Name: טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 5 s
Description: למדו שיטה לטעינת צבע סידן רגיש לתוך סופי עצב בצפרדע דרך גדם עצב. פרוטוקול זה מאפשר מדידה וניתוח של שינויים מהירים בסידן בסינפסות נוירומוסקולריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה בוצע במסגרת תוכנית הממשלה הרוסית לצמיחה תחרותית של אוניברסיטת קאזאן הפדרלית ומענק מהקרן הרוסית למחקר בסיסי (16-04-01051, 16-34-00817, 15-04-02983). אנו מודים ארבעה בודקים אנונימיים על מתן הערות מועילות על טיוטות קודמות של כתב היד. אנו מביעים את הכרת התודה שלנו ל- Yuliya Aratskaya על ההקלטה הקולית. אנו מודים לד&quot;ר ויקטור אילין על הערות מועילות רבות ועזרה עם עריכת finale של כתב היד.

<ol><li>Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+of+high+calcium+concentration+in+a+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal.</a> Science. 256, 677-679 (1992).</li>
<li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+calcium+trigger+neurotransmitter+release%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">How does calcium trigger neurotransmitter release?</a> Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).</li>
<li>Burnashev, N., Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+dynamics%2C+Ca2%2B+buffers+and+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy.</a> Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).</li>
<li>Schneggenburger, R., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+calcium+and+control+of+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic calcium and control of vesicle fusion.</a> Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).</li>
<li>Pang, Z. P., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Ca2%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+influx+and+transmitter+release+in+a+fast+CNS+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse.</a> Nature. 383, 431-434 (1996).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+during+a+single+action+potential+in+a+large+presynaptic+terminal+of+the+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem.</a> J Physiol. 506, 143-157 (1998).</li>
<li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).</li>
<li>Molgó, J., Mallart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Anemonia+sulcatatoxin+II+on+presynaptic+currents+and+evoked+transmitter+release+at+neuromuscular+junctions+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse.</a> Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).</li>
<li>Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+feedback+inhibition+of+acetylcholine+release+in+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).</li>
<li>Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2538708">Fluorescent indicators of ion concentrations.</a> Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li>
<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20194474">How calcium indicators work.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).</li>
<li>DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+detection+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+transients+at+a+Xenopus+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction.</a> J Physiol. 505, 585-592 (1997).</li>
<li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+presynaptic+calcium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of presynaptic calcium currents.</a> Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).</li>
<li>Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dynamics+at+the+frog+motor+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Pflug+Arch+Eur+J+Phisiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal.</a> Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).</li>
<li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627302005731">The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li>
<li>Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pixel+optical+fluctuation+analysis+of+calcium+channel+function+in+active+zones+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).</li>
<li>Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRegehr%2C+WG+%22Imaging+in+neuroscience+and+development%3A+a+laboratory+manual%22">Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual</a>. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+Application+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).</li>
<li>Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+loading+with+Patch+Pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dye loading with Patch Pipettes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).</li>
<li>Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+II+and+calcium+regulate+vesicle+docking+and+the+cross-talk+between+vesicle+pools+at+the+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals.</a> J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Injection+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).</li>
<li>Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+damage+to+mouse+motor+nerve+terminals+following+oxygen%2Fglucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation.</a> Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).</li>
<li>Peng, Y. Y., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+LHRH+is+linearly+related+to+the+time+integral+of+presynaptic+Ca2%2B+elevation+above+a+threshold+level+in+bullfrog+sympathetic+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia.</a> Neuron. 10, 465-473 (1993).</li>
<li>Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Latrotoxin+releases+calcium+in+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).</li>
<li>Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+muscarine-induced+synaptic+depression+at+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction.</a> Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward-filling+of+dextran-conjugated+indicators+for+calcium+imaging+at+the+drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).</li>
<li>Wu, L. G., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8893033">Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).</li>
<li>Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+mechanism+of+quantal+transmitter+release+at+a+chemical+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse.</a> J Physiol. (1), 11-35 (1968).</li>
<li>Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. <a target="_blank" href="http://research-journal.org/en/biology-en/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/">A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects.</a> Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).</li>
<li>Khaziev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine-induced+inhibition+of+presynaptic+calcium+signals+and+transmitter+release+in+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction.</a> Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).</li>
<li>Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+modulation+of+synaptic+efficacy+at+the+neuromuscular+junction+of+Rana+pipiens+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs.</a> J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).</li>
<li>Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+presynaptic+calcium+currents+and+endogenous+calcium+buffers+at+the+frog+neuromuscular+junction+with+two+different+calcium+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Synaptic+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes.</a> Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).</li>
<li>Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11152728">Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).</li>
<li>Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17182774">Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).</li>
<li>Troncone, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+and+reversible+blocker+of+presynaptic+calcium+channels+in+frog+and+crayfish+neuromuscular+junctions+from+Phoneutria+nigriventer+spider+venom%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom.</a> J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).</li>
<li>Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12668-016-0318-6">Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction.</a> BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

