכים להיות מותאמים על ידי החוקר. אסטר האצטוקסימתיל המצומד ל-S-1 המאפשר לצבע להתפזר לתוך ציטופלזמת התא מתפרק על ידי אסטרזות לא ספציפיות בציטופלזמה של התא ליצירת המולקולה הפלואורסצנטית. אסטראזים, כגון פוספטאז אלקליין, קיימים בסרום אנושי ובסרום בקר עוברי, המשמשים להשלמת מדיה של תרבית תאים. בהתאם לכך, המדיום בו נטענים התאים ב- S-1-AM (סעיף 4.5) אסור להכיל סרום. זה עשוי להיות מאתגר אם משתמשים בתאים הדורשים מדיום עשיר יותר בחומרים מזינים כדי לקיים אותם מאשר תמיסת המלח המאוזנת המשמשת לאורך פרוטוקול זה. באופן דומה, רכיבים אחרים של מדיום פלואורסצנטי, כגון פנול אדום, עלולים להפריע למדידות S-1.
פסי השגיאה באיור 3 מצביעים על כך שיש שונות מסוימת במדידות היחס בכל pH. יש צורך במספר מתאים של חזרות על כל ניסוי (לפחות n = 3) וכמה שיותר מדידות בודדות בכל ניסוי בודד כדי להתגבר על השונות הבין-ואקולרית. לכן מומלץ למדוד את ה-pH של לפחות 100 פגוזומים לכל מצב וכמה שיותר אזורים פגוזומיים שנראה כי מכילים רק קנדידה אחת. הפאגוזומים שיש למדוד לצורך כימות צריכים להיות אלה שבלעו לחלוטין חלקיק קנדידה (כלומר, אלה המוקפים לחלוטין בציטופלזמה). כדי להפחית הטיות לא מכוונות בבחירת תאים/פגוזומים לכמות, יש לבצע את כל הניתוחים כשהם עיוורים לתנאי הניסוי.
כאן, אנו מתארים את בידוד הנויטרופילים על ידי שקיעה דקסטרנית של דם מלא ואחריה צנטריפוגה של שכבת הפלזמה דרך שיפוע צפיפות. אנו משתמשים בטכניקה זו מכיוון שהיא מייצרת במהירות וביעילות אוכלוסייה טהורה (>95%) של נויטרופילים, אם כי ישנן שיטות אחרות זמינות, כגון צנטריפוגה מדם מלא באמצעות נוסחאות אחרות של שיפוע צפיפות או ברירה שלילית של נויטרופילים באמצעות ערכות מיוחדות עם נוגדנים או חרוזים מגנטיים. עם זאת, האחרון יכול להיות יקר מאוד עבור רוב הקבוצות שמבודדות נויטרופילים באופן שגרתי. בנוסף, אנו משתמשים בהפרין נוגד קרישה בצינור איסוף הדם, בעוד שחוקרים אחרים עשויים להיות רגילים יותר להשתמש בחומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) או חומצה ציטראט נתרן (ACD). מכיוון שישנן שיטות רבות ושונות לבחירה, זה תלוי בהעדפה האישית של החוקר.
יתר על כן, בעת בידוד ומניפולציה של נויטרופילים יש לטפל בהם בזהירות מסוימת כדי למנוע הפעלה מוגזמת. אמצעי הזהירות כוללים: שימוש בכלי פלסטיק בלבד, ללא זכוכית; לעקר את כל המאגרים כדי להסיר כל אנדוטוקסין מזהם; בעת סיבוב נויטרופילים וודא שהצנטריפוגה מאוזנת היטב כדי למנוע רעידות מוגזמות; להגביל ככל האפשר את הזמן שהנויטרופילים נשארים בגלולה לאחר צנטריפוגה; אין להחזיק נויטרופילים בתמיסה של יותר מ-5 x 106/מ"ל; ולבצע את הניסוי בהקדם האפשרי לאחר הבידוד.
ניתן להתאים שיטה זו למדידת שינויים ב-pH ובאזור הפגוזומלי לאורך זמן על ידי שימוש בבמה מחוממת המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס במיקרוסקופ וצילום תמונות אחת ל-30-60 שניות מאותו מיקום, כמתואר לשלבי הכיול. זה יכול גם להיות מותאם תיאורטית לניסויים בעלי תפוקה גבוהה יותר, כמו בלוחות של 96 בארות, ולניסויים בזרימה ציטומטרית, שבהם S-1 יכול לשמש כאינדיקטור pH23. עם זאת, בהגדרות אלה, הדגש על פעילות תאים בודדים מוחלף בהשפעה גלובלית יותר על אוכלוסיית התאים.
שיטה זו שואפת לספק מערך ניסוי פשוט יחסית שעליו יכולים חוקרים בודדים להסתגל כך שיתאים לתחום העניין שלהם. חוקרים עשויים לרצות לחקור את ה-pH והאזור הפגוזומלי של נויטרופילים תוך מדידת תנועה של יונים אחרים, למשל, ריכוז סידן תוך תאי. ישנם מספר אינדיקטורים פלואורסצנטיים Ca2+ זמינים למיקרוסקופיה קונפוקלית, כגון Indo-1, שיש לו גם ספקטרום פליטה כפול ב-400 ו-475 ננומטר24. אורכי גל פליטה אלה אינם חופפים לספקטרום פליטת S-1, אך אורך גל העירור נמצא בקצה האולטרה סגול (UV) של הספקטרום, מה שעלול להזיק לתאים, ולייזר UV אינו נפוץ בכל המיקרוסקופים. סקירה מקיפה של האינדיקטורים השונים למדידת שטף סידן תוך תאי מכוסה על ידי Takahashi et al.25 ו-Hillson et al.26.
לסיכום, ישנן שיטות אחרות זמינות למדידת pH פגוזומי באמצעות צבעים פלואורסצנטיים שונים כמו Nunes et al. הפגינו13 כמו גם קבוצות אחרות27,28. חוקרים אחרים השתמשו גם ב-S-1 כדי למדוד pH ציטוזולי29 או pH פגוזומי14. עם זאת, פרוטוקול זה ייחודי במדידה בו-זמנית של ה-pH של ציטוזול ופאגוזום, מה שמספק את ההזדמנות לצפות בשינויים באזור החתך הפגוזומלי ולהבחין בין נויטרופילים מסוג בר ו-Hvcn1-/-, לבין נויטרופילים אנושיים עם ובלי NADPH אוקסידאז עובד.

