טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע
8 ביולי 2017
כאן, אנו מתארים שיטה לטעינת צבע סידן רגיש דרך גדם העצב הצפרדע לתוך קצות העצבים. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת וניתוח של טרמינטים סידן מהיר בקצות העצבים ההיקפיים.
שלום, שמי דימיטרי סמיגולין אני עובד במעבדה לביופיזיקה של תהליכים סינפטיים של מכון קאזאן לביוכימיה וביופיזיקה, האקדמיה הרוסית למדעים. במעבדה שלנו אנו חוקרים דרכים נרחבות של איתות סידן בצומת העצבי-שרירי. אחת השיטות הנגישות ביותר למדידת רמת הסידן הסינפטית היא הקלטה אופטית.
כאן אנו מתארים את שיטת הטעינה של צבע רגיש לסידן, דרך גדם עצבי, בקצות העצבים של הצפרדע. כמו כן, אנו מציגים את הפרוטוקול למדידה וניתוח של חולף סידן עצום במסופי צפרדעים. בשיטה זו ניתן לחקור את השפעת התרופות הפעילות על הרמה הפרה-סינפטית של הסידן במהלך הפעילות הסינפטית.
הכנת תמיסת העמסת הצבע. צבע סידן של Fluorescein Oregon Green BAPTA, מגיע ב-500 מיקרוליטר באמצעות כמות קטנה של 500 מיקרוגרם אבקה. הוסף לאבקה 14 מיקרוליטר תמיסה, המכילה HEPES.
מערבולת תמיסת טעינה, וסובב למטה כדי לערבב היטב. עטפו את הבקבוקון בתמיסת הטעינה בנייר כסף, כדי למנוע חשיפת אור. אחסן את תמיסת הטעינה במינוס 20 מעלות צלזיוס, במקפיא.
הליך טעינת צבע. נתח שריר חזה עורי מהחיה. הרכיבו רקמה מנותחת בצלחת פטרי מרופדת בכסף.
מותחים את הרקמה בעזרת סיכות נירוסטה עדינות. הוסף את הפתרון של רינגר לצלחת הפטרי. בעזרת סכין גילוח חותכים חתיכה קטנה, כ -2 מילימטרים מצינור הפיפטה של עשרה מיקרוליטרים מהקצה הדק.
הכינו חתיכת פלסטלינה להחזקת פיפטת המילוי על צלחת הפטרי. חבר את פיפטת המילוי עם מזרק פלסטיק דרך צינור סיליקון ומתאמים עשויים צינורות פיפטה. הסר את תמיסת רינגר הזמנית מצלחת הפטרי על ידי פיפטה מפלסטיק.
הכנה יבשה עם מזרק. זה ימנע יניקה של התמיסה בפיפטה המילוי. מוציאים את הבקבוקון עם תמיסת טעינה מהמקפיא ומניחים להפשיר בטמפרטורת החדר במקום חשוך.
בעזרת פינצטה עדינה ומספריים, בשליטה חזותית, עם מיקרוסקופ סטרילי, חותכים את העצב קרוב לשריר. השאירו כשני מילימטרים של גדם עצבים. תקן את פיפטת המילוי בעזרת צינור והמזרק, על צלחת הפטרי בעזרת פלסטלינה.
הזז אותו קרוב לענף העצב. שאפו בעדינות את גדם העצב בפיפטה המילוי. הסר את צינור היניקה מהקצה הקהה של פיפטת המילוי.
יבש את גדם העצב בפיפטת המילוי על ידי המזרק. התקדם במעלה פיפטת המילוי עם גדם העצב. בודד את גדם העצב מבחוץ על ידי וזלין.
פעם נוספת, יבש את גדם העצב בפיפטה הממלאת על ידי המזרק. צייר את נקודת האפס חמישה מיקרוליטר של תמיסת טעינה באמצעות פיפטה עם קצה פיפטה ארוך. הכנס בעדינות את קצה הפיפטה עם תמיסת הטעינה לתוך פיפטת המילוי.
הוציאו את התערובת ישירות לגדם העצב. אטום את הקצה הפתוח של פיפטת המילוי באמצעות וזלין. הוסף כמות קטנה של תמיסה לצלחת הפטרי.
דגרו את התכשיר בטמפרטורת החדר במקום חשוך ורטוב למשך חמש שעות. לאחר הליך הדגירה, קח את התכשיר והסר את פיפטת המילוי עם תמיסת הטעינה. מניחים את התכשיר באמבטיה ושוטפים אותו עם התמיסה של רינגר.