במאמר זה, הצגנו את השיטה של ​​ביצוע Ca 2 + רגיש טעינת צבע לתוך קצות העצבים צפרדע דרך גדם עצב. בסוף הליך הטעינה, כל המסופים בחלק הפרוקסימלי של העצב יש רמות משמעותיות של הקרינה. ההערכה היא כי הריכוז בתוך המסוף של החללית נע בין 40 ל 150 מיקרומטר 17 . הליך הדגירה מתבצע בשני שלבים: בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בטמפרטורה נמוכה יותר במקרר. חשוב לשלוט על זמן הדגירה רקמה עם צבע בטמפרטורת החדר. בהתאם אורך בפועל של גדם עצב, צבע ספציפי, ואת הטמפרטורה, זמן הדגירה עשוי להשתנות. אם overexposed, מסופים בחלקים הפרוקסימלי קרוב לגדם עצב ניתן לעומס יתר על המידה. עם זאת, בחלק האמצעי של העצב, עדיין ניתן למצוא מסופים כי הם טעונים בצורה משביעת רצון. במהלך הE הדגירה ארוכה במקרר, צבע מופץ באופן שווה מעל קצות העצבים. התצפיות שלנו 33 , 35 , כמו גם את הנתונים של חוקרים אחרים 30 , להוכיח את חוסר כל השפעה ניכרת של הליך הטעינה על משרעת התגובה postsynaptic או על תדירות של פוטנציאל צלחת מיניאטורה. אריכות ימים טובה תועדה בהכנות הטעונות. יש כמה נקודות חשובות ברצוננו למשוך תשומת לב. זה מאוד חיוני כדי למקם את גדם העצב לתוך פתרון טעינת צבע בתוך דקות ספורות לאחר כריתה כדי לאפשר לצבוע להיכנס לתוך האקסונים של עצב לחתוך; עיכובים יכולים לגרום לטעינה לא יעילה, ככל הנראה בשל resealing של אקסונים העצבים 27 , 36 . כמה חוקרים לטבול את גדם העצב ב 100 מ&quot;מ EDTA (a Ca 2 + - ו Mg 2 + -chelator) מיד לאחר כריתה של העצב כדי למנוע את האקסונים לחתוך מ resealing. המאגר מוסר לאחר 1-2 דקות והוחלף עם פתרון טעינה צבע 37 . השימוש של ג &#39;ל נפט היטב במקום צינורות פלסטיק עבור הליך הטעינה מאפשר שימוש בגדם עצב קצר יותר. תוך שימוש בגישה זו, עצב הוא נחתך לאחר שהוא שקוע הפתרון HEPES עם צבע, ואת האקסונים לא reseal בגלל חוסר יונים divalent בפתרון צבע 27 , 28 . במחקר שלנו, השתמשנו בצורת מלח מסיס במים של מחוון Ca 2 + במקום dextran. הצמד דקסטרן מפוזר באקסון לאט יותר מאשר צורות מלח. עם זאת, השימוש מצומד dextran מפחית compartmentalization צבע וטיפול על ידי עצב NMJs. סידן ירוק 1-3,000 MW dextran מצומד יש קצב דיפוזיה טוב מדגים ממודרים מופחת <s<html> Up class = &quot;xref&quot;&gt; 38. חשוב מאוד למנוע תקופה ארוכה של תאורה פלואורסצנטי של הרקמה, כי זה משפיע על בריאותו והישרדותו. אנו משתמשים באופטי נומרסקי בערוץ האור הנראה כדי לחפש מסופי עצבים. במהלך ההקלטה, אנו מגבילים את השדה המואר באמצעות דיאפרגמה. ראוי לציין כי שיטת הטעינה הזו מתאימה רק להכנות שעשויות לעמוד בדגירות ארוכות. כדי להקטין את זמן הטעינה כאשר מחקרים נערכים על רקמות שבריריות יותר ( למשל, סינפסות של בעלי חיים חם דם), יש צורך downscale את אורך עצב העצבים להשתמש micropipettes לטעינת 29 , 39 . טכניקת הטעינה הזו מתאימה היטב לשינויים הדמיה cytosolic Ca 2 + , עם אינדיקטורים ניאון תחת שני גירוי עצב יחיד ופעילות סינפטי קצביEf &quot;&gt; 17 , 27 , 35. ניתוח של משרעת Ca 2 + -Transient ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעה של חומרים שונים על כניסת סידן המשתתף שחרור נוירוטרנסמיטר 33 .