נויטרופילים הם תא החיסון המולד בשכיחותו בגוף. תפקידה העיקרי שלו מורכב המסיירים הדם ואת ומלטפות, מעכלים את החלקיקים הזרים כי היא עשויה להיתקל בתהליך המכונה phagocytosis 1, 2. החלקיקים מפורקים בתא של תאיים שנקרא phagosome. הפעלת האנזים מונואמין NADPH נויטרופילים, את NOX2 איזופורם, יוזם מפל של תגובות ביוכימיות המסתיימת במותו של הפתוגן. יחידות משנה חלבון NOX2 להמשיך לגבש מורכבת שרשרת העברת אלקטרונים בקרום phagosomal 3. לאחר הפעלה, זה מעביר אלקטרונים מן NADPH דרך הממברנה לחמצן מולקולרי בתוך phagosome, הפקת אניוני דיסמוטאז ומיני חמצן תגובתי נוספת. תופעה זו ידועה בשם פרץ הנשימה, והוא נחשב חיוני הרג חיידקים יעיל בעיכול 2 </sup&gt;. עם זאת, תנועה בלעדית זו של מטען שלילי על פני הקרום שבקרוב להשבית NOX2 אם זה לא יפוצה על ידי מטען חיובי נעים ו / או מטען שלילי נע מתוך phagosome. זה הוכח גם כי הרוב המכריע של פיצוי תשלום נויטרופילים מתבצע על ידי ערוץ הפרוטון 4 HVCN1, 5. ערוץ זה מאפשר תנועה פסיבית של פרוטונים לאורך שיפוע אלקטרוכימיים שלהם מן cytosol לתוך phagosome. ריכוז Proton משתקף על ידי pH, כך על רמה מסוימת של פעילות אנזים מונואמין, מדידת pH של phagosome יכול לספק מידע על ההשתתפות היחסית של מסלולי protonic ולא protonic כפיצוי תשלום. Phagosome נויטרופילים האנושי יש pH בסיסי של כ 8.5 עבור 20-30 דקות לאחר phagocytosis 5. זה מרמז על קיומו של תעלות יונים הלא-פרוטונים נוספים NOX2-induced פיצוי תשלום, כמו פיוז&#39;ן ושחרור תכולתו של גרגרי חומצי ופיצוי בלעדי ידי HVCN1 ישמור בסביבת חומצית, בניגוד לזה שנצפה. התנועה של יונים לפצות מטען שלילי זה עשוי גם להפעיל שינויים בגודל phagosome באמצעות אוסמוזה. יונים יכול להיות אלה הנמצאים נויטרופילים בריכוזים פיסיולוגיים גבוהים: יוני אשלגן הוכחו לנוע לתוך phagosome 6, ותנועה יונית כלוריד היא עוד מועמד חשוב נויטרופילים פונקציה 7. הסדרת pH של phagosome חיונית עבור פעילות הפרוטאז מיקרוביאלית 5. Myeloperoxidase (MPO) נראה שיש פעילות אופטימלית ב- pH 6, בעוד שעבור cathepsin G ו אלסטט, רמות אופטימליות הן pH 7-9 ו pH 8-10, בהתאמה 5. לכן, שינוי חולף ב pH phagosomal עשוי לספק נישות פעילות אנזימים שונים כיףction. הבנה כיצד pH מעורב בהרג חיידקים נויטרופילים עשויה לספק מידע שימושי עבור העיצוב של סוכני מיקרוביאלית רומן משלים-נויטרופילים. Phagosome נויטרופילים היא סביבה מאוד תגובתי. זה עושה את זה קשה להעריך במדויק pH, בגלל צבע ניתן חמצון בקלות, מה שמוביל חפצים טכניים. מבחינה היסטורית, isothiocyanate והעמסת (FITC) כבר צבע של בחירה למדוד תאיים pH 8, 9. עם זאת, יש כמה חסרונות לשימוש שלה במדידת pH נויטרופילים phagosomal. יש לה pKa של 6.4 10, מה שאומר שזה יכול במדויק רק לשמש כדי להעריך את רמות מה PH 5 עד 7.5 8, כמו מרווה ב- pH &lt;8 11. כמו pH נויטרופילים phagosomal יכול להיות הרבה יותר אלקליין 5, FITC לא יכול ללכוד מגוון רחב של שינויים pH פוטנציאל. Signifi נוספתהבעיה צביעות עם FITC בהקשר של נויטרופילים היא שזה נחשב להיות photobleached ידי MPO 12. מעכב MPO, יזיד הנתרן, יכול לשמש כדי להגביל photobleaching 13, אבל זה הוכח כי יזיד הנתרן ישירות מוריד את רמת חומציות phagosomal באופן MPO עצמאי ולכן היא בלתי הולמת לשימוש מבחנים כגון 5. לעומת צבעי תאיים אחרים, S-1 יש pKa גבוה יחסית של 7.5 10. בתנאים חומציים, המולקולה היא protonated ומייצרת אות פליטה בין 560 ו 600 ננומטר כאשר נרגש על 488 ננומטר ומעלה. כאשר המולקולה היא deprotonated בלמעלה תנאי בסיסי, גל הפליטה נגמר 600 ננומטר. יחס של עוצמות הקרינה בשני אורכי גל אלה מצביע על שינוי הפליטה, המהווה יותר הוא אמין יותר מאשר מדידות קרינה יחידות, כפי שהוא אינו מושפע על ידי ריכוז fluorophore ואת מבנה תא. S-1 ניתן מצומדות חומר אנטיגני, כגון zymosan 14, אם כי-הרג חום (HK) קנדידה אלביקנס היא מועדף, שכן שטח הפנים הגדול יותר נותן קריאת קרינה עקבית יותר. השתמשנו גם שינוי של השיטה בחקר שינויים זמניים ב pH (איור 3) 5. שיטה זו למדידת pH cytosolic ניתן ליישם בקלות סוגי תאים אחרים, כמתואר במקום אחר 15, 16, ו תאים עם phagosomes אלקליין יותר 14.

