Name: ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (MSC) Spheroids הדרוך בתרבויות 3-D בתנאים קסנו ללא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: למד לייצר ולנהל ספרואידים של תאי גזע מזנכימליים (MSC) בתנאים קסנו ללא תוצרים מהחי. שיטה זו משפרת שרידות תאים ותפקוד לאחר השתלה, ומסייעת בפיתוח טיפולים רגנרטיביים מתקדמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי P40RR17447 מענקים מהמכון הלאומי לבריאות ופרס RP150637 מהמכון למניעת סרטן ומחקר בטקסס. ברצוננו להודות לד"ר דרווין ג'יי פרוקופ על תמיכתו בפרויקט.

<ol><li>Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+New+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: New directions.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).</li>
<li>English, K., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation+rejection+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect.Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance.</a> Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).</li>
<li>Le Blanc, K., Mougiakakos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+and+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system.</a> Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).</li>
<li>Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Paracrine+Immunomodulatory+Potential+of+Mesenchymal+Stromal+Cells+in+Three-Dimensional+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells Int. , 9176357(2016).</li>
<li>Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+formation%2C+use+and+understanding+of+multi-cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids.</a> Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).</li>
<li>Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+aggregates+of+mesenchymal+stem+cells%3A+cellular+mechanisms%2C+biological+properties%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+B.Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications.</a> Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Potapova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+support+migration%2C+extracellular+matrix+invasion%2C+proliferation%2C+and+survival+of+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro.</a> Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C.Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+hMSCs+Improve+Myocardial+Infarction+in+Mice+because+Cells+Embolized+in+Lung+Are+Activated+to+Secrete+the+Anti-inflammatory+Protein+TSG-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compaction+of+human+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+into+spheres+self-activates+caspase-dependent+il1+signaling+to+enhance+secretion+of+modulators+of+inflammation+and+immunity+%28PGE2%2C+TSG6%2C+and+STC1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1).</a> Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+cultured+as+spheroids+are+self-activated+to+produce+prostaglandin+E2+that+directs+stimulated+macrophages+into+an+anti-inflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype.</a> Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+human+mesenchymal+stromal%2Fprogenitor+cells+pre-activated+in+3-dimensional+cultures+under+different+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions.</a> Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).</li>
<li>Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html"> http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html</a> (2016).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Mesenchymal+Stromal+Cells%27+Paracrine+Immunomodulatory+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.Med.Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects.</a> Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production.</a> Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+two+negative+feedback+loops+place+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+at+the+center+of+early+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation.</a> Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).</li>
<li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+%27licensing%27%3A+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process.</a> Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).</li>
<li>Saleh, F. A., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+round%3A+multipotent+stromal+cells%2C+a+three-dimensional+revolution%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?</a> Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).</li>
<li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction%2C+fusion%2C+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+A%22%5BJournal%5D)">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li>
<li>Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+bullet+formation+via+E-cadherin+promotes+therapeutic+potency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction.</a> Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

MSC האופטימלי לשימוש בכמה יישומי מחקר קליניים צריך להיות מופעל ביותר על מנת למקסם את התועלת שלהם, והכין מועדף בתנאי XF הגדרה כימית כדי למזער את המסירה של אנטיגנים פוטנציאל מרכיבים בינוניים xenogeneic כגון FBS. בפרוטוקולים המתוארים כאן, הראינו שיטות 1) להפעיל MSCs בתרבות 3D ידי היווצרות spheroids, 2) להשיג את הפעלת 3D של MSCs בתנאי XF, 3) להעריך את רמות ההפעלה של אליפטית MSCs לגבי אנטי שלהם דלקתית,-modulatory חיסונית, וכן פוטנציאל אנטי-סרטני, ו -4) לספק MSCs להפעילם מספר בלתי מוגבל...