שומרים את האמבטיה עם התכשיר למשך הלילה במקרר בטמפרטורת שמונה מעלות צלזיוס. הכן את הרקמה למיקרוסקופיה. קח את התכשיר מהאמבטיה.
הרכיבו את התכשיר בתא מרופד בכסף ומתחו מעט את הרקמה. שטפו את הטישו בתמיסת רינגר טרייה. קח את האלקטרודה לגירוי יניקה.
הנח את אלקטרודת יניקת הגירוי בתא כשקצהו קרוב לקצה החתוך של העצב. משוך את העצב אל האלקטרודה. בניית האלקטרודה מתוארת במאמרו של חזוקוף, קישור למאמר נמצא בחומרים.
תקן את תא ההכנה על במת המיקרוסקופ. הנח את בדיקת הטמפרטורה. חבר צינורות זרימה בכבל חשמל עבור אלמנט פלטייר בתא ההכנה.
הנח את צינור הזרימה בתא ההכנה. הפעל משאבת זלוף. הפעל את המונח יחידת בקר.
הגדר את הטמפרטורה ביחידת הבקר כך שתגיע ל-20 מעלות צלזיוס. התקן מגן הגנה אולטרה סגול. הגדר את משך ההשהיה ואת התקופה על הממריץ.
חבר חוט מאלקטרודת היניקה עם הממריץ. הפעל אותו. תחת יעד הגדלה נמוך, בדוק את התכווצות השרירים על ידי הפעלת הגירוי.
מלאו את מערכת הזילוף בתמיסת רינגר עם דל סידן ומגנזיום גבוה. הגדר את קצב הזלוף של כשני מיליליטר לדקה. החלף את המטרה בהגדלה פי 40.
הפעל את אורך גל הפליטה של Polychrome V.Select ותאורת מצב רציף. פתח את הצמצם. מתחת למטרת הגדלה פי 40, במצב פלואורסצנטי תאורות מבטיחות שהמסופים נטענים.
מצא את הטרמינל והתמקד בו. העצב הטעון ומסופי העצבים המוטוריים העמוסים היטב, מיוצגים באיור. צילום וידאו עם מצלמת Neuro CCD אדומה-קצרה.
הפעל את תוכנת Turbo-SM. בחר שנה הגדרות. מספר הקלט של המסגרות הוא 500.
הזן את שם הניסוי. התצורה הבסיסית היא 1000 פריימים לשנייה. 80 על 80.
בחר גורם מפעיל חיצוני. הזן זמן טרום טריגר. מינוס עשר אלפיות השנייה.
הזן מספר חזרות, 20. בתוכנת Polychrome, בחר מצב תאורת טריגר חיצוני. הפעל את תוכנת Clampex.
פרוטוקול גירוי עומס. הפרוטוקול זמין להורדה מדף המעבדה שלנו באתר האוניברסיטה הפדרלית של קאזאן. לפני ההקלטה צלם מסגרת כהה בתוכנת Turbo-SM.
בקובייה המשולשת בחר רמות חילופי נתיב אור. 100 אחוז למצלמה. הפעל את פרוטוקול הגירוי.
בחר את אזור העניין ובדוק את האות. בתגובה לגירוי העצבי אנו רושמים שינוי בעוצמת הקרינה המשקפת את כניסת הסידן לקצה העצב. ניתוח נתונים.
בתוכנת Turbo-SM, בחר file. לאחר מכן, בחר, קבצים ממוצעים. בחר קבצים.
הזן את שם הקובץ הממוצע וממוצע אותם. שמור את הקובץ הממוצע כקובץ מתאים. בחר, שמור כקובץ מתאים.
הזן את שם הקובץ ושמור אותו. הפעל את תמונה J ופתח את המכשירים למטה. ניתוח, כלים, מנהל ROI.
מצא קובץ ממוצע שמור בפורמט מתאים. גרור ושחרר אותו לתמונה J.הגדל את החלון לתצוגה טובה יותר. בחר אזור עניין מלבני על פני מה שאתה מאמין שהוא רקע.
הוסף אותו למנהל החזר ההשקעה. במנהל החזר ההשקעה, בחר עוד. רב מדידה. טען למטה אמצעי.
העתק נתונים, ייצא ל- Excel. ב- Excel, השתמש בפונקציה average כדי לחשב ערך ממוצע של רקע עבור יחס. מבלי לסגור את Excel, חזור לתמונה J.סגור את החלון עם חישוב רקע מבלי לשמור.
