ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (MSC) Spheroids הדרוך בתרבויות 3-D בתנאים קסנו ללא

המטרה הכוללת של ניסויים אלו היא לייצר ולהזריק ביעילות אגרגטים תרפויטיים כדוריים, או ספרואידים, של תאי גזע/סטרומה מזנכימליים, או MSCs, שהוכנו תחת תנאים נטולי רכיבים זרים (xeno-free) עבור יישומים ניסיוניים וקליניים. שיטות אלו יכולות לסייע בהסרת חסמים מרכזיים בתחום הטיפולים ב-MSCs, כגון שיעורי שימור, הישרדות ותפקוד תאיים נמוכים. תופעות אלו נראות לעיתים קרובות לאחר השתלה של תאים מפוזרים ובעקבות תנאים עוינים הנלווים בדרך כלל לפגיעה ברקמות.

היתרון המרכזי של הליכים אלו הוא שניתן להכין, להפעיל ולהזריק את הספרואידים של ה-MSC ללא מוצרים חיסוניים ממקור חייתי, כגון FBS, אשר מגבילים כיום חלק מהיישומים הקליניים של התאים ועלולים להטות את הפרשנות של נתונים פרה-קליניים מסוימים. למרות שמנגנון זה עשוי להועיל מאוד בתיווך היעילות מבוססת ה-MSC, ניתן להשתמש בו גם כדי להבין תיקון רקמות המתווך על ידי MSC, וכן כיצד פורמולציות אחרות של מצעים עשויות לשנות את הפרופיל הטיפולי. את ההליכים הללו ידגימו Josh Beaver ו-Bret Clough, שני טכנאים מהמעבדה שלי.

לאחר זריעה ודגירה של תאי גזע מזנכימליים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו ב-trypsin ו-EDTA כדי לקצור את התאים. לאחר סרצ'יפוגציה של התאים הנקצרים ב-450 ×g, רכזו את כל התאים לשפופרת קונית אחת עם המצע המתאים. סרצ'יפוגו את התאים והשאיבו מחדש את המשקע בנפח קטן של מצע. לאחר מכן, לאחר ספירת התאים, כדי להפיק ספרואידים של כ-25,000 תאים, דללו את ה-MSCs הנקצרים באחד מהמצעים הבאים בריכוז של 714 תאים ל-µL.

בשלב הבא, טפטפו בעזרת פיפטה טיפות של 35 microliter של התאים על הצד התחתון של מכסה צלחת תרבית הפוכה בקוטר 150 millimeter. העבירו 20 milliliters של PBS בטמפרטורת החדר לתחתית הצלחת ובתנועה אחת רציפה ויציבה, הפכו את המכסה המכיל את הטיפות כך שקודקודי הטיפות יפנו כלפי מטה. לאחר מכן, הניחו בזהירות את המכסה על תחתית צלחת התרבית.

העבירו את הצלחת לאינקובטור למשך שלושה ימים ללא הפרעה כדי לאפשר הרכבה תקינה של הספירות. לאחר האינקובציה, התחילו בקציר הספרואידים על ידי הסרה זהירה של המכסה והפיכתה כך שהטיפות יפנו שוב כלפי מעלה. לאחר מכן, הגביהו את המכסה בזווית של כ-10 עד 20 מעלות והשתמשו במגבי תאים (cell lifter) כדי לדחוף את הטיפות המכילות את הספרואידים לקצה הצלחת.

בעזרת פפיטה של 1 ml, העבירו את המדיום שבעקץ של הספירה למבחנה קונית של 15 ml, והשתמשו ב-PBS בטמפרטורת החדר ובאותו טיפ פפיטה כדי לשטוף את הפלטה ולהבטיח השחזה מקסימלית של הספרואידים. עבור בדיקות real-time PCR, סבבו את תגלי המבחנה של הספירות ב-450 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאבו את העלייה.