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) הראה פוטנציאל גדול עבור גישות רפואת רגנרטיבית שונות. MSCs בתחילה בודדו כמרכיב סטרומה של מח העצם אבל מאז התקבלו מחברת רקמות בוגרות רבות אחרות, כולל רקמת שומן 1, 2, 3. מעניין לציין, כי שיטת הבידוד העיקרית מחבק תכונה יוצאת דופן של MSCs להיצמד בחוזקה על פלסטיק בתרבית רקמה בנוכחות בסרום שור העובר (FBS). בעוד טכניקת בידוד המסורתית הזה מאפשרת רחבה קלה ומהירה של MSCs ב דו ממדים (2D) תרבות, זה גם מאוד מלאכותי ומתעלם משמעות של תלת ממדי (3D) בסביבה המקורית שמובילה לאובדן פוטנציאל של מאפיינים תאיים חשובים 4, 5 , 6. לכן, המחקר של MSCs בתרבויות 3D, אשרהם יותר פיסיולוגיים מאשר תרבויות 2D מסורתיות, התפתח בחיפוש עבור &quot;אבדו / פחתה&quot; מאפייני MSC. יתר על כן, עניין רב עלה לזהות תנאים מוגדרים קסנו-חינם (XF) כימי לתרבות הפעלת MSC, ובכך להפוך את התאים יותר נוחים עבור יישומים קליניים. מחקרים רבים פורסמו הוכחת תרבות 3D של MSCs היא biomaterials וכפי אגרגטים או spheroids כדוריים. MSCs ב biomaterials בתחילה תוכנן עבור גישות הנדסת רקמות להחליף רקמות פגועות עם פיגומי תא זרע, ואילו תרבויות אליפטית של MSCs נראו כדרך להבין את התנהגות MSC in vivo לאחר מתן של התאים עבור טיפולים בניסויים פרה-קליניים או קליניים 4, 5, 7. מעניין, spheroids טופס MSCs ספונטני כאשר דבקות פלסטיק בתרבית רקמה אינה מותרת8, 9, 10. באופן מסורתי, צבירה התא התאפשרה על ידי שיטות בקבוק טווה או טכניקות כיסוי נוזלי, שיטות השתמשו בתחילה בביולוגיה סרטן במאמצים לנסות לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול. לאחרונה, שיטות נוספות צצו ממחישי צבירת תא כלי תרבות מראש מצופית עם כימיקלים מסוימים כדי למנוע תא אל הפלסטיק דבק 4, 5, 6. אחת השיטות הפשוטות ביותר וחסכוני ליצור spheroids MSC היא תרבות אותם בטיפות תלויים, טכניקה ששימשה לעתים קרובות לייצר גופים embryoid מתאי גזע עובריים. עם תלוי טכניקת תרבות ירידה, דבקות תא הפלסטיק בתרבית רקמת נמנע בשל השעיית תאי ירידה של מדיום על החלק התחתון של מכסת צלחת בתרבית רקמה ומאפשר הכביד כדי להקל תא aggregation ב הקודקוד של ירידה. גודל אליפטית ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי ריכוז התא או נפח ירידה, מה שהופך תרבויות Drop Hanging במיוחד קל לשלוט. מחקרים מוקדמים על תרבות 3D של MSCs הפגינו שוני קיצוני קיים בין המאפיינים של תאי 3D לעומת עמיתיהם 2D שלהם 6, 8, 9. במקביל, דיווחים הראו כי ההשפעות המיטיבות של MSCs in vivo הסתמכה על יכולתם להיות מופעל על ידי רמזים מיקרו-סביבתיים, בתגובה, כדי לייצר אנטי דלקתי אימונו גורמי 11. מעניין לציין, כי רבים של גורמים אלה כגון פרוסטגלנדין E2 (PGE2), מגורה גורם נמק גידול גן 6 (TSG6), ואת גורם הגדילה hepatocyte (HGF) יוצרו בכמויות הרבה יותר גדול על ידי spheroids MSC מ MSCs 2D המסורתית לסלול את הדרך עבור רעיון שלבתרביות 3D כדי להפעיל את תאי 8, 12, 13. יתר על כן, הפעלת גנים בתרבויות 3D הופיע לשחזר מנגנונים, לפחות חלקית, של הפעלת תא לאחר ההזרקה לעכברים 12. על ידי הפעלת MSCs לפני השימוש בם בניסויים, אפקטים של התאים עשויים להתמשך ובולטים יותר כהשפעת MSC המסורתית in vivo היא לעתים קרובות מתעכבת וחולפת, והוא יכול להיות מתואר כמו &quot;פגע וברח&quot;. במהלך השנים האחרונות, מחקרים תפקודיים חשובים באמצעות spheroids MSC הוכיחו כי הם יכולים לדכא תגובות דלקתיות ולווסת חסינויות in vivo באמצעות השפעה על תאי מפעיל כגון מקרופאגים, תאים דנדריטים, נויטרופילים, ותאי T ביצוע spheroids צורה אטרקטיבית של MSCs הדרוך 2 , 3. בנוסף, ייצור של מולקולות אנטי-סרטניות, כגון interleukin-24 (IL-24) ו נימקים גידול קשור גורם ליגנד וישכנע אפופטוזיס (TRAIL), גוברים בתרבויות 3D של יחסי MSCs כדי חד שכבתי MSCs, תופעה שעלולה להיות מנוצלת על בטיפולי הסרטן ממוקד 8, 10, 14. כמו התרבות MSC המסורתית נדרשה לא רק את שימוש פלסטיק בתרבית רקמה אלא גם FBS, משוכה נוספת וגדילה ל spheroids MSC יותר נוחה לשימוש קליני היה הצורך להתגבר. כדי להתמודד עם המשוכה הזאת, הראינו היווצרות לאחרונה של spheroids MSC בתנאי XF ספציפי הגדרה כימית והקמתי כי spheroids MSC וכתוצאה מכך הופעל לייצר המולקולות אנטי-דלקתית ואנטי-הסרטניות הזהות spheroids שנוצר בתנאים עם FBS 14. הנה, ממצאים אלה מוצגים בכמה פרוטוקולים מפורטים המדגימים את הדור של MSCs מראש המופעל בתרבויות 3D באמצעות XFכְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת. בנוסף, פרוטוקולים מוצגים המתארים דרכים יעילות כדי להעריך את רמות ההפעלה של MSCs לגבי ההשפעות אנטי דלקתית, המערכת החיסונית ואנטי סרטן שלהם, יחד עם שיטה מעשית כדי לספק את spheroids השלם לעכברים.