השתמש במנהל החזר ROI, מחק ציור רקע מלבני. תהליך כלי פתוח, מתמטיקה, חיסור. הזן ערך ממוצע מחושב של סף מ- Excel והחסר את הקרקע מערימות.
בחר אזור עניין מלבני סביב מסוף עצבים. הוסף אותו למנהל החזר ההשקעה. במנהל החזר ההשקעה, בחר, עוד, רב-מדידה, טען למטה, ממוצע.
העתק והדבק בחלון Excel. השתמש בגרף עלילת מכשיר של Excel. בחר אזור שטוח לפני תחילת האות.
טען את הגרף עם הפרטים מהערכים הראשונים של הקרינה במנוחה, לתחילת האות. לאחר מכן קבע את מספר הנקודות לערכי הקרינה הממוצעים במנוחה. ממוצע ערכים אלה, ואז מצא את המספר הממוצע של הקרינה בשאר.
חלקו אותות לפי הקרינה במנוחה. הפחיתו אחד והכפילו ב-100 אחוז. שרטט את האות וחשב את משרעת הסידן החולף.
פרמטרי זמן של אותות פלואורסצנטיים תלויים במהירות התגובות קדימה או אחורה של היווצרות קומפלקס סידן-צבע. זמן העלייה של אות הסידן מייצג דינמיקה של קלט סידן. זה דיפוזיה בטרמינל, ואינטראקציה של סידן עם צבע.
דעיכת הסידן החולף תלויה בזיקה לצבע ובקצב חציצה של סידן ונסיגתו. ניתן להשתמש בניתוח של משרעת חולפת סידן כדי לחקור את ההשפעה של חומרים פעילים שונים על כניסת הסידן המשתתפים בשחרור נוירוטרנסמיטרים. טכניקת העמסה זו מתאימה היטב להדמיה של שינויים בסידן ציטוזומלי.
עם אינדיקטורים פלואורסצנטיים וגירוי עצבי בודד ופעילות סינפטית קצבית. ניתן להשתמש בניתוח של משרעת חולפת סידן כדי לחקור את ההשפעה של חומרים שונים על כניסת סידן המשתתפת בשחרור נוירוטרנסמיטרים. יש כמה נקודות חשובות שאנחנו רוצים לשים לב אליהן.
הליך הדגירה כולל שני שלבים. דגירה בטמפרטורת החדר, ובמקרר. חשוב לשלוט על זמן הדגירה עם הצבע בטמפרטורת החדר.
בהתאם לאורך גדם העצב, הצבע והטמפרטורה בחדר, זמן הדגירה עשוי להשתנות. אם אתה חושף יתר על המידה את המסופים והחלקים הפרוקסימליים לפני הניתוח, קרוב לגדם העצבים, ניתן להעמיס יתר על המידה. בשל הדגירה הארוכה במקרר, הצבע מופץ באופן שווה לאורך קצות העצבים.
חיוני למקם את העצב בתמיסת העמסת הצבע, תוך מספר דקות לאחר החיתוך, כדי לאפשר לצבע להיכנס לעצב, מכיוון שמרווחי זמן ארוכים יותר יצרו טעינה לא יעילה, ככל הנראה עקב קבלת עצב סגור. כדי להפחית את מידור הצבע ניתן להשתמש בצורה המורחבת של הצבע. חשוב מאוד למנוע את התאורה הפלואורסצנטית הארוכה של הרקמה מכיוון שהיא משפיעה על הישרדותה.
אנו משתמשים באופטיקה של נומרסקי בערוץ האור הנראה כדי לחפש את המסופים. במהלך ההקלטה אנו מגבילים את התצוגה המוארת, על ידי הסרעפת. ניתן להפחית את משך הזמן הארוך של תהליך הטעינה באמצעות חותמת תריס של העצב.
במקרה זה, ניתן להשתמש במיקרו-מעקף זכוכית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להחדרת צבע רגיש לסידן אל סיומות עצביות של צפרדע באמצעות שריט עצבי. כמו כן, הוא מפרט פרוטוקול להקלטה ולניתוח של תגובות סידן (calcium transients) מהירות בסיומות עצבים פריפריאליות אלו.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- סיגנלינג של סידן
רקע
- לאיתות של סידן ממלא תפקיד מכריע בהעברה סינפטית.
- שיטות רישום אופטיות הן יעילות למדידת רמות סידן ברמה הסינפטית.
- הבנת הדינמיקה של הסידן יכולה לסייע בבירור השפעותיהם של תרופות על פעילות סינפטית.
