כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת זרחון עצמי של היסטידין קינאזות חיידקיות מטוהרות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיתות הדו-רכיבי. כגון ההשפעה של גירויים קוגנטיים באינטראקציות חלבון-חלבון על זרחון עצמי של היסטידין קינאזות.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שמדובר בשיטה בעלת תפוקה גבוהה שניתן להשתמש בה כדי לזהות במדויק פיקומולים של פוספוהיסטדין שנוצרו ולקבל פרמטרים קינטיים עבור היסטידין קינאזות. כפוסט-דוקטורנט, אני משתמש בסינון על ממברנות ניטרוצלולוזה כדי לכמת ליגנדים רדיואקטיביים הקשורים לחלבון. כתוצאה מכך, היה הגיוני לפתח טכניקה דומה לכימות זרחון היסטידין בהיסטידין קינאזות חיידקיות.

התחל הליך זה בהכנת ריאגנטים וחומרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להקים את מנגנון עלילת הנקודות של 96 בארות, חותכים חתיכה של שמונה סנטימטר על 12 סנטימטר של קרום ניטרוצלולוזה. מקם את הניטרוצלולוזה במנגנון עלילת הנקודות.

ודא שהקרום מתאים כך שהמנגנון אטום וכל הבארות מכוסות לחלוטין על ידי הממברנה. כדי לאסוף את הסינון, חבר את המכשיר לבקבוק זרוע צד משני. מגזע השסתום, חבר צינורות מתאימים כדי לאפשר שימוש נוח במנגנון מבלי להטות את הבקבוק המשני.

לאחר מכן, חבר את בקבוק זרוע הצד המשני למקור ואקום שואב. בדוק שהמנגנון אטום לחלוטין על ידי החלת ואקום על המכשיר. אם המנגנון מורכב כהלכה, יהיה ואקום חזק בכל הבארות.

ניתן לעטוף את כל חיבורי הצינורות בניילון Parafilm או Saran כדי להבטיח אטימה הדוקה. לפני ההתחלה, הכן את כל ארבעת רכיבי התגובה כארבעה פתרונות מלאי X, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מערבבים נפחים שווים של מאגר תגובה, היסטידין קינאז ומים מזוקקים כפולים.

אפשר לרכיבי התגובה הללו להתאזן בטמפרטורת החדר לזמן קצר. כדי ליזום את התגובה, הוסף נפח אחד של תמיסת גמא-32 P ATP וערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה. עקוב אחר זמן התגובה שחלף באמצעות טיימר ואפשר לתגובה להמשיך בזמן הרצוי.

להרוות את התגובה. הוסף מנה של התגובה לחומצה זרחתית של 325 מילי-מולרי. הנח מיד את התגובות המרוות על קרח עד לסיום כל התגובות.

הנח את מנגנון 96 הנקודות שהורכב מראש לתוך מיכל משני. מיכל זה צריך להיות גדול מספיק כדי שניתן יהיה לפרק את המכשיר בקלות, מכיוון שהמנגנון והממברנה יהיו רדיואקטיביים לאחר השימוש. החל ואקום על מנגנון עלילת הנקודות של 96 באר.

לאחר שהמנגנון נמצא בוואקום, פיפטה בזהירות את התגובה המרווה ישירות על קרום הניטרוצלולוזה בכל באר. חזור על תהליך זה עד שכל התגובות נטענות על הממברנה. מכיוון שיכולת הקישור של ניטרוצלולוז גדולה מכמות ההיסטידין קינאז המנומר, ניתן להניח שכמעט כל הקינאז נקשר לקרום כאשר הוא נטען כהלכה.

בהתאם למנגנון המשמש, הקפד לא לנקב את הניטרוצלולוז. שימו לב שכל התגובה יצרה מגע עם הניטרוצלולוז. קל לחלק מהתגובות להיצמד לדפנות הבאר.

שוטפים את הבארות עם 100 מיקרוליטר חומצה זרחתית קרה כקרח 25 מילי-מולרית זה יאפשר לכל נפח תגובה שאולי נלכד בבאר להגיע לקרום, מה שיבטיח טעינה מלאה של כל התגובות. אפשר לכל הנפח לזרום דרך הממברנה.

פרק בזהירות את המכשיר לפני כיבוי הוואקום. שימו לב שגם המנגנון וגם קרום הניטרוצלולוזה רדיואקטיביים בשלב זה. אל תסיר רכיבי מכשיר כלשהם מהמיכל המשני.