<table><tbody><tr><td>Candida albicans ATCC 10231 Vitroids&nbsp; 80 CFU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RQC14003-10EA</td><td>מניחים ישירות על צלחת אגר מפוזרת לפי הוראות היצרן</td></tr><tr><td>מרק YPD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375</td><td>עקוב אחר הוראות היצרן, קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000</td><td>MP ביו-רפואיים</td><td>2101514</td><td>השתמש בכפפות&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן הפרין לעירוי (ללא חומרים משמרים), 1,000 יחב"ל/מ"ל&nbsp;</td><td>Fannin, Wockhardt UK Ltd</td><td>FP1077</td><td>רכשנו מבית המרקחת האשפוזי של UCH</td></tr><tr><td>SNARF-1 חומצה קרבוקסילית, אצטט, Succinimidyl Ester - אריזה מיוחדת</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>SS22801</td><td>השתמש בכפפות</td></tr><tr><td>5-(ו-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>C1272</td><td>השתמש בכפפות</td></tr><tr><td>Vivaglobin אנושי IgG&nbsp; תמיסת 160 מ"ג/מ"ל CSL</td><td> Behring</td><td>התקבל במתנה</td><td>קיימים ספקים שונים קיימים</td></tr><tr><td>סרום עכבר רגיל</td><td>Abcam</td><td>ab7486</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>Lymphoprep (מדיום שיפוע צפיפות)</td> <td>Alere Ltd</td><td>1114547</td><td>שמור על סטרילי והרחק מאור שמש ישיר, ניתן להחליף על ידי Ficoll-Paque</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>רעיל, השתמש בכפפות, ספקים שונים קיימים</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>47036</td><td>רעיל, השתמש בכפפות, קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td>רעיל, השתמש בכפפות, ספקים שונים קיימים</td></tr><tr><td>4-(2-הידרוקסיאתיל) פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית (HEPES)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3375</td><td>קיימים ספקים שונים טריס</td></tr><tr><td>(הידרוקסימתיל) אמינומתאן (טריס)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1503&nbsp;</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט (MgSO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>שונים קיימים ספקים</td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>2860</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>דיפנילן יודוניום (DPI)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D2926</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>אבץ כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>208086</td><td>קיימים ספקים שונים, אין לדלל במאגרים מבוססי פוספט מכיוון שהוא יזרז</td></tr><tr><td>פולי ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P4707</td><td>קיימים ספקים שונים</td></tr><tr><td>סריקת לייזר קונפוקלית מיקרוסקופ (Zeiss LSM 700)</td><td>קארל זייס</td><td></td><td>המיקרוסקופ חייב להיות מסוגל לרגש ב-555 ננומטר ולמדוד פליטה בשני ערוצים בו זמנית (560-600 ננומטר, >610 ננומטר)</td></tr><tr><td>איבידי ומיקרו שקופית 8 היטב ibiTreat</td><td>Thistle Scientific</td><td>IB-80826</td><td>ניתן להחליף צלחות הדמיה מתאימות אחרות</td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>כל סוניקטור מתאים יספיק</td></tr><tr><td>TC20 מונה תאים אוטומטי</td><td>BioRad</td><td></td><td>קיימים</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל חלבון LoBind צינורות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td>בשימוש מיוחד כCandida יכול להיצמד לאפנדרפים רגילים</td></tr></tbody></table>

הדמיה נויטרופילים phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור ph ratiometric