- צומת עצבי-שרירי של צפרדע משמש כמודל לחקר תהליכים אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להחדרת צבעים רגישים לסידן לסופי עצבים.
- ביסוס פרוטוקול למדידת תנודות סידן בתגובה לגירוי עצבי.
- סיוע בחקר השפעות של תרופות על רמות סידן פרה-סינפטיות במהלך פעילות סינפטית.
שיטות שנמצאו בשימוש
- הכנה של תמיסת טעינה של צבע סידן באמצעות Oregon Green BAPTA.
- ניתוח והרכבה של רקמת שריר של צפרדע לצורך יישום הצבע.
- שימוש בפיפטת מילוי כדי להחדיר את הצבע לתוך שריש העצב.
- הקלטה של שינויים בפלואורסצנציה בתגובה לגירוי עצבי.
תוצאות עיקריות
- טעינה מוצלחת של צבע רגיש לסידן אל תוך סיומות עצב של צפרדע.
- תצפית על מעברים מהירים של סידן במהלך פעילות סינפטית.
- ביסוס פרוטוקול לניתוח דינמיקת סידן בסיומות עצב.
- הדגמת התכשיר של השיטה למחקר השפעות של תרופות על סיגנלינג של סידן.
מסקנות
- השיטה שפותחה מאפשרת טעינה ומדידה יעילות של אותות סידן בקצוות עצביים של צפרדע.
- גישה זו יכולה להעמיק את הבנתנו לגבי מנגנונים סינפטיים ואינטראקציות של תרופות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על פרוטוקול זה כדי לחקור היבטים שונים של סיגנלינג סידן במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של תנודות סידן (calcium transients) פרה-סינפטיות היא קריטית להפחתת סיכונים במטרות נוירוביולוגיות מוקדמות ולאישור המנגנונים העומדים בבסיס ההעברה הסינפטית. פרוטוקול זה מאפשר רישום אופטי מדויק של דינמיקת הסידן במעברים עצביים-שריריים של צפרדע, ובכך תומך בביטחון חיזוי לגבי מעורבות המטרה ומודולציה פרמקולוגית. גישה זו מחזקת את הרציפות התרגומית (translational continuity) משלב ביולוגיית הגילוי להערכה פרה-קלינית של התפקוד הסינפטי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של זרימת סידן פרה-סינפטית במהלך תמסורת עצבית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות כימות של אפנון תרופתי של כניסת סידן.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות במערכות סינפטיות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק זרימת עבודה הניתנת לשחזור עבור טעינת צבעים רגישים לסידן לתוך סיומי עצב.
- מספק קריאות פלואורסצנציה כמותיות המתאימות להערכה השוואית של תרכובות.
- מגדיר תנאי בדיקה לזיהוי של תנודות סידן ברזולוציה זמנית גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי מדידה של תגובות סינפטיות תפקודיות.
- מאפשר רצף מגילוי במערכת in vitro למודלים פרה-קליניים של תפקוד נוירו-משרירי.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נקודות קצה סינפטיות כמותיות.
שילוב תהליכי עבודה ו-Pipeline
שיטה זו נטמעת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת בדיקה מונחית-השערה של דינמיקה של סידן סינפטי והתערבויות פרמקולוגיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס עבור השפעות של תרופות על כניסת סידן פרה-סינפטית.
- סריקה: מספקת מדידות פלואורסצנציה כמותיות וסטנדרטיות לפיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מספקת נתונים ברזולוציה זמנית גבוהה להשוואה סטטיסטית של תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים למודלים נוירו-שריריים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול בר-שימוש חוזר עבור יישומים מגוונים במחקר סינפטי ונוירו-שרירי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות סינפטיות ובמחקרים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של טעינת צבע והדמיה עבור זרימות עבודה הניתנות לשחזור ובניבסלביות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) באמצעות כימות תגובות סינפטיות תפקודיות לתרכובות מועמדות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות נוירומוסקולריות וסינפטיות מותאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנוירופיזיולוגיה, בדימות פלואורסצנציה ובניתוח נתונים כמותי.
- מחייב גישה למצלמות CCD מהירות, למיקרוסקופי פלואורסצנציה ולתוכנות ניתוח.
- דורש בקרה קפדנית על התזמון והטמפרטורה במהלך טעינת הצבע והדגירה.
- יש לנstandardize את בחירת אזורי העניין (region-of-interest) ואת חיסור הרקע לצורך השוואת הנתונים.
- טיפול זהיר ברקמה וצמצום פוטו-טוקסיות חיוניים לשמירה על שלמות הנתונים.