<table><tbody><tr><td>MEM-ואלפא; (אלפא בינוני חיוני מינימלי)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>12561049; 12561056; 12561072</td><td>מדיום חיוני מינימלי להכנת מדיום גידול MSC (CCM)</td></tr><tr><td>FBS (סרום בקר עוברי), פרימיום נבחר</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11595; S11510; S11550; S11595-24</td><td>רכיב של מצע תרבית שלם לכל סוגי התאים</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25030081; 25030149;</td><td>מרכיב 25030164 של מצע תרבית שלם לכל סוגי התאים</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>מרכיב</td><td>15070063 של מצע תרבית שלם לכל סוגי התאים</td></tr><tr><td>יחידות סינון עיקור, 0.22 ומיקרו; m קרום PES</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; </td><td>עיקור מדיה</td>SCGPU11RE</tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 150 מ"מ</td><td>Nunc</td><td>D8554&nbsp; </td><td>תרבית תאים</td>SIGMA</tr> תרמו <tr><td>פורמה מעטפת מים CO2 חממה לחה</td><td>Thermo Fisher</td><td>דגם 3110</td><td>דגירה של תאים מתורבתים</td></tr><tr><td>MCSs מעבר מוקדם</td><td>מרכז להכנה והפצה של תאי גזע בוגרים בטקסס A& מרכז מדעי הבריאות M המכללה לרפואה לרפואה המכון לרפואה רגנרטיבית בסקוט & </td> הכנת <td>NA</td> לבנה <td>של תרביות דו-ממדיות ותלת-ממדיות של אמבט מים MSCs</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89501-468</td><td>ל-37 מעלות; C</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>492000904</td><td>טיפול ידני בנוזלים</td></tr><tr><td>Pipete-Aid</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-300</td><td>טיפול בפיפטים סראולוגיים</td></tr><tr><td>Costar סטרילי פיפט סרולוגי (5, 10, 25 ו-50 מ"ל)</td><td>קורנינג</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td><td>טיפול בנוזל</td></tr><tr><td>PBS (מי מלח חוצץ פוספט), pH 7.4</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10010023; 10010072; 10010031; </td><td>10010049 עיבוד תרבית תאים</td></tr><tr><td>0.25% תמיסת טריפסין/EDTA</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>הרמת תאים דבקים ופיזור אגרגטים של תאים</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>צנטריפוגת</td><td>תאים</td></tr><tr><td>352097 50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>צנטריפוגת</td><td></td> תאים 352098</tr><tr><td>Eppendor</td><td>Eppendorf / Fisher</td><td>Scientific Model 5810R</td> המוציטומטר <td>צנטריפוגה תאים</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>26716</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>טריפאן כחול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154 SIGMA</td><td>אי הכללת תאים מתים במהלך ספירת תאים בהמציטומטר</td></tr><tr><td>מוגדר xenofree MSC medium-1 (XFM-1)</td> <td>ThermoFisher / Gibco</td><td>A1067501</td><td>מדיה נטולת קסנו שפותחה במיוחד לצמיחה והרחבה של תאי גזע מזנכימליים אנושיים</td></tr><tr><td>מוגדרת xenofree MSC medium-2 (XFM-2)</td> <td>Stem Cell Technologies</td><td>5420</td><td>מדיום מוגדר ונטול קסנו לתאי גזע מזנכימליים אנושיים</td></tr><tr><td>HSA (אלבומין בסרום אנושי)</td><td>Gemini</td><td>800-120</td><td>רכיב של מדיה MSC נטולת קסנו</td></tr><tr><td>rHSA (אלבומין סרום אנושי רקומביננטי)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&nbsp; רכיב SIGMA</td><td>של מדיה MSC נטולת xeno</td></tr><tr><td>בידוד RNA כולל ערכת מיני</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>מיצוי RNA כולל</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>הומוגניזציה של דגימה לפני מיצוי RNA כולל</td></tr><tr><td>ערכת DNase ללא RNAse&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>חיסול DNA על העמודה במהלך מיצוי RNA כולל</td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6250&nbsp; </td><td>עיכוב ALDRICH של RNAs במאגר RLT</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td>דגימת ערבוב</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Biorad</td><td>NA</td><td>RNA ריכוז ואיכות</td></tr><tr><td>קיבולת גבוהה ערכת שעתוק הפוך cDNA ThermoFisher</td><td>/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>שעתוק של סך ה-RNA לתוך</td></tr><tr><td>מבחני ביטוי גנים</td> cDNA <td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>משתנה</td><td>שילוב פריימר/בדיקה עבור PCR</td></tr><tr><td>מהיר אוניברסלי PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4352042; 4364103; 4366073; תערובת</td><td>מאסטר 4367846 לתגובת PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>מערכת PCR בזמן אמת (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td> <td>ABI Prizm</td><td>NA</td> צינור צנטריפוגה <td>PCR</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל</td> בזמן אמת <td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>צנטריפוגה של תאים, איסוף ואחסון דגימות</td></tr> <tr><td>(-80 & deg; ג) מקפיא</td><td>תרמו פישר</td><td>דגם Thermo Forma 8695</td><td>אחסון דוגמאות</td></tr><tr><td>PGE2 (פרוסטגלנדין E2) ELISA Kit</td><td>R& D Systems</td><td>KGE004B</td><td>הערכת ריכוז הציטוקינים בדגימה</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s שונה Eagle medium)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10566-016; 10566-024; 10566-032</td><td>מדיית תרבית מקרופאגים</td></tr><tr><td>J774 מקרופאגים עכברים</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>קו תאים מקרופאגים עכבר</td></tr><tr><td>12 בארות צלחת</td><td>קורנינג</td><td>3513</td><td>במבחנה גירוי מקרופאגים</td></tr><tr><td>LPS (ליפופוליסכריד)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L4130</td><td>במבחנה גירוי מקרופאגים</td></tr><tr><td>עכבר TNF-a ערכת ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>MTA00B</td><td>הערכת ריכוז הציטוקינים בדגימה</td></tr><tr><td>עכבר IL-10 (אינטרלוקין 10) ערכת ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>M1000B</td><td>הערכת ריכוז הציטוקינים בדגימה</td></tr><tr><td>RPMI-1640 בינוני</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>11875-085</td><td>מדיה לתרבית טחול</td></tr><tr><td>עכברי BALB/c</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>651</td><td>in vivo משלוח ספרואידים; הכנת טחול</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e Functional Grade</td><td>Purified eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>in vitro גירוי טחול</td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת M&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>352350</td><td>הכנת טחול</td></tr><tr><td>תמיסת ליזה של תאי דם אדומים (1x)</td> <td>Affymetrix eBioscience</td><td>00-4333</td><td>הסרת כדוריות דם אדומות במהלך בידוד הטחול</td></tr><tr><td>עכבר IFN-&#947; (אינטרפרון גמא) ערכת ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>MIF 00</td><td>אומדן ריכוז הציטוקינים בדגימת</td></tr><tr><td>תאי סרטן הערמונית LNCaP&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>חוקר את ההשפעה של MSCs תלת מימדיים על קווי תאים סרטניים in vitro</td></tr><tr><td>DNA ערכת בדיקת התפשטות תאים מבוססת</td> DNA <td>ThermoFisher</td><td>C7026</td><td>מדידת מספר תאים המבוססת על תכולת DNA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>רכיב של מגיב ליזה</td></tr><tr><td>EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)</td> <td>ThermoFisher</td><td>FERR1021</td><td>כלאטור סידן, רכיב של מגיב ליזה</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>פירוק RNA למדידת</td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות רב-מצבי מבוסס מסנן</td><td>DNA BMG Technology</td><td>NA</td><td>Microplate astests (ELISA, כימות תאים, etc.)</td></tr><tr><td>HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס), ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>14175079</td><td>חידוש של ספרואידים MSC לפני זריקות in vivo</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>MWI אספקת וטרינר</td><td>502017</td><td>הרדמה לזריקות in vivo</td></tr><tr><td>חמצן, גז דחוס</td><td>Praxair</td><td>NA</td><td>לשימוש עם איזופלורן</td></tr><tr><td>תרמו פורמה BSL-2 ארון</td><td>תרמו פישר</td><td>דגם 1385</td><td>תרבית תאים סטרילית</td></tr><tr><td>בטיחות IV קטטר/סטילטו מחט, 20 גרם, 1 אינץ'</td><td>Terumo</td><td>SR*FNP2025</td><td>אספקת שפרואידים לחלל הצפק</td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה סטריליים</td><td>Eppendorf</td><td>משתנה</td><td>טיפול בנוזל/תאים</td></tr></tbody></table>

ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (msc) spheroids הדרוך בתרבויות 3-d בתנאים קסנו ללא

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) מחזיקים הבטחה גדולה Bioengineering ורפואה רגנרטיבית. MSCs יכול להיות מבודד רקמות בוגרות מרובות באמצעות הדבקות החזקה שלהם פלסטיק בתרבית רקמה ולאחר מכן להרחיב עוד יותר במבחנה, לרוב תוך שימוש בסרום שור עובר (FBS). מאז FBS יכול לגרום MSCs להפוך immunogenic, נוכחותה תרבויות MSC המגבילה הוא יישומים קליניים וניסויים של התאים. לכן, מחקרים והעסיקו עובדים ללא קסנו הגדרה כימית (XF) מדיה עבור תרבויות MSC היא יקרה ערך. השפעות מועילות רבות של MSCs יוחסו יכולתי לווסת דלקת חסינות, בעיקר באמצעות הפרשת גורמי מערכת חיסוניים כגון גן גורם מגורה נימק גידול 6 (TSG6) ו פרוסטגלנדין E2 (PGE2). עם זאת, MSCs מחייב הפעלה לייצר גורמים אלה שכן ההשפעה של MSCs היא לעתים קרובות חלף, עניין רב התפתח לגלות דרכים של טרום הפעלת PRIO התאיםr כדי השימוש בהם, ובכך לחסל את זמן השהיה עבור ההפעלה in vivo. כאן אנו מציגים פרוטוקולים כדי להפעיל ביעילות או MSCs הממשלה תלת ממדי (3D) תרבויות בתנאי XF הגדרה כימית ולנהל MSCs מראש מופעל אלה in vivo. באופן ספציפי, אנו מתארים שיטות ראשונות שיצרו MSC הכדורי-רקמות מייקרו או &#39;spheroids&#39; בטיפות תלויות באמצעות מדיום XF ולהדגים כיצד הספירות והתנו הבינוני (CM) ניתן לקצור עבור יישומים שונים. שנית, אנו מתארים מסכי ביטוי גנים במבחנת מבחנים תפקודיים כדי להעריך את הרמה במהירות של הפעלת MSC ב spheroids, תוך שימת דגש על הפוטנציאל אנטי-דלקתי ואנטי-סרטני של התאים. שלישית, אנו מתארים שיטה חדשה להזריק spheroids MSC השלם לתוך חלל הצפק העכבר לבדיקות יעילות vivo. בסך הכל, את הפרוטוקולים בזאת להתגבר על האתגרים העיקריים של קבלת MSCs מראש מופעל תחת con XF הגדרה כימיתditions ולספק מערכת גמישה לניהול spheroids MSC עבור טיפולים.

בעבודה הנוכחית, תרבויות ירידה תלויות הועסקו כדי ליצור רקמות מייקרו כדורי קומפקטיות או &#39;spheroids&#39; של MSCs מופעל בתנאי XF. מפת דרכי המחקר באיור 1 מתארת כי MSCs מעודד עצמי להרכיב לתוך spheroids מרחף תלוי טיפות במשך 72 שעות, שלאחריו spheroids, או CM עמוסה גורמים טיפוליים הנגזר בתחום, ניתן לאסוף ולנצל פוטנציאל בשני מחקר ויישומים קליניים. המספר הגדול של תאים הדרושים לייצור בתחום ניתן לרכוש בתוך שבוע על ידי זריעת MSCs בצפיפות נמו...

הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע/סטרומה מזנכימליים (MSCs) מתועד היטב, אולם השיטה הטובה ביותר להכנת התאים לחולים נותרה שנויה במחלוקת. כאן, אנו מתקשרים פרוטוקולים ליצירה וניהול יעיל של אגרגטים כדוריים טיפוליים או 'ספרואידים' של MSCs המוכנים בתנאים נטולי קסנו ליישומים ניסיוניים וקליניים.

ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (MSC) Spheroids הדרוך בתרבויות 3-D בתנאים קסנו ללא

