הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה למדידת ה-pH והשטח הפגוזומלי וכן את ה-pH הציטופלזמי של נויטרופילים אנושיים ועכברים באמצעות האינדיקטור היחסי seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, או S-1. זה מושג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של תאים חיים וניתוח תמונה.

המטרה הכוללת של טכניקת מיקרוסקופיה קונפוקלית זו היא לדמות את ה-pH והאזור של הוואקואול הנויטרופילי הפגוציטי והציטופלזמה. שיטה זו מאפשרת ניטור וכימות של שינויים דינמיים ב-pH בוואקואול הפגוציטי ובציטופלזמה, וכן בנפח הוואקואול הפגוציטי. מדידות אלו משתנות עם הפעילות של NADPH oxydase, ויכולות לשמש כסמנים חלופיים לתפקודו ולשטפי יונים על פני הממברנה של הוואקואול הפגוציטי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמות בו זמנית גם את הפגוזום וגם את הציטופלזמה עם צבע בעל טווח pH רחב. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו מנה של אסטר סוקסינימידיל קרבוקסי-S-1 על ידי דילול של 50 מיקרוגרם ממנו ב-100 מיקרוליטר של DMSO בדרגה גבוהה. מערבל אותו היטב כדי לערבב.

לאחר מכן, הכינו מיליליטר אחד של אחד כפול 10 עד החום השמיני שנהרג או HK קנדידה בנתרן ביקרבונט 0.1 מולרי בשפופרת של 15 מיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטר של קרבוקסי-S-1 טיפה אחת בכל פעם ל-HK Candida תוך ערבוב על מערבולת ב-2,000 סל"ד. לאחר מכן, עטפו את הצינור בנייר אלומיניום והניחו אותו על גלגלת בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר שעה יש לשטוף את ה- HKC-S-1 שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה ב -2, 250 פעמים גרם למשך 10 דקות בכל פעם. בשתי השטיפות הראשונות, השעו מחדש את הגלולה ב -15 מיליליטר של 0.1 נתרן ביקרבונט מולרי. לאחר הכביסה השלישית, השעו אותו מחדש במיליליטר אחד של מאגר BSS.

העבירו את תרחיף HKC-S-1 לצינורות של 100 מיקרוליטר ואחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להפוך את HKC-S-1 לנויטרופילים אנושיים, הוסף 100 מיקרוליטר של סרום IGG אנושי ל-100 מיקרוליטר של HKC-S-1 מופשר. מערבבים אותו על שייקר חום בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -1, 1000 סל"ד למשך 60 עד 90 דקות, ולאחר מכן על רולר, בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן, שטפו את הדגימה שלוש פעמים במאגר BSS על ידי צנטריפוגה ב-17,000 פעמים גרם למשך דקה אחת כל אחת. לאחר מכן, השעו מחדש את הדגימה ב-100 מיקרוליטר של מאגר BSS. עבור נויטרופילים בדם היקפי אנושי, קחו 15 מיליליטר דם על ידי ניקור ורידים מתורם בריא והעבירו אותו למזרק של 20 מיליליטר המכיל 90 מיקרוליטר של תמיסת נתרן הפרין ב-1,000 יחב"ל למיליליטר.

בעזרת קצה פיפטה, הזריקו 1.5 מיליליטר של תמיסת דקסטרן 10% למזרק. הפוך אותו בעדינות שלוש פעמים ולאחר מכן השאר אותו עומד זקוף על הספסל למשך 30 עד 60 דקות. לאחר 30 עד 60 דקות, הדם אמור להתפצל בערך לשניים, עם שכבת מעיל באפי עליונה בצבע קש ושכבה תחתונה המכילה אריתרוציטים.

דחפו בזהירות את השכבה העליונה דרך מחט או הסירו אותה בעזרת קצה פיפטה, ואז העבירו אותה לצינור של 15 מיליליטר והימנעו מהוצאת השכבה האדומה. בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר, הוסף שלושה עד ארבעה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לתחתית הצינור, מתחת לשכבת המעיל של באפי, כדי לקבל שתי שכבות נפרדות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב 900 פעמים גרם למשך 10 דקות.

יוצקים את הסופרנטנט ומשאירים את הכדור האדום מאחור. לאחר מכן, מערבולת בעדינות כדי להפריע לכדור. לאחר מכן, הוסף שבעה מיליליטר מים מזוקקים לכדור והפוך אותו למשך 20 שניות כדי להשעות מחדש את הגלולה.

לאחר מכן, הוסיפו שבעה מיליליטר של מי מלח פי 2 והפכו אותו כמה פעמים לערבוב, תוך ליסטרציה של כדוריות הדם האדומות הנותרות, ואז צנטריפוגה של הדגימה ב-300 פעמים גרם למשך חמש דקות. שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במאגר BSS בערך פי ארבע פעמים 10 עד השישית למיליליטר. בהליך זה, יש לטפל מראש בצלחת מיקרוסקופיה של שמונה בארות עם 200 מיקרוליטר פולי-ליזין בכל באר למשך 40 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר, ואז להסיר את הפולי-L-ליזין ולשטוף את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר מים מזוקקים.

לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר מתרחיף התאים המוכן לכל באר ודגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, הכינו מנה של אסטר S-1-AM על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של DMSO בדרגה גבוהה לצינור ומערבולת לערבוב. בצינור קטן מוסיפים 1.7 מיליליטר של מאגר BSS ו -20 מיקרוליטר S-1-AM ומערבלים את התערובת.

לאחר מכן, שטפו את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר BSS והחליפו את המאגר בתמיסת S-1-AM. הקפד לא להפריע לשכבת התא החד-שכבתית המחוברת לקרקעית הבאר על ידי פיפטינג עדין של הנוזל במורד דופן הבארות. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות לפחות.

לאחר מכן, שטפו את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר BSS. כדי לבדוק מעכב, הרכיבו תערובת מאסטר של התרופה המתאימה במאגר BSS ושטפו איתה את הבארות פעמיים. לאחר מכן, סוניקציה של ה-HKC-S-1 האופסוני למשך כשלוש שניות בחמישה מיקרון והוסף 10 מיקרוליטר ממנו לכל באר, ואז דגר על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות, מה שהופך את התאים מוכנים להדמיה לצילומי בזק של פגוציטוזיס.

בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי, התאימו את אורך גל הלייזר כך שהתאים יתרגשו ב-555 ננומטר והפליטה מזוהה על ידי שני גלאים ב-560 עד 600 ננומטר, ומעל 610 ננומטר. לאחר מכן, הצג את התאים באמצעות עדשת טבילה בשמן 63X. השתמש בתמונת סריקת אריחים בהגדרה רציפה כדי להציג את האריח המרכזי.

באמצעות עוצמת הקרינה והרווח של ערוצי הגלאים, התאם את המיקוד והעוצמה של הלייזר ואת הרווח של שני הערוצים כדי לייעל את התמונה. לאחר מכן, פצל את התמונה באמצעות ההגדרות כדי להציג את שני הערוצים. לפני תחילת הניסוי יש לבדוק שאין רוויה של עוצמת הקרינה בציטופלזמה או בוואקואולים, שיופיעו כנקודות אדומות.

אם כן, הפחיתו את עוצמת הלייזר כך שיהיה מספר מינימלי של נקודות אדומות, אולם התאים והפגוזומים בהירים וברורים מספיק כדי לראות. בהליך זה, פתח את ImageJ וטען את קובץ התמונה שנבחר לניתוח בסרגל הכלים. כדי לשלב את שני הערוצים, השתמש/י ב״תמונה״, ״צבע״ ולאחר מכן ״הפוך לקומפוזיציה״.

לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור קובץ לאחסון התוצאות. לאחר מכן, לחץ על כלי הקו בסרגל הכלים ולחץ פעמיים כדי להגדיל את הרוחב לשניים. צייר קו לרוחב של פגוזום ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי למדוד את ה-pH.

ניתן למדוד pH ציטופלזמי באותו אופן על ידי ציור קו על פני הציטופלזמה. לאחר סיום המדידות, לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור שמור קובץ. כדי למדוד את אזור הפגוזום, השתמש בסמל הרביעי לאורך סרגל הכלים כדי לצייר ביד חופשית סביב האזור.

לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור אזור מדידה. להלן מפתח חזותי איכותי של הצבע המשוער של הפאגוזומים המוכתמים S-1 המתאימים ל-pH. הצבע הצהוב מעיד על חומציות רבה יותר ואילו אדום מעיד על בסיסיות רבה יותר.

תמונה זו מציגה נויטרופילים של מח עצם הקשורים לעכבר חסרים את ערוץ Hvcn1 20 דקות לאחר פגוציטוזיס. הפאגוזומים נראים אדומים מאוד, בסיסיים ונפוחים. החץ האדום כאן מצביע על קנדידה תוך-תאית, בעוד שהחץ הזה מצביע על קנדידה חוץ-תאית.

תמונה זו מציגה נויטרופילים של מח עצם עכבר מסוג בר שבלעו קנדידה. הם הרבה פחות בסיסיים מאשר נויטרופילים נוקאאוט Hvcn1. תמונה זו מציגה נויטרופילים של דם היקפי אנושי באותה נקודת זמן לאחר פגוציטוזיס.

הם נראים מעט יותר בסיסיים מתאי הבר של העכברים, אך הפאגוזומים עדיין אינם גדולים ואדומים כמו תאי הנוקאאוט Hvcn1, ותמונה זו מציגה נויטרופילים אנושיים שעברו פגוציטוזציה של קנדידה בנוכחות חמישה יודוניום דיפנילן מיקרומולרי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כארבע עד חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיזהר בעת בידוד הנויטרופילים כדי שלא יופעלו.

על מנת לקבוע אם ההשפעות על שינויים ב-pH הווקולרי או הציטוזולי או בנפח הווקולרי נובעות משינויים בפרץ הנשימה, ניתן למדוד את התפרצות הנשימה הזו בדרכים אחרות המודדות ישירות את ייצור הרדיקלים החופשיים או צריכת החמצן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד נויטרופילים אנושיים ואז לצבוע ולדמות את הפגוזום והציטופלזמה. אל תשכח שעבודה עם דגימות דם אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וביגוד מגן בעת ביצוע הליך זה.