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

נויטרופילים הם קריטיים לארח הגנת מולד, וכתוצאה מכך, מהווים תחום חשוב של מחקר רפואי. Phagosome, התא התאי שבו ההרג והעיכול של חלקיקים הציפו להתקיים, הוא הזירה העיקרית הרג הפתוגן נויטרופילים הדורש רגולציה הדוקה. Phagosomal pH הוא היבט אחד כי נשלט בקפידה, בתורו מסדיר פעילות הפרוטאז מיקרוביאלית. רבים ניאון צבעי pH רגיש שימשו כדי להמחיש את הסביבה phagosomal. יש S-1 מספר יתרונות על פני צבעי pH אחרים רגיש, כוללים ספקטרום הפליטה הכפול שלה, עמידותו-הלבנת תמונה, ואת pKa הגבוהה שלה. באמצעות שיטה זו, אנו הוכחנו כי phagosome נויטרופילים הוא אלקליין חריג בהשוואת פגוציטים אחרים. באמצעות הטיות ביוכימיים שונים של הצבע, phagosome ניתן שמסומן מן הציטופלסמה כך ששינויים בגודל ובצורה של phagosome ניתן להעריך. זה מאפשר Fאו ניטור נוסף של תנועה יונית.

איור 1 מציג תצלומי neutrophils ממקורות שונים כדי להדגים סביבות פגוזומליות משתנות. כדי להקל על האנליזה הכמותית, חשוב לזרוע בבארים מספר תאים מתאים: מספר רב מדי יגרום לתאים להערם זה על זה, מה שיקשה על צפייה מדויקת בפגוזומים סגורים; מספר קטן מדי יספק, כמובן, פחות תוצאות, במיוחד מכיוון שלא כל neutrophil יבצע פגוציטוזה. איור 2 הוא תמונה עם רוויית יתר; ניתן להעריך זאת על ידי פיצול התמונה בין שני הערוצים שלה (באמצעות תוכנת המיקרוסקופ המומלצת ברשימת החומרים או תוכנה שו Equivalente) — נקודות אדומות מראות היכן זוהתה פלואורסצנציה מקסימלית. ניתן למנוע זאת על ידי הפחתת עוצמת הלייזר. עקומות כיול המשתמשות במערכות בופר שונות מוצגות באיור 3, המותאם מ-Levine et al.5. פסי השגיאה מראים כי קיימת שונות מסוימת בפלואורסצנציה בין הקריאות. איור 4 נותן דוגמה לאופן שבו ניתן להציג את הנתונים עבור pH ושטח הפגוזום. גישה זו מאפשרת להציג כל מדידה בודדת עם boxplot חופף. עם זאת, ניתן להציג את הנתונים גם בתרשים היסטוגרמה.
<img alt="תמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המראה תגובה תאית רגישה ל-pH עם סולם צבעים, סרגל קנה מידה 10μm." src="/files/ftp_upload/55107/55107fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="איור 1"> 
איור 1: תמונות מצב מייצגות של נויטרופילים מבני אדם ומעכברים. בצד ימין קיצוני מופיע מפתח ויזואלי איכותני של הצבע המקורב של הפגוזומים הצבועים ב-S-1 בהתאמה ל-pH. צבע צהוב מעיד על חומציות גבוהה יותר, בעוד שצבע אדום מעיד על בסיסיות גבוהה יותר. (A) מראה נויטרופילים ממח העצם של עכבר Hvcn1-/- כ-20 min לאחר פגוציטוזה. הפגוזומים נראים אדומים מאוד, בסיסיים ונפוחים. החץ האדום בחלק הימני התחתון של התמונה מצביע על Candida תוך-תאי, בעוד שהחץ בפינה השמאלית העליונה מצביע על חלקיק חוץ-תאי. (B) מראה נויטרופילים ממח העצם של עכבר מסוג wildtype שבצעו פגוציטוזה של Candida; הם הרבה פחות בסיסיים מתאי Hvcn1-/-. (C) מראה נויטרופילים מדם פריפרי של בני אדם באותה נקודת זמן לאחר פגוציטוזה. הם נראים מעט יותר בסיסיים מתאי ה-wildtype של העכבר, אך הפגוזומים עדיין אינם גדולים ואדומים כמו בתאי Hcvn1-/-. (D) מראה נויטרופילים אנושיים שבצעו פגוציטוזה של Candida בנוכחות 5 µM של diphenylene iodonium (DPI). כל הפגוזומים חומציים מאוד, עם pH של 6 או פחות; התרופה מעכבת את ה-NADPH oxidase, ולכן אין תנועת יונים מפצה. הפרוטונים השתחררו מהגרנולות החומציות המתמזגות עם הפגוזום גורמים ל-pH חומצי20, וגיוס מוגבר של V-ATPase לממברנת הפגוזום בעקבות טיפול ב-DPI9. הציטופלזמה נראית גם היא בסיסית יותר בהשוואה לתאים מהתנאים האחרים. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="ניתוח במיקרוסקופיה פלואורסצנטית: דימוי דו-ערוצי, רקונסטרוקציה מורכבת, כימות חלקיקים." src="/files/ftp_upload/55107/55107fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="איור 2"> 
איור 2: רוויה יתרה (Over-saturation) של נויטרופילים ממחית העצם של עכברים Hvcn1-/-. חשוב להחריג מהניתוח תמונות שבהן נתוני הפלואורסצנציה נמצאים ברוויה יתרה. כפי שמתואר בסעיף 5.3, התמונה המורכבת מופעלת כשני דימויים (בפינה השמאלית העליונה, חץ אדום) שבהם שני הערוצים מוצגים בנפרד. בתוכנה זו, כאשר מופעל מצביע הטווח (range indicator) (בפינה השמאלית התחתונה, חץ אדום), כל פיקסל הנמצא ברוויה יתרה יופיע בצבע אדום בוהק. קיימת רוויה יתרה בשני הערוצים (1 ו-2). בחלק התחתון מימין מוצגת הגדלה של מספר תאים ושל Candida חוץ-תאית, עם חצים המצביעים על האזורים המושפעים. ניתוח של נקודות אלו יוביל למדידה רציומטרית שגויה. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="גרף של יחס S-1 מול pH; ניתוח ציטופלזמה, ספונין, tris; השוואת נתונים במחקרים ביוכימיים." src="/files/ftp_upload/55107/55107fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="איור 3"> 
איור 3: עקומות כיול סטנדרטיות להמרת יחסי פלואורסצנציית S-1 למדידות pH. העקומות הסטנדרטיות עבור Candida לבדה בבופרים השונים (מסומנים כ-"Tris") וכאשר התאים הופכים לחדירים באמצעות ספונין ("Saponin") דומות מאוד, מה שמראה כי קריאות ה-S-1 בתוך התא ומחוצה לו (פגוזום ומדיום חוץ-תאי) הן ניתנות להשוואה. פסי השגיאה מייצגים את הממוצע ± SD. עקומת יחס S-1/pH היא קצרה יותר כאשר היא נבדקת בציטופלזמה ("Cytoplasm"), דבר שיש לקחת בחשבון בניתוח התמונות. איור זה עובד מתוך Levine et al.5. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig3large.jpg" target="_blank">יש ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.</a>
<img alt="ניתוח שטח פגוזומים; יחס S-1 לעומת pH, תרשים קופסאות (box plot); מדידות pH תאיות." src="/files/ftp_upload/55107/55107fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="איור 4"> 
איור 4: כימות של pH ושטח הפגוזום. איור זה מציג דוגמה להצגת נתונים. הגרפים הופקו באמצעות תוכנת התכנות R. A: מציג את היחס הפגוזומלי ואת ה-pH התואם עבור A (Hvcn1-/- A: נויטרופילים ממוח עצם של עכבר), B: נויטרופילים ממוח עצם של עכבר מסוג בר (wildtype), C: נויטרופילים מדם פריפריאלי אנושי, ו-D: נויטרופילים אנושיים עם 5 µM DPI n = 3/300. מדידות בודדות מוצגות כריבועים קטנים, כשמעליהם מוצג תרשים קופסה הכולל את החציון ואת הטווח הבינקוויטלי. פס אדום מייצג את הממוצע. כפי שניתן לראות בתמונות ב- איור 1, Hvcn1-/- לתאים יש פגוזומיים בסיסיים מאוד בהשוואה לנייטרופילים של עכברים ובני אדם מסוג בר (wildtype). כמו כן, יש להם שטח פגוזומי גדול יותר (איור 4B, n = 3/300). פגוזומים של נויטרופילים אנושיים הם בסיסיים יותר במעט וגדולים יותר מאלו של נויטרופילים של עכברים מסוג פרא (wildtype), בעוד שלנויטרופילים אנושיים שהודגרו עם DPI יש פגוזומים חומציים מאוד וקטנים. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.</a>