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

המטרה הכוללת של ניסויים אלו היא לייצר ולהזריק ביעילות אגרגטים תרפויטיים כדוריים, או ספרואידים, של תאי גזע/סטרומה מזנכימליים, או MSCs, שהוכנו תחת תנאים נטולי רכיבים זרים (xeno-free) עבור יישומים ניסיוניים וקליניים. שיטות אלו יכולות לסייע בהסרת חסמים מרכזיים בתחום הטיפולים ב-MSCs, כגון שיעורי שימור, הישרדות ותפקוד תאיים נמוכים. תופעות אלו נראות לעיתים קרובות לאחר השתלה של תאים מפוזרים ובעקבות תנאים עוינים הנלווים בדרך כלל לפגיעה ברקמות.היתרון המרכזי של הליכים אלו הוא שניתן להכין, להפעיל ולהזריק את הספרואידים של ה-MSC ללא מוצרים חיסוניים ממקור חייתי, כגון FBS, אשר מגבילים כיום חלק מהיישומים הקליניים של התאים ועלולים להטות את הפרשנות של נתונים פרה-קליניים מסוימים. למרות שמנגנון זה עשוי להועיל מאוד בתיווך היעילות מבוססת ה-MSC, ניתן להשתמש בו גם כדי להבין תיקון רקמות המתווך על ידי MSC, וכן כיצד פורמולציות אחרות של מצעים עשויות לשנות את הפרופיל הטיפולי. את ההליכים הללו ידגימו Josh Beaver ו-Bret Clough, שני טכנאים מהמעבדה שלי.לאחר זריעה ודגירה של תאי גזע מזנכימליים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו ב-trypsin ו-EDTA כדי לקצור את התאים. לאחר סרצ'יפוגציה של התאים הנקצרים ב-450 ×g, רכזו את כל התאים לשפופרת קונית אחת עם המצע המתאים. סרצ'יפוגו את התאים והשאיבו מחדש את המשקע בנפח קטן של מצע. לאחר מכן, לאחר ספירת התאים, כדי להפיק ספרואידים של כ-25,000 תאים, דללו את ה-MSCs הנקצרים באחד מהמצעים הבאים בריכוז של 714 תאים ל-µL.בשלב הבא, טפטפו בעזרת פיפטה טיפות של 35 microliter של התאים על הצד התחתון של מכסה צלחת תרבית הפוכה בקוטר 150 millimeter. העבירו 20 milliliters של PBS בטמפרטורת החדר לתחתית הצלחת ובתנועה אחת רציפה ויציבה, הפכו את המכסה המכיל את הטיפות כך שקודקודי הטיפות יפנו כלפי מטה. לאחר מכן, הניחו בזהירות את המכסה על תחתית צלחת התרבית.העבירו את הצלחת לאינקובטור למשך שלושה ימים ללא הפרעה כדי לאפשר הרכבה תקינה של הספירות. לאחר האינקובציה, התחילו בקציר הספרואידים על ידי הסרה זהירה של המכסה והפיכתה כך שהטיפות יפנו שוב כלפי מעלה. לאחר מכן, הגביהו את המכסה בזווית של כ-10 עד 20 מעלות והשתמשו במגבי תאים (cell lifter) כדי לדחוף את הטיפות המכילות את הספרואידים לקצה הצלחת.בעזרת פפיטה של 1 ml, העבירו את המדיום שבעקץ של הספירה למבחנה קונית של 15 ml, והשתמשו ב-PBS בטמפרטורת החדר ובאותו טיפ פפיטה כדי לשטוף את הפלטה ולהבטיח השחזה מקסימלית של הספרואידים. עבור בדיקות real-time PCR, סבבו את תגלי המבחנה של הספירות ב-450 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאבו את העלייה.שטפו את הספרואידים באמצעות PBS וחזרו הן על שלב הצנטריפוגה והן על שלב השאיבה. לצורך הזרקה לבעלי חיים, אפשרו לכדורים לשקוע לתחתית המבחנה ללא צנטריפוגה. כדי לאסוף מצע מותנה (conditioned medium), או CM, לבדיקות של פוטנציאל אימונו-מודולטורי ואנטי-סרטני, אספו את הספרואידים ואת מצע ה-CM למבחנה קונית של 15 מיליליטר באמצעות cell lifter ופיפטה, כפי שהודגם הרגע.עם זאת, אין לשטוף את המכסים ב-PBS. לאחר סרטיפוגציה ב-450 ×g למשך 5 עד 10 דקות, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנות של 1.5 milliliter. סרטיפוגו את הנוזל העליון ב-10,000 ×g ובטמפרטורת החדר למשך 5 עד 10 דקות.לאחר מכן, השתמשו בפיפט כדי לאסוף בזהירות את ה-CM המזוכל לשפופרות חדשות בנפח 1.5 milliliter לאחסון בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. לאחר הכנת הספרואידים כפי שהודגם כעת בסרטון זה והמתנה של שלוש עד ארבע דקות עד שישקעו לתחתית השפופרת, שאבו את העלייה (supernatant) ושטפו את הספרואידים על ידי הוספת HBSS מועשר ב-0.2 to 0.5%HSA כדי לשמור על תנאים נטולי חלבונים זרים (xeno-free). לאחר מכן, שאבו את העלייה.כסו את הספרואידים ב-100 עד 200 microliters של HBSS/HSA סטרילי והניחו את המבחנות על קרח. לאחר הרדמת עכבר בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הניחו את בעל החיים בתוך תא בטיחות ביולוגית BSL-2, כאשר הצד הגבי פונה מטה, והשתמשו ב-70% ethanol לחיטוי הבטן התחתונה של העכבר. הסירו את הפקק של קטטר תוורידי במידה 20-gauge, ובזמן החזקת עור העכבר ביד אחת, אתרו את מרכז הקו הדמיוני המחבר בין מפרק ברך כפוף לבין אזור איברי המין, ובבעזרת קצה המחט של מכלול הסטילטו (stiletto) של הקטטר המופנה לכיוון קו האמצע, השתמשו ביד השנייה לביצוע הזרקה תוצלומית (intraperitoneal injection).