הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

המטרה הכללית של טכניקת מיקרוסקופיה קונפוקאלית זו היא הדמיה של ה-pH והשטח של הוואקואולה הפגוציטית של נויטרופילים והציטופלזמה. שיטה זו מאפשרת ניטור וכימות של שינויים דינמיים ב-pH בוואקואולה הפגוציטית ובציטופלזמה, וכן של נפח הוואקואולה הפגוציטית. מדידות אלו משתנות בהתאם לפעילות של NADPH oxydase, ויכולות לשמש כסממנים חלופיים לתפקודה ולזרימות יונים דרך ממברנת הוואקואולה הפגוציטית.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לצלם בו-זמנית הן את הפגוזום והן את הציטופלזמה באמצעות צבע בעל טווח pH רחב. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכינו מנה (aliquot) של carboxy-S-1 succinimidyl ester על ידי דילול של 50 micrograms ממנו ב-100 microliters של DMSO בדרג גבוה. ערבבו היטב באמצעות וורטקס.

בשלב הבא, הכינו מיליליטר אחד של 10⁸ Candida שהורגה בחום (HK) בריכוז פי 1 בתוך 0.1 M נתרן ביקרבונט בשפופרת של 15 מיליליטר. הוסיפו 100 µL של carboxy-S-1 טיפה אחר טיפה ל-HK Candida תוך כדי ערבוב במכשיר vortex במהירות של 2,000 RPM. לאחר מכן, עטפו את השפופרת בנייר אלומיניום והניחו אותה על גלגל סיבוב (roller) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

לאחר שעה, שטפו את ה-HKC-S-1 שלוש פעמים באמצעות סנטריפוגציה במהירות של 2,250 times g למשך 10 דקות בכל פעם. בשתי השטיפות הראשונות, השעיכו את המשקע ב-15 milliliters של נתרן ביקרבונט 0.1 molar. לאחר השטיפה השלישית, השעיכו אותו ב-one milliliter של בופר BSS.

העבירו את תרחיף ה-HKC-S-1 למבחנות במנות של 100 µL ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20- °C. לצורך אופסוניזציה של HKC-S-1 עבור נויטרופילים אנושיים, הוסיפו 100 µL של סרום IGG אנושי ל-100 µL של HKC-S-1 שהופשר. ערבבו באמצעות שייקר מחומם בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 1,000 RPM למשך 60 עד 90 דקות, ולאחר מכן על גלגל סיבוב (roller), בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים.

לאחר מכן, שטפו את הדגימה שלוש פעמים בבופר BSS באמצעות צנטריפוגציה ב-17,000 ×g למשך דקה אחת בכל פעם. לאחר מכן, השעיכו מחדש את הדגימה ב-100 µL של בופר BSS. עבור נויטרופילים מדם פריפריאלי אנושי, קחו 15 mL דם באמצעות דקירה של וריד מתורם בריא והעבירו אותם למזרק של 20 mL המכיל 90 µL של תמיסת heparin sodium בריכוז 1,000 IU למילליטר.

בעזרת טיפ של פיפט, הזרק 1.5 milliliters של תמיסת dextran בריכוז 10% למזריק. הפוך אותו בעדינות שלוש פעמים ולאחר מכן השאר אותו בעמידה על המworkbench למשך 30 עד 60 דקות. לאחר 30 עד 60 דקות, הדם אמור להיפרד בקירוב לשני חלקים: שכבת buffy coat בצבע קש בחלק העליון ושכבה תחתונה המכילה erythrocytes.

דחפו בזהירות את השכבה העליונה דרך מחט או הסירו אותה בעזרת טיפ של פפית, ולאחר מכן העבירו אותה למבחנה של 15 milliliter תוך הימנעות מהוצאת השכבה האדומה. בעזרת פפית של חמישה milliliter, הוסיפו שלושה עד ארבעה milliliters של מדיום למעבר צפיפות לתחתית המבחנה, מתחת לשכבת ה-buffy coat, כדי להשיג שתי שכבות מובחנות. לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-900 ×g למשך 10 דקות.

שפכו את הנוזל העליון והשאירו את המשקע האדום. לאחר מכן, בצעו ערבוב עדין במכשיר וורטקס (vortex) כדי לפורר את המשקע. בשלב הבא, הוסיפו שבעה מיליליטרים של מים מזוקקים שעברו עיקור באוטוקלאב למשקע, והפכו את המבחנה במשך 20 שניות כדי להחזיר את המשקע למצב של תליה (re-suspend).

לאחר מכן, הוסיפו שבעה מיליליטרים של 2x saline והפכו את המבחנה מספר פעמים לערבוב, כדי ללקות את תאי הדם האדומים שנותרו, ולאחר מכן סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך חמש דקות. שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) בבופר BSS עד לריכוז של כ-4 × 10⁶ למילליטר. בהליך זה, טפלו מראש בלוחית מיקרוסקופיה בעלת שמונה בארות באמצעות 200 µL של poly-L-lysine בכל בארה למשך 40 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את ה-poly-L-lysine ושטפו את הבארות פעמיים עם 200 µL של מים מזוקקים.

בשלב הבא, העבירו 200 µL של תרחיף התאים שהוכן לכל באר והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, הכינו מנה של S-1-AM ester על ידי הוספת 100 µL של DMSO בדרגת טוהר גבוהה למבחנה וערבבו באמצעות וורטקס. למבחנה קטנה, הוסיפו 1.7 mL של בופר BSS ו-20 µL של S-1-AM וערבבו את התערובת באמצעות וורטקס.

