כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose
11 בינואר 2017
אנו מדווחים ומדגימים בדיקת קשירת ניטרוצלולוז אופטימלית שניתן להשתמש בה כדי לכמת זרחון עצמי של היסטידין קינאזות חיידקיות מטוהרות. לשיטה שלנו מספר יתרונות על פני טכניקות מסורתיות מבוססות SDS-PAGE, המספקות אלטרנטיבה חשובה לאפיון חלבונים חשובים אלה.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לכמת אוטופספורילציה של היסטידין קינזים חיידקיים מופרדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השליחון הדו-מרכיבי (two-component signaling), כגון השפעתם של גירויים קוגנאטיים באינטראקציות בין חלבונים על אוטופספורילציה של היסטידין קינזים.
היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם היותה שיטה בעלת תפוקה גבוהה (high throughput), שניתן להשתמש בה כדי לזהות במדויק פיקומולים של phosphohistadine שנוצרו ולהשיג פרמטרים קינטיים עבור histidine kinases. כחוקר פוסט-דוקטורט, אני משתמש בסינון על ממברנות ניטרוסלולוז כדי לכמת ליגנדים רדיואקטיביים הקשורים לחלבון. כתוצאה מכך, היה הגיוני לפתח טכניקה דומה לכימות פוספורילציה של היסטידין ב-histidine kinases של חיידקים.
התחילו הליך זה בהכנת הריאגנטים והחומרים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. להקמת מכשיר ה-dot-plot בעל 96 בארות, גזרו פיסת ממבנה ניטרוצלולוז בגודל שמונה סנטימטרים על 12 סנטימטרים. מקמו את הניטרוצלולוז בתוך מכשיר ה-dot-plot.
יש לוודא כי הממברנה מונחת כך שהמכשיר אטום וכל הבארות מכוסות במלואן על ידי הממברנה. כדי לאסוף את התסנין, חברו את המכשיר לבקבוק עם זרוע צדדית משנית. חברו צינור מתאים לגבעול השסתום כדי לאפשר שימוש נוח במכשיר מבלי להפיל את הבקבוק המשני.
לאחר מכן, חברו את בקבוק זרוע הצד המשני למקור ואקום של שואב (aspirator). בדקו שהמכשיר אטום לחלוטין על ידי הפעלת ואקום על המערכת. אם המכשיר הורכב כראוי, ייווצר ואקום חזק בכל הבארות.
ניתן לעטוף את כל חיבורי הפיתול ב-Parafilm או בניילון נשירה כדי להבטיח איטום הדוק. לפני התחלת התהליך, הכינו את ארבעת רכיבי התגובה כתמיסות מלאי בריכוז 4X, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ערבבו נפחים שווים של תמיסת באפר לתגובה, היסטידין קינאז ומים מזוקקים פעמיים.
אפשרו לרכיבי תגובה אלו להגיע לשיווי משקל בטמפרטורת החדר למשך זמן קצר. כדי להתחיל את התגובה, הוסיפו נפח אחד של תמיסת gamma-32 P ATP וערבבו באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת עם פיפט. עקבו אחר זמן התגובה שחלף באמצעות טיימר ואפשרו לתגובה להימשך למשך הזמן הרצוי.
עצרו את התגובה. הוסיפו מנה (aliquot) מהתגובה לחומצה זריחית בריכוז 325 millimolar. הניחו מיד את התגובות שעוצרו על קרח עד לסיום כל התגובות.
מקמו את מכשיר ה-dot-plot בעל 96 הבארים שהורכב מראש בתוך מיכל משני. מיכל זה צריך להיות גדול מספיק כדי שניתן יהיה לפרק את המכשיר בתוכו בקלות, מכיוון שהמכשיר והממברנה יהיו רדיואקטיביים לאחר השימוש. הפעילו ואקום על מכשיר ה-dot-plot בעל 96 הבארים.
לאחר שהמכשיר נמצא תחת ואקום, העבירו בזהירות בעזרת פיפט את התגובה שעוצרה ישירות על ממבנה הניטרוצלולוז בכל באר. חזרו על תהליך זה עד שכל התגובות יועמסו על הממברנה. מאחר שקיבולת הקישור של הניטרוצלולוז גדולה מכמות ה-histidine kinase שננקדה, ניתן להניח שכמעט כל הקינאז נקשר לממברנה כאשר ההעמסה בוצעה כהלכה.
בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש, יש להיזהר שלא לנקב את הניטרוצלולוז. ודאו שכל התגובה באה במגע עם הניטרוצלולוז. חלק מהתגובה עלול להיצמד בקלות לדפנות הבאר.
שטפו את הבאריות עם 100 µL של חומצה זריכית 25 mM קרה (בטמפרטורת קרח). פעולה זו תאפשר לכל נפח תגובה שייתכן ונלכד בבאריה להגיע לממברנה, ובכך תבטיח טעינה מלאה של כל התגובות. המתינו עד שכל הנפח יזרום דרך הממברנה.
פרקו את המכשיר בזהירות לפני כיבוי הוואקום. שימו לב כי הן המכשיר והן ממбраנת הניטרוסלולוז רדיואקטיביים בשלב זה. אין להוציא רכיבי מכשיר כלשהם מהמיכל המשני.
בעזרת פינצטה, העבירו בזהירות את ממбраסת הניטרוצלולוז מהמכשיר למכל containing בערך 200 milliliters של 25 millimolar חומצה פוספורית קרה. הניחו מכסה על מכל זה, מאחר שתהליך השטיפה יהיה רדיואקטיבי. בשלב זה ניתן לכבות את הוואקום.
הניחו את המיכל עם ממבנה השטיפה על מכשיר לנענוע (rocker). הניחו לממברנה להתנועע בעדינות במשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, שפכו בזהירות את תמיסת השטיפה המשומשת לתוך דלי גדול המשמש לאחסון זמני של פסולת.
הוסיפו לממברנה 200 milliliters של חומצה זריקה (phosphoric acid) בריכוז 25 millimolar קרה מאוד (בטמפרטורת קרח). שטפו את הממברנה באופן זה לפחות שלוש פעמים כדי להסיר מהממברנה את אות הרקע של gamma-32 P ATP. לאחר השטיפה השלישית, בדקו את תמיסת השטיפה המשומשת לאקראיות של קרינה באמצעות מונה גייגר.
המשיכו לשטוף את הממברנה עד שלא יופיע סיגנל בתמיסת השטיפה. לאחר שהממברנה נשטפה מספיק, אפשרו לה להתייבש קלות באוויר, תהליך שארך בדרך כלל חמש דקות או פחות. לאחר חשיפת הניטרוצלולוז לזרחן ירוק (phosphorus green), כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, הכינו את הממברנה לצביעה והסרת צבע ב-Ponceau S.
טבול לזמן קצר את ממבצת הניטרוצלולוז בתמיסת צביעה של Ponceau S למשך דקה עד שתי דקות. הרטב את הממבצת כולה בצבע לפני הסרת הצבע. לאחר מכן, שפוך את עודפי ה-Ponceau S מהממבצת.
שטפו את הממברנה במים מזוקקים פעמיים עד שרק הכתמים של ה-histidine kinase נצבעים. שימו לב שנוהל זה יעבוד רק אם בכל הכתמים ישנן כמויות ניתנות לגילוי של חלבון. בעזרת מספריים, גזרו כל כתם מממברנת הניטרוסלולוז.
אין צורך לחתוך בדיוק לאורך קצה הכתם הצבוע. אם הממברנה נשטפה כראוי, הרקע הנובע מגודל משתנה של הכתמים הגזורים הוא זניח. חשוב רק לגזור את כל הכתם עבור כל תגובה.
העבירו בזהירות כל נקודה לבקבוקקי סינצילציה באמצעות פינצטה. אין צורך בתמיסת סינצילציה, שכן ניתן לזהות בקלות את הפספורוס 32 באמצעות קרינת צ'רנקוב. לאחר מכן, טפטפו מספר דילולים של תמיסת gamma-32 P ATP על ריבועים של ניטרוצלולוז בגודל של סנטימטר אחד על סנטימטר אחד.