סידן יונים (Ca 2 + ) להשתתף בתהליכי איתות עצביים רבים, כולל ייזום, תחזוקה, ופלסטיות של שחרור המתווך 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . עם הגעתו של פוטנציאל הפעולה, תאיים Ca 2 + נכנס מסוף העצבים ויזם שחרור נוירוטרנסמיטר. בסינפסות מסוימות, זרם הסידן ניתן למדוד ישירות בשיטות אלקטרופיזיולוגיות 6 , 7 , 8 . במקרה של צומת neuromuscular (NMJ), לא ניתן להשתמש מהדק תיקון ישיר שתי אלקטרודות מתח טכניקות מלחציים בשל גודל הדקות של קצות העצבים. הקלטות של פנים Ca 2 + זרמים מן קצות העצבים של NMJ יכול להיעשות על ידי electrophys עקיפהשיטות יולוגיות 9 , 10 . עם זאת, שיטות אלה דורשות טיפול מוקדם של סינפסה על ידי נתרן אשלגן יון חוסמי ערוץ. שיטות אופטיות אינן דורשות הפרדה פרמקולוגית של יונים זרמים במסוף העצבים ולאפשר הקלטות של Ca 2 + זרם, מופעלות על ידי פוטנציאל פעולה, ואת העלאה הבאים של יונים Ca 2 + ב axoplasm 11 , 12 , 13 , 14 . שיטות אלה מבוססים על הקלטות של שינויים הקרינה של Ca ספציפי 2 + צבעים רגישים על הכריכה של חינם Ca 2 + יונים 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Ca 2 + מחוונים ניתן לטעון לתוך cElls באמצעות מגוון של שיטות, בהתאם למטרה של הניסוי. החוקרים להשתמש ביישום אמבטיה של צורות לצבוע חדיר קרום 20 , 21 , טוען דרך פיפטה תיקון 22 , או microinjection 23 , 24 , 25 . עם זאת, כל השיטות הללו יש מגבלות מסוימות במקרה של NMJ בשל הייחודיות שלה ארכיטקטורה סינפטי. עבור NMJ, השיטה הנוחה והמצליחה ביותר היא לטעון את הצבע דרך גדם העצב, שיטת מילוי קדימה 26 , 27 , 28 , 29 . טכניקה זו יכולה לשמש לטעינת צבעים שונים הקרינה לתוך קצות העצבים ההיקפיים. שיטה זו שימשה בהצלחה עבור מסופי עצב תסיסנית 28 , עצב המנוע לטאה28 , ו צפרדע מוטורי מסופי העצבים 17 , 26 , 27 , 30 . בהתאם לאובייקט הנחקר, פרטים שיטתיים עשויים להשתנות. זכוכית מיקרו פיפטה ניתן להשתמש עבור עצבים קטנים מן הזחלים 28 . כמה חוקרים תיארו שיטה 27 , 28 שבה סוף לחתוך טרי של עצב innervating שריר שקוע לתוך היטב מראש מלא צבע. ההכנה נשארת לכמה שעות כדי לספוג את הצבע. הצבע נספג על ידי האקסונים ומועבר אל מסופי העצבים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה של ​​טעינת אינדיקטור פלואורסצנטי לתוך צפרדעים עצב מוטורי המנוע דרך גזע עצב. הפרוטוקול שלנו משתמש קצה פיפטה פלסטיק עבור הדגירה של הרקמה עם צבע. כמו כן, אנו מתארים כיצד לרכוש ולנתח Ca 2 + פלואורסצנטי traמטופלים.