שטפו את הספרואידים באמצעות PBS וחזרו הן על שלב הצנטריפוגה והן על שלב השאיבה. לצורך הזרקה לבעלי חיים, אפשרו לכדורים לשקוע לתחתית המבחנה ללא צנטריפוגה. כדי לאסוף מצע מותנה (conditioned medium), או CM, לבדיקות של פוטנציאל אימונו-מודולטורי ואנטי-סרטני, אספו את הספרואידים ואת מצע ה-CM למבחנה קונית של 15 מיליליטר באמצעות cell lifter ופיפטה, כפי שהודגם הרגע.

עם זאת, אין לשטוף את המכסים ב-PBS. לאחר סרטיפוגציה ב-450 ×g למשך 5 עד 10 דקות, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנות של 1.5 milliliter. סרטיפוגו את הנוזל העליון ב-10,000 ×g ובטמפרטורת החדר למשך 5 עד 10 דקות.

לאחר מכן, השתמשו בפיפט כדי לאסוף בזהירות את ה-CM המזוכל לשפופרות חדשות בנפח 1.5 milliliter לאחסון בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. לאחר הכנת הספרואידים כפי שהודגם כעת בסרטון זה והמתנה של שלוש עד ארבע דקות עד שישקעו לתחתית השפופרת, שאבו את העלייה (supernatant) ושטפו את הספרואידים על ידי הוספת HBSS מועשר ב-0.2 to 0.5%HSA כדי לשמור על תנאים נטולי חלבונים זרים (xeno-free). לאחר מכן, שאבו את העלייה.

כסו את הספרואידים ב-100 עד 200 microliters של HBSS/HSA סטרילי והניחו את המבחנות על קרח. לאחר הרדמת עכבר בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הניחו את בעל החיים בתוך תא בטיחות ביולוגית BSL-2, כאשר הצד הגבי פונה מטה, והשתמשו ב-70% ethanol לחיטוי הבטן התחתונה של העכבר. הסירו את הפקק של קטטר תוורידי במידה 20-gauge, ובזמן החזקת עור העכבר ביד אחת, אתרו את מרכז הקו הדמיוני המחבר בין מפרק ברך כפוף לבין אזור איברי המין, ובבעזרת קצה המחט של מכלול הסטילטו (stiletto) של הקטטר המופנה לכיוון קו האמצע, השתמשו ביד השנייה לביצוע הזרקה תוצלומית (intraperitoneal injection).

הוצא בעדינות את מחט הסטילטו (stiletto) המתכתית ממכלול קתטר הסטילטו. בדוק אם על הסטילטו ישנם דם, שתן או צואה והשלך אותה. ודא את מיקומו התקין של הקתטר הפלסטי על ידי הכנסת טיפ של פפיטה בנפח 100 עד 200 microliter עם 100 microliters של HBSS/HSA סטרילי לתוך מתאם המזרק של הקתטר, כך שייווצר איטום הדוק.

לאחר מכן, הזרקו לאט את הנוזל לתוך החלל הפריטונאלי. באמצעות טיפ של פיפט של 100 עד 200 µL, אספו את ספרואידי ה-MSA ואת ה-HBSS/HSA והעבירו את כל הנפח לחלל הפריטונאלי דרך הקטטר כפי שהודגם כעת. לאחר מכן, בעזרת 100 µL של HBSS/HSA, שטפו את המבחנה המכילה את הספרואידים והעבירו את כל נפח הספרואידים לחלל הפריטונאלי.

הניחו רפידת גזה ספוגה בחומר חיטוי מעל הקטטר, הוציאו את הקטטר באיטיות מחלל הפריטוניום והשליכו אותו. בדקו את הקטטר כדי לוודא שאין בו ספרואידים שנותרו. לאחר מכן, עסו בעדינות את חלל הפריטוניום בעזרת האצבעות כדי להבטיח פיזור אחיד של הספרואידים.