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">בופר תמיסת מלחים מאוזנת (BSS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>156 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1.25 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">pH 7.4 באמצעות NaOH או HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">מצע YPD נוזלי</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD broth</td>
			<td>50 g</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מים מזוקקים</td>
			<td>1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">סטריליזציה באוטוקלב ב-121 °C למשך 15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">עבור אגר YPD: לפני הסטריליזציה באוטוקלב יש להוסיף 15 g/L אגר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">תמיסת דקסטראן 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran בדרגה קלינית</td>
			<td></td>
			<td>50 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td>4.5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מים מזוקקים</td>
			<td></td>
			<td>500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">יש להעביר לבקבוק זכוכית ולסטריליזציה באוטוקלב ב-121 °C למשך 15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">תמיסת מלח 2x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td>18 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מים מזוקקים</td>
			<td></td>
			<td>1 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">יש להעביר לבקבוק זכוכית ולסטריליזציה באוטוקלב ב-121 °C למשך 15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">מלאי ספונין 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>בופר BSS</td>
			<td></td>
			<td>50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td></td>
			<td>5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">יש לחמם את בופר BSS ל-37 °C, להוסיף ספונין ולערבב.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">יש להוסיף 0.1% sodium azide כחומר משמר, ולשמור את התערובת ב-4 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">בופרי כיול</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">עקומת סטנדרט ל-Candida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ראשית יש להכין תמיסות מלאי בריכוז 0.15 M עבור כל בופר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">יש להכין תמיסת NaCl בריכוז 0.15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">נפח סופי של 15 mL: 5 mL של תמיסת הבופר הרצויה בריכוז 0.15 M + 10 mL תמיסת NaCl בריכוז 0.15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 3</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM glycine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 4</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM acetate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 5</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM acetate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 6</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM acetate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 8</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 9</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM glycine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 11</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM phosphate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 12</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM phosphate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 13</td>
			<td>100 mM NaCl</td>
			<td>50 mM phosphate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">עקומת סטנדרט ציטוזולית</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">יש להשתמש בתמיסות בופר מלאי 0.15 M שהוכנו קודם לכן</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">יש להכין תמיסת KCl בריכוז 0.15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">נפח סופי של 15 mL: 5 mL של הבופר הרצוי בריכוז 0.15 M + 10 mL תמיסת KCl בריכוז 0.15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">מלאי של nigericin בריכוז 10 mM באתנול; יש להוסיף 15 µL לכל תמיסה בנפח הסופי</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 3</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM glycine</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 4</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM acetate</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 5</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM acetate</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 6</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM acetate</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 8</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 9</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM Tris</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM glycine</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 11</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM phosphate</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 12</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM phosphate</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 13</td>
			<td>100 mM KCl</td>
			<td>50 mM phosphate</td>
			<td>10 µM nigericin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">יש להביא את כל תמיסות הכיול ל-pH הרצוי באמצעות HCl או NaOH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: הרכב התמיסות המגבחות (buffers). טבלה זו מתארת את ההרכבים המתאימים של התמיסות השונות המשמשות בפרוטוקול.