<table><tbody><tr><td>אינדיקטור Ca2+</td><td>בדיקות מולקולריות, ארה"ב</td><td>אורגון ירוק 488 BAPTA-1 מלח הקספוטלגן, O6806</td><td>500 &mu; g</td></tr><tr><td>סיליקון אלסטומר</td><td>דאו קורנינג, ארה"ב</td><td>סילגארד 184 אלסטומר</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>ביוהיט, רוסיה</td><td>720210</td><td>0.5-10 ומיקרו; </td></tr><tr><td>L קצה פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק, ארה"ב</td><td>02-707-175</td><td>10&micro; </td></tr><tr><td>L קצה פיפטה</td><td>Biohit, רוסיה</td><td>781349</td><td>10&micro; L</td></tr><tr><td>סכין גילוח פישר</td><td>סיינטיפיק, ארה"ב</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>סיכות קטנות</td><td>כלי סיכה עדינים, קנדה</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיני קרנית</td><td>MT MEDI CORP, קנדה</td><td>S-1111</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים תכשיטנים</td><td>MT MEDI CORP, קנדה</td><td>F-9610</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים תכשיטנים</td><td>MT MEDI CORP, קנדה</td><td>F-9611</td><td></td></tr><tr><td>דוגמנות ניתן</td> להחליף <td>את היצרן</td><td></td> המקומי של החימר <td>בכל יצרן מקומי</td></tr> ניתן <tr>להחליף את <td>היצרן</td><td></td> המקומי של<td>ג'לי נפט</td><td>בכל יצרן מקומי</td></tr><tr><td>Microspin FV 2400&nbsp;</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Multi-spin MSC 3000</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>מחטים היפודרמיות לשימוש חד פעמי</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0.4& 40 מ"מ</td></tr><tr><td>Syrynge</td><td>יצרן</td><td></td> מקומי <td>0.5 מ"ל</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td> מיקרוסקופ <td>100 מ"ל</td><td>H0887</td></tr><tr><td>, BX51</td><td>אולימפוס, יפן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת רכישת נתונים&nbsp;</td><td>מכשירים מולקולריים, ארה"ב</td><td>Digitdata 1550</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה</td><td>מכשירים מולקולריים, ארה"ב</td><td>תוכנת pClamp, פרוטוקול גרסה 10</td><td>ניתן להוריד מ: http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro</td></tr><tr><td>בקרת טמפרטורת אמבטיה ואמבטיה</td><td>בונה</td><td></td> <td>ניסיוניניתן להחליף בכל תא עם בקרת טמפרטורה. למשל מ-https://www.warneronline.com/&nbsp;</td></tr><tr><td>מונוכרומטור</td><td>עד פוטוניקה, גרמניה</td><td>פוליכרום V</td><td>כבר לא זמין, ניתן להחליף באחרים&nbsp; &nbsp; מקור אור יציב 488 ננומטר</td></tr><tr><td>מונוכרומטור תוכנה בקרת</td> עד <td>פוטוניקס, גרמניה</td><td>Polycon</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD דיגיטלית</td><td>הדמיית חולצה אדומה, ארה"ב</td><td>Neuro CCD SMQ</td><td></td></tr><tr><td>דגם 2100 ממריץ דופק מבודד</td><td>A-M מערכות, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת רכישה למצלמת CCD</td><td>הדמיית חולצה אדומה, ארה"ב</td><td>תוכנת</td><td></td>Turbo SM</tr><tr><td>ImageJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות, ארה"ב</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>תוכנית גיליונות אלקטרוניים</td><td>מיקרוסופט, ארה"ב</td><td>מיקרוסופט אופיס אקסל&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע neuromuscular צפרדע

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

אחת השיטות האפשריות ביותר למדידת רמות סידן presynaptic מסופי עצב presynaptic הוא הקלטה אופטי. הוא מבוסס על שימוש בסידן צבעי ניאון רגישים שמשנים את עוצמת הפליטה שלהם או את אורך הגל בהתאם לריכוז הסידן החופשי בתא. ישנן מספר שיטות המשמשות כתם תאים עם צבע סידן. הנפוצים ביותר הם תהליכים של טעינת צבעים באמצעות micropipette או מראש incubating עם צורות acetoxymethyl אסתר של צבעים. עם זאת, שיטות אלה אינם ישימים לחלוטין צמתים neuromuscular (NMJs) בשל בעיות מתודולוגיות המתעוררות. במאמר זה, אנו מציגים שיטה להעמסת צבע סידן רגיש דרך גדם העצב הצפרדע של עצב הצפרדע לתוך קצות העצבים. מאז הכניסה של סידן חיצוני לתוך מסופי העצבים ואת המחייב הבאים לצבוע סידן להתרחש בתוך זמן מיליקונד בקנה מידה, יש צורך להשתמש במערכת הדמיה מהירה לרשום אלה אינטראקטיביותNs. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להקלטת סידן חולפת עם מצלמת CCD מהירה.

לאחר טעינת צבע ועל גירוי עצב המנוע, עלייה משרעת של האות ניאון (Ca 2 + חולף) ניתן לאתר מסופי העצבים (ראה איור 2 ). פרמטרים של Ca 2 + הארעיים מוצגים בטבלה 1 . כמותית, הפרמטרים של Ca 2 + transients נמדדים במחקר שלנו קרובים לנתונים המתקבלים על ידי מדענים אחרים בסינפסות של חיות קר דם 15 , 34 . הפרמטרים של Ca 2 + הארעיים תלויים בשיעור של מחייב של Ca 2 + עם צבע הדיסוציאציה לאחר מכן. שיעור הכניסה של Ca 2 + לתוך עצב הסיום, אינטראקציה עם צבע, ואת דיפוזיה בציטופלזמה להשפיע על כל עלייה של Ca 2 + חולף. זמן ריקבון של האות ניאון תלוי הזיקה של צבע,את המהירות של אינטראקציה Ca 2 + עם מאגרים תאיים, והסרה על ידי משאבות יון 35 . ניתוח משרעת של Ca 2 + ארעיים ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעה של חומרים שונים על כניסת סידן המשתתף שחרור נוירוטרנסמיטר 33 . <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig2.jpg" /> איור 2 : ממוצע Ca 2 + חולף נמדד צפרדע NMJ. Ca 2 + חולף חושבה בהתבסס על הממוצע של אותות מ 13 NMJ צפרדע. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שִׂיאΔF / F (%) </td><td> עלייה של 20% -80% (ms) </td><td> Τ (אלפיות השנייה) </td></tr><tr><td> 12,6 ± 1,1 (n = 13) </td><td> 4.6 ± 0.5 (n = 13) </td><td> 115.3 ± 8.3 (n = 13) </td></tr></tbody></table> טבלה 1: הפרמטרים הממוצעים של Ca 2 + חולף. הנתונים מוצגים כממוצע ± SE; N הוא מספר המדידות ב- NMJs. השיא ΔF / F הוא המשרעת הממוצעת של ΔF / F.