בעזרת מלקחיים, העבירו בזהירות את קרום הניטרוצלולוזה מהמנגנון למיכל של כ -200 מיליליטר של חומצה זרחתית קרה קרח 25 מילי-מולרי. הניחו מכסה על מיכל זה, מכיוון שהכביסה תהיה רדיואקטיבית. בשלב זה, הוואקום עשוי להיות כבוי.

הניחו את המיכל עם קרום הכביסה על נדנדה. הניחו לקרום להתנדנד בעדינות במשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, שפכו בזהירות את תמיסת הכביסה המשומשת לדלי גדול שישמש לאחסון פסולת זמני.

הוסף 200 מיליליטר חומצה זרחתית קרה כקרח 25 מילי-מולרית לקרום. שטפו את הממברנה בצורה זו לפחות שלוש פעמים כדי להסיר אות רקע גמא-32 P ATP מהממברנה. לאחר הכביסה השלישית, בדוק את תמיסת הכביסה המשומשת לקרינה בעזרת מונה גייגר.

המשך לשטוף את הממברנה עד שלא יהיה אות בתמיסת הכביסה. לאחר שטיפת הממברנה מספיק, הניחו לקרום להתייבש לזמן קצר באוויר, מה שבדרך כלל לוקח חמש דקות או פחות. לאחר חשיפת הניטרוצלולוזה לירוק זרחן, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, התכוננו לצביעה והימנעות של Ponceau S.

טבלו בקצרה את קרום הניטרוצלולוזה בתמיסת הצביעה של Ponceau S למשך דקה עד שתיים. הרטיבו את כל הממברנה עם הכתם לפני ההימנעות. לאחר מכן, הוציאו את עודפי הפונסו S מהממברנה.

שוטפים את הממברנה במים מזוקקים כפולים עד שרק הכתמים מההיסטידין קינאז מוכתמים. שימו לב שהליך זה יעבוד רק אם כל הכתמים מכילים כמויות ניתנות לזיהוי של חלבון. בעזרת מספריים חותכים כל נקודה על קרום הניטרוצלולוזה.

אין צורך לחתוך בצורה מושלמת לאורך קצה הנקודה המוכתמת. אם הממברנה נשטפה מספיק, הרקע בגלל גודל משתנה של כתמי חיתוך הוא זניח. חשוב רק לחתוך את כל המקום לכל תגובה.

בעזרת מלקחיים, העבירו בזהירות כל נקודה לבקבוקוני נצנוץ. אין צורך בקוקטייל נצנוץ, מכיוון שזרחן 32 ניתן לזיהוי בקלות על ידי קרינת צ'רנקוב. לאחר מכן, אתר מספר דילולים של תמיסת גמא-32 P ATP על ריבועי ניטרוצלולוז של סנטימטר אחד על סנטימטר אחד.

בעזרת מלקחיים מעבירים בזהירות כל ריבוע לבקבוקוני נצנוץ ללא קוקטייל נצנוץ. דגימות אלו ישמשו ליצירת עקומה סטנדרטית לקביעת הספירה לדקה לפיקומולה של תמיסת ה-ATP. מכתים של פונסו של קרום הניטרוצלולוזה מוצג כאן.

הצביעה אחידה בכל הדגימות, מה שמצביע על כך שכל הדגימות עמוסות באופן שווה. תוצאות פלואורוגרפיה של קרום הניטרוצלולוזה מראות את הרמה היחסית של פוספוהיסטידין עם תווית רדיו בכל נקודה. השורה הרביעית והשמינית הן בקרות שליליות המדגימות כי עודף ATP נשטף מקרום הניטרוצלולוזה.

תוצאות מייצגות של כימות של אוטו-פוספורילציה של היסטידין קינאז מוצגות כאן. נתונים אלה נוצרים מספירת נצנוץ של כל נקודה שנחתכה מהממברנה. העקומה הסטנדרטית של ספירות לדקה לפיקומולה של ATP המוצגת כאן נוצרת גם מספירת נצנוץ ומשמשת לחישוב הפיקומולים של פוספוהיסטידין הקיימים בכל דגימה.

בעקבות הליך זה, ניתן להוסיף לניסוי שיטות אחרות, כמו הכנסת גירויים קוגנטיים או חלבונים המשוערים לווסת את פעילות הקינאז, כדי לענות על שאלות נוספות כמו השפעת התוספים הללו על פעילות הקינאז. אל תשכח שעבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון הדרכה נכונה לבטיחות קרינה ושימוש בציוד מגן אישי ומיגון בעת ביצוע הליך זה.