קובץ קוד נלווה. קובץ זה מכיל מספר מאקרו-ים, שנכתבו על ידי A. P. Levine, הנחוצים לניתוח תמונות. המחברים ישמחו לנסות ולהשיב על כל שאלה הקשורה לשימוש בקוד זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55107/Phagosomal_measurement.txt" target="_blank">אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.</a>

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה למדידת ה-pH והשטח הפגוזומלי וכן את ה-pH הציטופלזמי של נויטרופילים אנושיים ועכברים באמצעות האינדיקטור היחסי seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, או S-1. זה מושג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של תאים חיים וניתוח תמונה.

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

המטרה הכללית של טכניקת מיקרוסקופיה קונפוקאלית זו היא הדמיה של ה-pH והשטח של הוואקואולה הפגוציטית של נויטרופילים והציטופלזמה. שיטה זו מאפשרת ניטור וכימות של שינויים דינמיים ב-pH בוואקואולה הפגוציטית ובציטופלזמה, וכן של נפח הוואקואולה הפגוציטית. מדידות אלו משתנות בהתאם לפעילות של NADPH oxydase, ויכולות לשמש כסממנים חלופיים לתפקודה ולזרימות יונים דרך ממברנת הוואקואולה הפגוציטית.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לצלם בו-זמנית הן את הפגוזום והן את הציטופלזמה באמצעות צבע בעל טווח pH רחב. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכינו מנה (aliquot) של carboxy-S-1 succinimidyl ester על ידי דילול של 50 micrograms ממנו ב-100 microliters של DMSO בדרג גבוה. ערבבו היטב באמצעות וורטקס.בשלב הבא, הכינו מיליליטר אחד של 10⁸ Candida שהורגה בחום (HK) בריכוז פי 1 בתוך 0.1 M נתרן ביקרבונט בשפופרת של 15 מיליליטר. הוסיפו 100 µL של carboxy-S-1 טיפה אחר טיפה ל-HK Candida תוך כדי ערבוב במכשיר vortex במהירות של 2,000 RPM. לאחר מכן, עטפו את השפופרת בנייר אלומיניום והניחו אותה על גלגל סיבוב (roller) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.לאחר שעה, שטפו את ה-HKC-S-1 שלוש פעמים באמצעות סנטריפוגציה במהירות של 2,250 times g למשך 10 דקות בכל פעם. בשתי השטיפות הראשונות, השעיכו את המשקע ב-15 milliliters של נתרן ביקרבונט 0.1 molar. לאחר השטיפה השלישית, השעיכו אותו ב-one milliliter של בופר BSS.העבירו את תרחיף ה-HKC-S-1 למבחנות במנות של 100 µL ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20- °C. לצורך אופסוניזציה של HKC-S-1 עבור נויטרופילים אנושיים, הוסיפו 100 µL של סרום IGG אנושי ל-100 µL של HKC-S-1 שהופשר. ערבבו באמצעות שייקר מחומם בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 1,000 RPM למשך 60 עד 90 דקות, ולאחר מכן על גלגל סיבוב (roller), בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים.לאחר מכן, שטפו את הדגימה שלוש פעמים בבופר BSS באמצעות צנטריפוגציה ב-17,000 ×g למשך דקה אחת בכל פעם. לאחר מכן, השעיכו מחדש את הדגימה ב-100 µL של בופר BSS. עבור נויטרופילים מדם פריפריאלי אנושי, קחו 15 mL דם באמצעות דקירה של וריד מתורם בריא והעבירו אותם למזרק של 20 mL המכיל 90 µL של תמיסת heparin sodium בריכוז 1,000 IU למילליטר.בעזרת טיפ של פיפט, הזרק 1.5 milliliters של תמיסת dextran בריכוז 10% למזריק. הפוך אותו בעדינות שלוש פעמים ולאחר מכן השאר אותו בעמידה על המworkbench למשך 30 עד 60 דקות. לאחר 30 עד 60 דקות, הדם אמור להיפרד בקירוב לשני חלקים: שכבת buffy coat בצבע קש בחלק העליון ושכבה תחתונה המכילה erythrocytes.דחפו בזהירות את השכבה העליונה דרך מחט או הסירו אותה בעזרת טיפ של פפית, ולאחר מכן העבירו אותה למבחנה של 15 milliliter תוך הימנעות מהוצאת השכבה האדומה. בעזרת פפית של חמישה milliliter, הוסיפו שלושה עד ארבעה milliliters של מדיום למעבר צפיפות לתחתית המבחנה, מתחת לשכבת ה-buffy coat, כדי להשיג שתי שכבות מובחנות. לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-900 ×g למשך 10 דקות.שפכו את הנוזל העליון והשאירו את המשקע האדום. לאחר מכן, בצעו ערבוב עדין במכשיר וורטקס (vortex) כדי לפורר את המשקע. בשלב הבא, הוסיפו שבעה מיליליטרים של מים מזוקקים שעברו עיקור באוטוקלאב למשקע, והפכו את המבחנה במשך 20 שניות כדי להחזיר את המשקע למצב של תליה (re-suspend).לאחר מכן, הוסיפו שבעה מיליליטרים של 2x saline והפכו את המבחנה מספר פעמים לערבוב, כדי ללקות את תאי הדם האדומים שנותרו, ולאחר מכן סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך חמש דקות. שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) בבופר BSS עד לריכוז של כ-4 × 10⁶ למילליטר. בהליך זה, טפלו מראש בלוחית מיקרוסקופיה בעלת שמונה בארות באמצעות 200 µL של poly-L-lysine בכל בארה למשך 40 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את ה-poly-L-lysine ושטפו את הבארות פעמיים עם 200 µL של מים מזוקקים.