כאן, אנו מתארים שיטה לטעינת צבע סידן רגיש דרך גדם העצב הצפרדע לתוך קצות העצבים. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת וניתוח של טרמינטים סידן מהיר בקצות העצבים ההיקפיים.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

שלום, שמי דמיטרי סמיגולין ואני עובד במעבדה לביופיזיקה של תהליכים סינפטיים במכון לקריוביוכימיה וביופיזיקה של קזאן, האקדמיה למדעים של רוסיה. במעבדה שלנו אנו חוקרים דרכים רבות של איתות סידן במסוף העצבי-שרירי. אחת השיטות הנגישות ביותר למדידת רמת הסידן הסינפטית היא הקלטה אופטית.כאן אנו מתארים את השיטה לטעינה של צבע רגיש לסידן, דרך שריט עצב, בסינפסות של עצבי צפרדע. כמו כן, אנו מציגים את הפרוטוקול למדידה וניתוח של תגובת סידן (calcium transient) רחבה בטרמינליים של צפרדע. באמצעות שיטה זו ניתן לחקור את השפעתם של תרופות פעילות על רמת הסידן הפרה-סינפטית במהלך פעילות סינפטית.הכנת תמיסות טעינת הצבע. צבע הסידן הפלואורסצאיני Oregon Green BAPTA מגיע בנפח של 500 microliters ככמות קטנה של 500 micrograms של אבקה. יש להוסיף 14 microliters של תמיסה, המכילה HEPES, לאבקה.ערבב את תמיסת הטעינה במערבל וורטקס (Vortex), וסובב במצנטריפוגה כדי להוציא את הנוזל לדפנות המבחנה ולערבב היטב. עטוף את המבחנה עם תמיסת הטעינה בנייר אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור. אחסן את תמיסת הטעינה בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius, במקפיא.הליך טעינת הצבע. נתחו שריר חזה עורי מהבעל החיים. העבירו את הרקמה שנותחה לפטריית פטרי עם ציפוי כסף.מתחו את הרקמה באמצעות סיכות דקות מפל הstainles steel. הוסיפו תמיסת Ringer לצלח הפטרי. בעזרת להב תער, חתכו חתיכה קטנה, של כ-2 מילימטרים, מקצהו הדק של שפופרת פיפטה של 10 µL.הכינו חתיכת פלסטלינה להחזקת פיפטת המילוי על פיתרי הדש (Petri dish). חברו את פיפטת המילוי למזרק פלסטיק באמצעות צינור סיליקון ומתאמים העשויים מצינורות פיפטה. הסירו את תמיסת הרינגר הזמנית מפיתרי הדש בעזרת פיפטת פלסטיק.הכנה יבשה באמצעות מזרק. פעולה זו תמנע שאיבה של התמיסה לצמצם המילוי. הוצא את הבקבוקון עם תמיסת הטעינה מהמקפיא והשאר אותו להפשיר בטמפרטורת החדר במקום חשוך.באמצעות פינצטה עדינה ומספריים, תחת בקרה חזותית ובמיקרוסקופ סטרילי, חתוך את העצב קרוב לשריר. השאר שארית עצב באורך של כשני מילימטרים. קבע את פיפטת המילוי בעזרת פחית ומזרק על צלחת פטרי באמצעות פלסטלינה.הזז זאת קרוב לענף העצב. שאב בעדינות את קצה העצב לתוך פיפטת המילוי. הסר את צינור השאיבה מהקצה הקהה של פיפטת המילוי.ייבשו את קצה העצב בפיפטת המילוי באמצעות המזרק. הרימו את פיפטת המילוי יחד עם קצה העצב. בודדו את קצה העצב מהסביבה החיצונית באמצעות וזלין.ייבשו פעם נוספת את קצה העצב בתוך פיפטת המילוי באמצעות המזרק. שאבו 0.5 µL של תמיסת טעינה באמצעות פיפטה בעלת קצה ארוך. הכניסו בעדינות את קצה הפיפטה עם תמיסת הטעינה אל תוך פיפטת המילוי.הזריקו את התערובת ישירות לשארית העצב. אטמו את הקצה הפתוח של פיפטת המילוי באמצעות וזלין. הוסיפו כמות קטנה של תמיסה לפטריה.דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר במקום חשוך ולח עד למשך חמש שעות. לאחר הליך הדגירה, קחו את הדגימה והסירו את פיפטת המילוי עם תמיסת הטעינה. הניחו את הדגימה באמבטיה ושטפו אותה בתמיסת רינגר (Ringer's solution).