הוצא בעדינות את מחט הסטילטו (stiletto) המתכתית ממכלול קתטר הסטילטו. בדוק אם על הסטילטו ישנם דם, שתן או צואה והשלך אותה. ודא את מיקומו התקין של הקתטר הפלסטי על ידי הכנסת טיפ של פפיטה בנפח 100 עד 200 microliter עם 100 microliters של HBSS/HSA סטרילי לתוך מתאם המזרק של הקתטר, כך שייווצר איטום הדוק.לאחר מכן, הזרקו לאט את הנוזל לתוך החלל הפריטונאלי. באמצעות טיפ של פיפט של 100 עד 200 µL, אספו את ספרואידי ה-MSA ואת ה-HBSS/HSA והעבירו את כל הנפח לחלל הפריטונאלי דרך הקטטר כפי שהודגם כעת. לאחר מכן, בעזרת 100 µL של HBSS/HSA, שטפו את המבחנה המכילה את הספרואידים והעבירו את כל נפח הספרואידים לחלל הפריטונאלי.הניחו רפידת גזה ספוגה בחומר חיטוי מעל הקטטר, הוציאו את הקטטר באיטיות מחלל הפריטוניום והשליכו אותו. בדקו את הקטטר כדי לוודא שאין בו ספרואידים שנותרו. לאחר מכן, עסו בעדינות את חלל הפריטוניום בעזרת האצבעות כדי להבטיח פיזור אחיד של הספרואידים.מיד לאחר הזרקת הספרואידים בעכברים, העריכו את רמת ההפעלה של הספרואידים שהוכנו להזרקה על ידי העברה של 40 עד 120 ספרואידים למעטפת בתוך פלטת 6 או 12 בארות המכילה 1 עד 2 מיליליטר של Alpha MEM מועשר ב-2% FBS ו-1X penicillin streptomycin. לאחר שש שעות, העבירו את המצע מהבארים לשפופרות של 1.5 או 15 מיליליטר וסבבו את השפופרות בצנטריפוגה ב-450 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לבסוף, העבירו את ה-CM המזוקק לשפופרות חדשות של 1.5 מיליליטר והשתמשו בערכת ELISA מסחרית בהתאם לפרוטוקול הכתוב כדי לבחון את ריכוז ה-PGE-2.כפי שניתן לראות כאן, כאשר כ-25,000 MSCs תלויות בטיפות של 35 µL של CCM, התאים מתקבצים תחילה לאגרגטים קטנים, אך בסופו של דבר מתמזגים כדי ליצור כדור דחוס יחיד לאחר 72 שעות בשיא הטיפה. איור זה מדגים כי היווצרות של כדורים דחוסים יחידים ו-XFM-1 דורשת תוספת של 13 mg/mL HSA, ריכוז המשקף את תכולת החלבון הכוללת המשוערת ב-CCM. במהלך הרכבת הכדור, הפנוטיפ של ה-MSCs משתנה באופן קיצוני, וכאשר הם נמצאים במדיום נטול קסנוגנאים (xeno-free) המוגדר כימית כראוי, ביטויהם של גורמים אנטי-דלקתיים רבים, כולל PGE2 ו-TSG6, עולה (up-regulated).עם זאת, ייצור של TSG6 ו-PGE2 אינו מוגבר באופן ניכר ב-MSCs שגודלו כספירות ב-XFM-2 או ב-XFM-1 ללא HSA. לבסוף, בדומה להשפעות ה-in vitro, הזרקת ספירות XFM-1 HSA לחלל הפריטונאום של עכברים, מיד לאחר השראת דלקת מערכתית באמצעות מתן IV של LPS, העלתה את רמות ה-PGE2 וה-IL-10 בפריטונאום תוך הפחתה של TNF alpha פרו-דלקתי. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להכין כל פלטה של טיפות תלויות תוך דקה עד שתי דקות.ניתן להשלים את ההזרקה התוך-peritoneum של ספרואידים שלמים תוך 5 עד 10 דקות לכל חיה, כאשר הפעולה מבוצעת כראוי. בעת ייצור ספרואידים של MSC באמצעות טכניקת טיפה תלויה (hanging drop), חשוב לזכור כי פורמולציות שונות של מצעי גידול נטולי רכיבים זרים (xeno-free) אינן שוות ביכולתן להניב היווצרות של ספרואידים ולהגביר את הביטוי של גנים טיפוליים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, כדי להבין את הארגון של ה-MSCs בתוך הספרואידים וכן כדי לבחון מסלולי איתות נוספים שעשויים להיות מופעלים ב-MSCs בחלקים שונים של הספרואיד.לאחר פיתוח זה, שיטה זו אפשרה למדעני ה-MSC לחקור תנאי תרבית תלת-ממדיים אחרים ואת האופן שבו הם משפיעים על ה-priming של MSC ועל ביטוי גנים טיפולי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע priming ל-MSCs כספרואידים באמצעות טכניקת טיפת תליה (hanging drop), כיצד להעריך את יעילותם הטיפולית in vitro, וכיצד להחדיר ביעילות ספרואידים שלמים לעכברים לצורך בדיקת יעילות in vivo. וזכרו כי עבודה עם תאי גזע של בני אדם בוגרים דורשת ציוד והכשרה מיוחדים ועלולה להיות מסוכנת אם התאים אינם מטופלים כראוי.יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים בכל עת בעת טיפול בתאי גזע של בני אדם בוגרים.