בשלב הבא, העבירו 200 µL של תרחיף התאים שהוכן לכל באר והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, הכינו מנה של S-1-AM ester על ידי הוספת 100 µL של DMSO בדרגת טוהר גבוהה למבחנה וערבבו באמצעות וורטקס. למבחנה קטנה, הוסיפו 1.7 mL של בופר BSS ו-20 µL של S-1-AM וערבבו את התערובת באמצעות וורטקס.לאחר מכן, שטפו את הבארים פעמיים עם 200 microliters של בופר BSS והחליפו את הבופר בתמיסת S-1-AM. הימנעו מהפרעה לשכבת התאים (monolayer) ההצמודה לתחתית הבאר על ידי העברת הנוזל בעדינות לאורך דפנות הבארים באמצעות פפטה. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות לפחות.לאחר מכן, שטפו את הבארים פעמיים עם 200 microliters של בופר BSS. כדי לבחון מעכב, הכינו תערובת מאסטר של התרופה המתאימה בבופר BSS ושטפו את הבארים פעמיים בעזרתה. לאחר מכן, בצעו סוניקציה ל-HKC-S-1 שעבר אופסוניזציה למשך כשלוש שניות ב-five microns והוסיפו 10 microliters ממנו לכל באר, ואז הדגירו את הפלטה ב-37 degrees Celsius למשך 15 עד 20 דקות, כדי להכין את התאים לצילום תמונות של פגוציטוזה.באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי,כוון את אורך גל הלייזר כך שהתאים יעוררו ב-555 nanometers והפליטה תגולש על ידי שני גלאים ב-560 עד 600 nanometers, ומעל 610 nanometers. לאחר מכן, צפה בתאים באמצעות עדשת שמן 63X. השתמש בסריקת אריחים (tile scan) בהגדרה רציפה כדי לצפות באריח המרכזי.באמצעות עוצמת הפלואורסצנציה וההגבר (gain) של ערוצי הגילוי, התאימו את הפוקוס ועוצמת הלייזר ואת ההגבר של שני הערוצים כדי להבטיח תמונה אופטימלית. לאחר מכן, פצלו את התמונה באמצעות ההגדרות כדי לצפות בשני הערוצים. לפני תחילת הניסוי, ודאו שאין רוויה של עוצמת הפלואורסצנציה בציטופלזמה או בוואקואולות, אשר תופיע כנקודות אדומות.אם כן, הפחיתו את עוצמת הלייזר כך שיהיה מספר מינימלי של נקודות אדומות, אך התאים והפאגוזומים יהיו בהירים וברורים מספיק כדי להיראות. בהליך זה, פתחו את ImageJ וטענו לסרגל הכלים את קובץ התמונה שנבחר לניתוח. כדי לשלב את שני הערוצים, השתמשו ב-Image, לאחר מכן Color, ואז Make Composite.לחצו קליק ימני כדי לבחור קובץ לשמירת התוצאות. לאחר מכן, לחצו על כלי הקו (Line Tool) בסרגל הכלים ולחצו פעמיים כדי להגדיל את העובי לשניים. שרטטו קו לרוחב פגוזום (phagosome), ואז לחצו קליק ימני למדידת ה-pH.ניתן למדוד את ה-pH הציטופלזמי באותו אופן על ידי שרטוט קו על פני הציטופלזמה. לאחר סיום המדידות, לחצו עם המקש הימני כדי לבחור ב-Save File. כדי למדוד את שטח הפגוזום, השתמשו באייקון הרביעי בסרגל הכלים כדי לשרטט באופן חופשי סביב האזור.לאחר מכן, לחצו קליק ימני כדי לבחור ב-Measure Area. להלן מפתח ויזואלי איכותי של הצבע המקורב של הפגוזומים שצבעו ב-S-1, בהתאם ל-pH. צבע צהוב מעיד על חומציות גבוהה יותר, בעוד שצבע אדום מעיד על בסיסיות גבוהה יותר.תמונה זו מציגה נויטרופילים ממוח של עכבר החסרים את תעל Hvcn1 כ-20 דקות לאחר פגוציטוזה. הפגוזומים נראים אדומים מאוד, בסיסיים ונפוחים. החץ האדום כאן מצביע על Candida תוך-תאית, בעוד שחץ זה מצביע על Candida חוץ-תאית.תמונה זו מציגה נויטרופילים ממחולל גרמיים של עכברים מסוג בר שבלעו Candida. הם פחות בסיסיים בהרבה מאשר נויטרופילים עם מחיקת הגן Hvcn1. תמונה זו מציגה נויטרופילים מדם פריפרי של בני אדם באותה נקודת זמן לאחר הפגוציטוזה.הן נראות בסיסיות מעט יותר מתאי הסוג הפראי של העכבר, אך הפגוזומים עדיין אינם גדולים ואדומים כמו בתאי ה-Hvcn1 knockout, ותמונה זו מראה נויטרופילים אנושיים שביצעו פגוציטוזה של Candida בנוכחות 5 µM של diphenylene iodonium. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה עד חמישה שעות בקירוב, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקוט זהירות בזמן בידוד הנויטרופילים כדי שלא יופעלו.כדי לקבוע אם ההשפעות הנצפות בשינויים ב-pH של הוואקואולה או של הצイトזול, או בנפח הוואקואולרי, נובעות משינויים בפרץ נשימתי (respiratory burst), ניתן למדוד את הפרץ הנשימתי בדרכים אחרות המודדות באופן ישיר ייצור רדיקלים חופשיים או צריכת חמצן. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן בידוד נויטרופילים אנושיים, ולאחר מכן צביעה והדמיה של הפגוזום והציטופלזמה. זכרו כי עבודה עם דגימות דם אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות ולבישת ביגוד מגן, בעת ביצוע הליך זה.