שמרו את האמבת עם הדגימה למשך הלילה במקרר בטמפרטורה של 8 °C. הכינו את הרקמה למיקרוסקופיה. הוציאו את הדגימה מהאמבט.בצע קיבוע של הרקמה בתא מצופה כסף ומתוך כך מתוך מתיחה קלה של הרקמה. שטוף את הרקמה בתמיסת רינגר (Ringer's solution) רעננה. קח את אלקטרודת גירוי השאיבה (Suction Stimulation Electrode).מקם את אלקטרודת היניקה לעידוד בתא, כאשר הקצה שלה קרוב לקצה החתור של העצב. משוך את העצב לכיוון האלקטרודה. מבנה האלקטרודה מתואר במאמרו של Khazokoff; קישור למאמר נמצא בחלק של החומרים.קבעו את תא ההכנה על משטח המיקרוסקופ. מקמו את חיישן הטמפרטורה. חברו את צינורות הכניסה ואת כבל החשמל עבור אלמנט פלטייה (Peltier) בתא ההכנה.מקם את צינור היציאה בתא ההכנה. הפעל את משאבת הפרפוזיה. הפעל את יחידת הבקרת הטמפרטורה.כוון את הטמפרטורה ביחידת הבקרה להגעה ל-20 °C. התקן מגן הגנה מפני קרינת UV. הגדר את משך ההשהיה ואת התקופה במכשיר הגירוי.חבר חוט מהאלקטרודת היניקה למעורר. הפעל אותו. תחת עדשה בעלת הגדחה נמוכה, בדוק את ההתכווצות השרירית על ידי הפעלת הגירוי.מלאו את מערכת הפרפוזיה בתמיסת רינגר עם ריכוז נמוך של סידן וריכוז גבוה של מגנזיום. הגדירו קצב פרפוזיה של כ-שני מיליליטר לדקה. החליפו לעדשה בעלת הגדלה של 40 פעמים.הפעיל את ה-Polychrome V. בחר את אורך גל הפליטה ואת מצב התאורה הרציף. פתח את התריס. תחת עדשה בהגדלה של 40 פעמים, ובמצבי תאורה של פלואורסצנציה, ודא שהטרמינלים טעונים.אתר את הסיומת העצבית והתמקד בה. הסיומת העצבית הטעונה וסיומות עצב מוטורי טעונות היטב מוצגות באיור. הקלטת הווידאו בוצעה באמצעות מצלמת Red-Short Neuro CCD.הפעילו את תוכנת Turbo-SM. בחרו ב-Change Settings. הזינו 500 כמספר הפריימים.הזינו את שם הניסוי. התצורה הבסיסית היא 1000 פריימים לשנייה. 80 על 80.בחר טריגר חיצוני. הזן את זמן הטריגר המקדים (pre-trigger). מינוס עשרה מילישניות.הזינו את מספר החזרות, 20. בתוכנת Polychrome, בחרו במצב תאורה של טריגר חיצוני (external trigger illumination mode). הפעילו את תוכנת Clampex.טעינת פרוטוקול הגירוי. הפרוטוקול זמין להורדה מדף המעבדה שלנו באתר של Kazan Federal University. לפני ההקלטה, צלם מסגרת חשוכה (dark frame) בתוכנת Turbo-SM.בקוביה הטרינוקולרית, בחרו את רמות החלפת נתיב האור. 100 אחוזים עבור המצלמה. הפעילו את פרוטוקול הגירוי.בחר את אזור העניין ובדוק את האות. בתגובה לגירוי העצב, אנו מתעדים שינוי בעוצמת הפלואורסצנציה המשקף כניסת סידן לקצה העצב. ניתוח נתונים.בתוכנת Turbo-SM, בחרו בקובץ (file). לאחר מכן, בחרו בממוצע קבצים (average files). בחרו את הקבצים.הזינו את שם קובץ הממוצע, ובצעו מיצוע. שמרו את קובץ הממוצע כקובץ fit. בחרו, שמירה כקובץ fit.הזינו את שם הקובץ ושמרו אותו. הפעילו את Image J ופתחו את הכלים הבאים: Analysis, tools, ROI Manager.אתרו את קובץ הממוצע השמור בפורמט fit. גררו והניחו אותו ב-Image J. הגדילו את התצוגה בחלון כדי לראות טוב יותר. בחרו אזור עניין מלבני מעל מה שנראה כרקע.הוסיפו זאת למנהל ה-ROI. במנהל ה-ROI, בחרו ב-More ואז ב-Multi-measure. הגדירו להוריד את הממוצע (mean).