מיד לאחר הזרקת הספרואידים בעכברים, העריכו את רמת ההפעלה של הספרואידים שהוכנו להזרקה על ידי העברה של 40 עד 120 ספרואידים למעטפת בתוך פלטת 6 או 12 בארות המכילה 1 עד 2 מיליליטר של Alpha MEM מועשר ב-2% FBS ו-1X penicillin streptomycin. לאחר שש שעות, העבירו את המצע מהבארים לשפופרות של 1.5 או 15 מיליליטר וסבבו את השפופרות בצנטריפוגה ב-450 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לבסוף, העבירו את ה-CM המזוקק לשפופרות חדשות של 1.5 מיליליטר והשתמשו בערכת ELISA מסחרית בהתאם לפרוטוקול הכתוב כדי לבחון את ריכוז ה-PGE-2.

כפי שניתן לראות כאן, כאשר כ-25,000 MSCs תלויות בטיפות של 35 µL של CCM, התאים מתקבצים תחילה לאגרגטים קטנים, אך בסופו של דבר מתמזגים כדי ליצור כדור דחוס יחיד לאחר 72 שעות בשיא הטיפה. איור זה מדגים כי היווצרות של כדורים דחוסים יחידים ו-XFM-1 דורשת תוספת של 13 mg/mL HSA, ריכוז המשקף את תכולת החלבון הכוללת המשוערת ב-CCM. במהלך הרכבת הכדור, הפנוטיפ של ה-MSCs משתנה באופן קיצוני, וכאשר הם נמצאים במדיום נטול קסנוגנאים (xeno-free) המוגדר כימית כראוי, ביטויהם של גורמים אנטי-דלקתיים רבים, כולל PGE2 ו-TSG6, עולה (up-regulated).

עם זאת, ייצור של TSG6 ו-PGE2 אינו מוגבר באופן ניכר ב-MSCs שגודלו כספירות ב-XFM-2 או ב-XFM-1 ללא HSA. לבסוף, בדומה להשפעות ה-in vitro, הזרקת ספירות XFM-1 HSA לחלל הפריטונאום של עכברים, מיד לאחר השראת דלקת מערכתית באמצעות מתן IV של LPS, העלתה את רמות ה-PGE2 וה-IL-10 בפריטונאום תוך הפחתה של TNF alpha פרו-דלקתי. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להכין כל פלטה של טיפות תלויות תוך דקה עד שתי דקות.

ניתן להשלים את ההזרקה התוך-peritoneum של ספרואידים שלמים תוך 5 עד 10 דקות לכל חיה, כאשר הפעולה מבוצעת כראוי. בעת ייצור ספרואידים של MSC באמצעות טכניקת טיפה תלויה (hanging drop), חשוב לזכור כי פורמולציות שונות של מצעי גידול נטולי רכיבים זרים (xeno-free) אינן שוות ביכולתן להניב היווצרות של ספרואידים ולהגביר את הביטוי של גנים טיפוליים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, כדי להבין את הארגון של ה-MSCs בתוך הספרואידים וכן כדי לבחון מסלולי איתות נוספים שעשויים להיות מופעלים ב-MSCs בחלקים שונים של הספרואיד.

לאחר פיתוח זה, שיטה זו אפשרה למדעני ה-MSC לחקור תנאי תרבית תלת-ממדיים אחרים ואת האופן שבו הם משפיעים על ה-priming של MSC ועל ביטוי גנים טיפולי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע priming ל-MSCs כספרואידים באמצעות טכניקת טיפת תליה (hanging drop), כיצד להעריך את יעילותם הטיפולית in vitro, וכיצד להחדיר ביעילות ספרואידים שלמים לעכברים לצורך בדיקת יעילות in vivo. וזכרו כי עבודה עם תאי גזע של בני אדם בוגרים דורשת ציוד והכשרה מיוחדים ועלולה להיות מסוכנת אם התאים אינם מטופלים כראוי.

יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים בכל עת בעת טיפול בתאי גזע של בני אדם בוגרים.