imaging-neutrophil-phagosome-cytoplasm-using-ratiometric-ph

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מראים, כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לצורך השגחה של הדינמיקה של גרנולוציטים נויטרופילים בריאות נגוע בזמן שהם phagocytose פתוגנים או לייצר מלכודות תאי נויטרופילים (סלים).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

סרטון זה מדגים בדיקה לניטור אירועי פגוציטוזה עצמאיים של תאי דם אדומים בתיווך מקרופאגים (RBC). אימונוגלובולינים של עכברים G (IgG)-opsonized RBCs אנושיים מודגרים עם מקרופאגים של עכברים ונצפים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. ה-RBCs נבלעים על ידי מקרופאגים דרך היווצרות גביע פגוציטי וממוקדים לפירוק ליזוזומלי.

הדמיה בזמן אמת של מקרופאגים פגוציטוזה של תאי דם אדומים מסוג IgG

סרטון וידאו זה מדגים טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת ברזולוציה גבוהה (TIRF) להדמיה בזמן אמת של היווצרות וסגירת פאגוזומים במהלך פגוציטוזה בתיווך מקרופאגים של תאי דם אדומים מסוג IgG (RBCs) המחוברים לפני השטח של צלחת תחתית זכוכית. המקרופאגים מרחיבים את הפסאודופודיה סביב ה-RBCs ובולעים אותם בתוך הפאגוזומים, ומנתקים אותם מפני השטח של הזכוכית.

הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF של היווצרות וסגירת פגוזום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות פגוציטוזיס של חלקיקים פלואורסצנטיים על ידי קו תאי מקרופאגים דבק בשיטה פלואורומטרית. שיטה זו מאפשרת כימות תפוקה גבוהה של הפנמת חלקיקים כמו גם פילמור האקטין המתקבל.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

pH פגוזומי משפיע על התבגרות הפגוזומים, ייצור מחמצן, הרג פגוזומי וכן הצגת אנטיגן. כאן אנו מתארים שיטה רציומטרית למדידת שינויי pH במהלך הזמן ובנקודת הקצה בפאגוזומים בודדים בפגוציטים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מתארים מערך ניסיוני להמחשה עם היווצרות וסגירה חסרת תקדים של פגוזומים ברזולוציה גבוהה בתלת מימד במקרופאגים חיים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת. הוא מאפשר ניטור של בסיס הכוס הפגוציטית, הפסאודופודים המתרחבים, כמו גם המיקום המדויק של החתך הפגוזומי.

&quot;Assay סגירת Phagosome&quot; לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

כאן אנו מתארים טכניקה מבוססת מיקרוסקופ כדי להמחיש ולכמת את מפלי האירועים המוקדמים במהלך פגוציטוזיס של פתוגנים כגון הפטריות קנדידה אלביקנס וחלקיקים הגדולים מ-0.5 מיקרומטר כולל חרוזים מצופים זימוזאן ו-IgG.

חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להעריך פעילות אנטי-פטרייתית של תאי מערכת חיסון אנושיים עיקריים בזמן אמת באמצעות נבגי כתב ניאון אספרגילוס בשיתוף עם מיקרוסקופ וידאו חי התאים cytometry זרימה. נתונים המופקים לספק תובנה אינטראקציות אספרגילוס cell- מארח כגון פעילות קוטלת פטריות, phagocytosis, נדידת תאים ועיכוב של גידול פטרייתי.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

למדו למדוד את pH הפאגוזום והציטופלזמה בנייטרופילים אנושיים ומכרסמים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית וצבע SNARF-1. שיטה זו מאפשרת ניטור שינויים דינמיים בנפח ובחומציות הוואקולה הפאגוציטית.

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

גלה סרטונים נוספים