העתיקו את הנתונים וייצאו אותם ל-Excel. ב-Excel, השתמשו בפונקציית הממוצע (average) כדי לחשב את ערך הרקע הממוצע עבור יחס מסוים. מבלי לסגור את Excel, חזרו ל-Image J. סגרו את החלון של חישוב הרקע מבלי לשמור.השתמש ב-ROI Manager ומחק את השרטוט המלבני של הרקע. פתח את תהליך המכשיר (instrument process), תחת math, בחר subtract. הזן את ערך הסף הממוצע שחושב מ-Excel, והפחת את הרקע מהמערכות (stacks).בחר אזור עניין (ROI) מלבני סביב סיום עצבי. הוסף אותו למנהל ה-ROI (ROI Manager). במנהל ה-ROI, בחר ב-more, ולאחר מכן ב-Multi-measure, השאר את הבחירה ב-load down, ובחר ב-mean.העתיקו והדביקו בחלון Excel. השתמשו בגרף העלילה של המכשיר ב-Excel. בחרו אזור שטוח לפני תחילת האות.טענו את הגרף עם הפרטים מהערכים הראשונים של הפלואורסצנציה במצב מנוחה, ועד לתחילת האות. לאחר מכן קבעו את מספר הנקודות לממוצע ערכי הפלואורסצנציה במנוחה. חשבו את הממוצע של ערכים אלו, ואז מצאו את המספר הממוצע של הפלואורסצנציה במנוחה.חלק את האותים בערך הפלואורסצנציה במצב מנוחה. הפחית אחד והכפל ב-100 אחוזים. שרטט את האות וחשב את האמפליטודה של השגריר של הסידן (calcium transient).פרמטרי הזמן של אותות פלואורסצנציה תלויים במהירות התגובה קדימה ו/או התגובה ההפוכה של היווצרות קומפלקס סידן-צבע. זמן העלייה של אות הסידן מייצג את הדינמיקה של כניסת הסידן, דיפוזיה שלו בטרמינל, ואינטראקציית הסידן עם הצבע.דעיקת הטרנזיאנט של הסידן תלויה באפיניות של הצבע ובקצב הבאפרינג של הסידן והסרתו. ניתוח של אמפליטודת הטרנזיאנט של הסידן יכול לשמש לחקר ההשפעה של חומרים פעילים שונים על כניסת הסידן המשתתפת בשחרור מתווכי עצבים. טכניקת טעינה זו מתאימה היטב לדימוג של שינויים בסידן הציטוזולי.באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים ושימוש הן בגירוי עצב בודד והן בפעילות סינפטית קצבית, ניתן להשתמש בניתוח של אמפליטודת הטרנזיינט של הסידן כדי לחקור את השפעתם של חומרים שונים על כניסת סידן המשתתפת בשחרור מוליכים עצביים. ישנן מספר נקודות חשובות שעלינו להקפיד עליהן.פרוצדורת הדגירה כוללת שני שלבים: דגירה בטמפרטורת החדר ודגירה במקרר. חשוב לשלוט בזמן הדגירה עם הצבע בטמפרטורת החדר.זמן האינקובציה עשוי להשתנות בהתאם לאורך השארית העצבית, לסוג הצבע ולטמפרטורה בחדר. חשיפה ממושכת מדי עלולה להוביל לעומס יתר בטרמינלים שלפני הניתוח ובחלקים הפרוקסימליים, בסמוך לשארית העצבית. הודות לאינקובציה ממושכת במקרר, הצבע מופץ באופן אחיד לאורך קצות העצבים.חיוני להעביר את העצב לתוך תמיסת טעינת הצבע בתוך מספר דקות לאחר החיתוך, כדי לאפשר לצבע להיכנס אל העצב, שכן מרווחי זמן ארוכים יותר הובילו לטעינה לא יעילה, ככל הנראה עקב סגירה של קצות העצב. כדי להפחית את חלוקת הצבע למדורים (compartmentalization), ניתן להשתמש בצורה המורחבת של הצבע. חשוב מאוד למנוע חשיפה ממושכת של הרקמה להארה פלואורסצנטית, כיוון שהיא משפיעה על הישרדותה.אנו משתמשים באופטיקת Nomarski בערוץ האור הנראה כדי לחפש את העצבים הסופיים. במהלך ההקלטה, אנו מגבילים את שדה הראייה המואר באמצעות הדיאפרגמה. ניתן לקצר את משך תהליך הטעימה הממושך באמצעות חסימה (shutter stamp) של העצב.במקרה זה, ניתן להשתמש במעקף מיקרו-זכוכית (glass micro-bypass).