לאחר מכן, שטפו את הבארים פעמיים עם 200 microliters של בופר BSS והחליפו את הבופר בתמיסת S-1-AM. הימנעו מהפרעה לשכבת התאים (monolayer) ההצמודה לתחתית הבאר על ידי העברת הנוזל בעדינות לאורך דפנות הבארים באמצעות פפטה. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות לפחות.

לאחר מכן, שטפו את הבארים פעמיים עם 200 microliters של בופר BSS. כדי לבחון מעכב, הכינו תערובת מאסטר של התרופה המתאימה בבופר BSS ושטפו את הבארים פעמיים בעזרתה. לאחר מכן, בצעו סוניקציה ל-HKC-S-1 שעבר אופסוניזציה למשך כשלוש שניות ב-five microns והוסיפו 10 microliters ממנו לכל באר, ואז הדגירו את הפלטה ב-37 degrees Celsius למשך 15 עד 20 דקות, כדי להכין את התאים לצילום תמונות של פגוציטוזה.

באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי,כוון את אורך גל הלייזר כך שהתאים יעוררו ב-555 nanometers והפליטה תגולש על ידי שני גלאים ב-560 עד 600 nanometers, ומעל 610 nanometers. לאחר מכן, צפה בתאים באמצעות עדשת שמן 63X. השתמש בסריקת אריחים (tile scan) בהגדרה רציפה כדי לצפות באריח המרכזי.

באמצעות עוצמת הפלואורסצנציה וההגבר (gain) של ערוצי הגילוי, התאימו את הפוקוס ועוצמת הלייזר ואת ההגבר של שני הערוצים כדי להבטיח תמונה אופטימלית. לאחר מכן, פצלו את התמונה באמצעות ההגדרות כדי לצפות בשני הערוצים. לפני תחילת הניסוי, ודאו שאין רוויה של עוצמת הפלואורסצנציה בציטופלזמה או בוואקואולות, אשר תופיע כנקודות אדומות.

אם כן, הפחיתו את עוצמת הלייזר כך שיהיה מספר מינימלי של נקודות אדומות, אך התאים והפאגוזומים יהיו בהירים וברורים מספיק כדי להיראות. בהליך זה, פתחו את ImageJ וטענו לסרגל הכלים את קובץ התמונה שנבחר לניתוח. כדי לשלב את שני הערוצים, השתמשו ב-Image, לאחר מכן Color, ואז Make Composite.

לחצו קליק ימני כדי לבחור קובץ לשמירת התוצאות. לאחר מכן, לחצו על כלי הקו (Line Tool) בסרגל הכלים ולחצו פעמיים כדי להגדיל את העובי לשניים. שרטטו קו לרוחב פגוזום (phagosome), ואז לחצו קליק ימני למדידת ה-pH.

ניתן למדוד את ה-pH הציטופלזמי באותו אופן על ידי שרטוט קו על פני הציטופלזמה. לאחר סיום המדידות, לחצו עם המקש הימני כדי לבחור ב-Save File. כדי למדוד את שטח הפגוזום, השתמשו באייקון הרביעי בסרגל הכלים כדי לשרטט באופן חופשי סביב האזור.

לאחר מכן, לחצו קליק ימני כדי לבחור ב-Measure Area. להלן מפתח ויזואלי איכותי של הצבע המקורב של הפגוזומים שצבעו ב-S-1, בהתאם ל-pH. צבע צהוב מעיד על חומציות גבוהה יותר, בעוד שצבע אדום מעיד על בסיסיות גבוהה יותר.

תמונה זו מציגה נויטרופילים ממוח של עכבר החסרים את תעל Hvcn1 כ-20 דקות לאחר פגוציטוזה. הפגוזומים נראים אדומים מאוד, בסיסיים ונפוחים. החץ האדום כאן מצביע על Candida תוך-תאית, בעוד שחץ זה מצביע על Candida חוץ-תאית.

תמונה זו מציגה נויטרופילים ממחולל גרמיים של עכברים מסוג בר שבלעו Candida. הם פחות בסיסיים בהרבה מאשר נויטרופילים עם מחיקת הגן Hvcn1. תמונה זו מציגה נויטרופילים מדם פריפרי של בני אדם באותה נקודת זמן לאחר הפגוציטוזה.

הן נראות בסיסיות מעט יותר מתאי הסוג הפראי של העכבר, אך הפגוזומים עדיין אינם גדולים ואדומים כמו בתאי ה-Hvcn1 knockout, ותמונה זו מראה נויטרופילים אנושיים שביצעו פגוציטוזה של Candida בנוכחות 5 µM של diphenylene iodonium. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה עד חמישה שעות בקירוב, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקוט זהירות בזמן בידוד הנויטרופילים כדי שלא יופעלו.

כדי לקבוע אם ההשפעות הנצפות בשינויים ב-pH של הוואקואולה או של הצイトזול, או בנפח הוואקואולרי, נובעות משינויים בפרץ נשימתי (respiratory burst), ניתן למדוד את הפרץ הנשימתי בדרכים אחרות המודדות באופן ישיר ייצור רדיקלים חופשיים או צריכת חמצן. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן בידוד נויטרופילים אנושיים, ולאחר מכן צביעה והדמיה של הפגוזום והציטופלזמה. זכרו כי עבודה עם דגימות דם אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות ולבישת ביגוד מגן, בעת ביצוע הליך זה.