production-administration-therapeutic-mesenchymal-stemstromal-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

Culturing תאי mesenchymal סטרומה אדם (hMSCs) עם סרום אוטולוגי, מפחית את הסיכונים של דחייה על ידי חומר xenogeneic והשפעות שליליות אחרות. זה גם מאפשר ההתאוששות של תת-קבוצה של אבות mesodermal, אשר יכול לספק hMSCs הטרי. Embedding hMSCs ב קריש הפיברין עצמי מאפשר טיפול קל והשתלת כירורגים יעילה.

תרבות משלוח Cell mesenchymal סטרומה ב עצמי תנאים: גישה חכמה עבור יישומים אורתופדיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של culturing ברצועה חניכיים האדם (PDL) תא spheroids על ידי סרטים chitosan. תרבות של הספרואידים תלת ממדיים (3D) הסלולר מספק אלטרנטיבה של מערכת התרבות הקונבנציונלית פוליסטירן מרקמת רקמה (TCPS).

היווצרות של חניכיים האדם ברצועה הספרואידים תא על סרטים Chitosan

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור מספר רב של אקסוזומים ברמת GMP מתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי באמצעות ביוריאקטור תלת-ממדי.

הכנה בקנה מידה גדול של אקסוזומים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי על ידי תרבית ביוריאקטור תלת-ממדית

כאן, אנו מתארים את הייצור בקנה מידה גדול של כדוריות סטרומליות/תאי גזע שמקורן בשומן (ASC) באמצעות מערכת פיפטינג אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח הומוגניות של גודל וצורת ספרואידים. כדורי ASC אלה יכולים לשמש כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

ייצור אוטומטי בקנה מידה גדול של כדורי תאי גזע שמקורם בשומן להדפסה ביולוגית תלת-ממדית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקצירת תאים דבקים מצלוחיות רב-שכבתיות באופן סגור חצי אוטומטי באמצעות מערכת צנטריפוגות נגד הזרמה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור קצירת תאים דבקים ותרחיפים מפלטפורמות הרחבת תאים אחרות עם שינויים מעטים בשלבים הקיימים.

עיבוד תאי גזע מזנכימליים אנושיים ליישומים קליניים באמצעות זרימת עבודה סגורה חצי אוטומטית

מוצרים קסנוגניים (כימיים או מן החי) שהוכנסו בשלבי ההכנה/מניפולציה של הטיפול התא קשורים לסיכון מוגבר לתגובתיות חיסונית ולהעברה פתוגנית בחולים מארחים. כאן מתוארת שיטה שלמה נטולת קסנוגנים לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי.

בידוד ותרבית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי בשיטה חדשנית נטולת קסנוגניות לטיפול בבני אדם

מתואר פרוטוקול לייצור מיקרו-נשא-מיקרוביוריאקטור של תאים התלויים בעיגון כטיפולים פוטנציאליים מבוססי תאים. בהתמקדות במקרה שימוש של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה, מוצגים תפוקת תאים דומה וביטוי גנים חיובי ביחס לתנאי תהליך מבוססי בקבוקון. פרוטוקול זה ניתן להרחבה לתאים תלויי עיגון אחרים ולסימני יעד.

ייצור מבוסס מיקרוביוריאקטורים של תאי סטרומל מזנכימיים התלויים בעיגון, המוכנים לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה

בזאת אנו מתארים שיטות לנתיחה של רקמות יולדות ועובר מן שלית מונח אנושית, ואחריו בידוד והרחבת גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) מרקמות אלה.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

שיטה לגידול תסיסנית בתנאי axenic ו gnotobiotic מוצגת. עוברי זבובים הם dechorionated ב חומצת נתרן, הועברו בסביבה נקיה מחיידקים לתזונה סטרילי, וגדלו במיכלים סגורים. ייחסתי דיאטה ועובר עם חיידקים מובילים עמותות gnotobiotic, ונוכחות חיידקים אושר על ידי ציפוי homogenates תסיסנית הגוף כולו.

גידול זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתנאי Axenic ו Gnotobiotic

למד לייצר ולנהל ספרואידים של תאי גזע מזנכימליים (MSC) בתנאים קסנו ללא תוצרים מהחי. שיטה זו משפרת שרידות תאים ותפקוד לאחר השתלה, ומסייעת בפיתוח טיפולים רגנרטיביים מתקדמים.

ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (MSC) Spheroids הדרוך בתרבויות 3-D בתנאים קסנו ללא

גלה סרטונים נוספים