loading-calcium-dye-into-frog-nerve-endings-through-nerve-stump

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סידן הוא שליח בכל מקום במערכת העצבים, חיוני מפעילה שחרור הנוירוטרנסמיטר ושינויים חוזק סינפטי. כאן אנו להפגין טכניקה לטעינת Ca 2 +-אינדיקטורים לתוך מסופי תסיסנית עצב. אנחנו גם מדגימים המצאה של המנגנון הנדרש ולהדגיש נקודות קריטיות להצלחת הטכניקה.

טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

כאן אנו מציגים את המתודולוגיה של מהיר הדמיה ברזולוציה גבוהה פלואורסצנטי מתח רגיש צבען של פעילות מפורט של נוירונים הגנגליון stomatogastric סרטן.

דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן Stomatogastric עם מתח רגיש צבעים

אנו מתארים טכניקה פשוטה עלות נמוכה להכנסת ריכוז גבוה של צבעי ניאון וסידן רגיש אל הנוירונים או כל בדרכי העצבית באמצעות טפטפת יניקה פוליאתילן.

טוען מדרדר עצבים, קטעי צליל, ושורשים השדרה עם צבעי ניאון

בסרטון זה, סיבי עצב של זחלי דרוזופילה שקועים בצבע FM, אשר נקשר לשומנים בקרום התא. מיקרואלקטרודת יניקה ופולסים חשמליים מעוררים את תהליך האנדוציטוזה, ומשלבים את צבע FM בשלפוחיות אנדוציטיות שזה עתה נוצרו. שיטה זו, אשר מדמיינת שלבים presynaptic של neurotransmission, שימושי לחקר תפקוד סינפטי ושחרור נוירוטרנסמיטר.

העמסה ופריקה של צבע FM בתיווך מיקרואלקטרודה בתאי עצב של זחלי דרוזופילה

מקור: } Heredia, D. J., et. al. הדמיה ex vivo של איתות סידן ספציפי לתא בסינפסה המשולשת של דיאפרגמת העכבר. J. Vis. exp. (2018)} } סרטון זה מדגים הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקת סידן בצמתים עצביים-שריריים (NMJs) בעכבר טרנסגני המבטא מדדי סידן מקודדים גנטית. NJM מזוהה על ידי קולטני אצטילכולין מתויגים פלואורסצנטית בסרעפת עם העצב הפרני. מפצל תמונה משמש להמחשת אותות מרובים בו זמנית. גירוי חשמלי מועבר, ונרשם השינוי בקרינה ב-NMJ בתגובה לזרם הסידן.

הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקת סידן בצמתים עצביים-שריריים בסרעפת של עכבר טרנסגני

מקור: Zhilyakov, N. V. et al., רישום מעברי סידן בצומת עצבי-שרירי של עכבר עם רזולוציה זמנית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את טכניקת ההדמיה של הקלטת מעברי סידן מהירים בקצות העצבים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. על ידי גירוי העצב ולכידת שינויים פלואורסצנטיים מצבעים קושרי סידן, הוא מדמיין זרם סידן דינמי ופינוי בקצה העצב, ומציע תובנות מדויקות לגבי פעילות סינפטית ואיתות עצבי-שרירי.

הדמיה של מעברי סידן מהירים בקצות עצבים של עכברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

מערכת העצבים המעי (ENS) היא רשת של נוירונים וגליה הממוקמת בדופן המעי ושולטת ברפלקסים של המעי. פרוטוקול זה מתאר שיטות לרישום הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירים חיים של ENS באמצעות הדמיית Ca2+.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

כאן אנו מתארים פרוטוקול למדידה וניתוח של תגובות טמפרטורה בפקעת הריח של Xenopus laevis. נוירונים של קולטני ריח ותאים מיטרליים מוכתמים באופן דיפרנציאלי, ולאחר מכן נרשמים שינויים בסידן, המשקפים רגישות של כמה רשתות עצביות בנורה לירידות טמפרטורה הנגרמות באף.

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

למדו שיטה לטעינת צבע סידן רגיש לתוך סופי עצב בצפרדע דרך גדם עצב. פרוטוקול זה מאפשר מדידה וניתוח של שינויים מהירים בסידן בסינפסות נוירומוסקולריות.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

גלה סרטונים נוספים