בעזרת פינצטה, העבירו בזהירות כל ריבוע לבחלורי סינצילציה ללא תמיסת סינצילציה. דגימות אלה ישמשו ליצירת עקומת סטנדרט לקביעת מספר הספירות לדקה לפיקומול של תמיסת ה-ATP. צביעת Ponceau של ממברסת הניטרוסלולוז מוצגת כאן.
הצביעה אחידה בכל הדגימות, מה שמעיד על כך שכל הדגימות הועמסו באופן שווה. תוצאות הפלואורוגרפיה של ממбраס הניטרוסלולוז מראות את הרמה היחסית של פוספוהיסטידין מסומן רדיואקטיבית בכל נקודה. השורה הרביעית והשמינית הן בקרות שליליות המדגימות כי ATP עודף נשטף מממברס הניטרוסלולוז.
מוצגות כאן תוצאות מייצגות של כימות אוטופוספורילציה של היסטידין קינאז. נתונים אלו הופקו מספירה של נספירה (scintillation counting) של כל נקודה שנגזרה מהממברנה. עקומת הסטנדרט של ספירות לדקה לפיקומול של ATP המוצגת כאן הופקה אף היא מספירת נספירה, והיא משמשת לחישוב הפיקומולים של פוספוהיסטידין הנמצאים בכל דגימה.
בעקבות הליך זה, ניתן להוסיף לניסוי שיטות אחרות, כגון הכנסת גירויים קוגנאטיים או חלבונים שמעריכים כי הם מווסתים את פעילות הקינאז, כדי לענות על שאלות נוספות כמו השפעת תוספות אלו על פעילות הקינאז. זכרו כי עבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון הכשרה מתאימה לבטיחות בקרינה ושימוש בציוד מיגון אישי ובמיגון קרינה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג בדיקת קישור לניטרוצלולוז (nitrocellulose binding assay) שעברה אופטימיזציה לצורך כימות של אוטופוספורילציה של קינזים להיסטידין (histidine kinases) בקטריאליים מבודדים. השיטה מציעה יתרונות משמעותיים על פני טכניקות SDS-PAGE מסורתיות, ובכך מהווה כלי בעל ערך לאפיון חלבונים אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה של התא
- העברה של אותות
רקע
- היסטידין קינאזים ממלאים תפקיד מכריע במערכות איתות דו-רכיביות.
- הבנת האוטו-פוספורילציה שלהם חיונית להבהרה של מסלולי איתות.
- ייתכן ששיטות מסורתיות לא יספקו את הרגישות הנדרשת עבור חלבונים בשכיחות נמוכה.
- מחקר זה נועד לשפר את הכימות של היסטידין קינאזים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה בעלת תפוקה גבוהה (high-throughput) לזיהוי אוטופספורילציה.
- בחינת השפעות של גירויים על אינטראקציות בין חלבונים.
- השגת פרמטרים קינטיים עבור היסטידין קינאזות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סינון על ממברנות ניטרוצלולוז.
- כימות של ליגנדים רדיואקטיביים הקשורים לחלבון.
- זיהוי של פיקומולים של פוספوهיסטידין.
- אפיון של קינטיקת האוטו-פוספורילציה של היסטידין קינאזות.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה המותאמת מאפשרת כימות מדויק של אוטופוספורילציה.
- רגישות גבוהה מאפשרת זיהוי של רמות נמוכות של פוספوهיסטידין.
- השיטה מספקת תובנות קינטיות לגבי פעילות היסטידין קינאז.
- היא משמשת כחלופה מהימנה לטכניקות SDS-PAGE מסורתיות.
מסקנות
- בדיקת קישור לניטרוצלולוז יעילה לחקר קינאזות היסטידין.
- גישה זו מחזקת את הבנתנו בנוגע לאיתות דו-מרכיבי.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול מחקרים רחבים יותר של אינטראקציות בין חלבונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של אוטופוספורילציה של היסטידין קינאז בבקטריות היא קריטית להפחתת סיכונים בשלבי הגילוי המוקדמים במחקר ופיתוח (R&D) של תרופות אנטי-אינפקטיביות ותרופות המכוונות למיקרוביום. בדיקת קישור לניטרוצלולוז מאפשרת זיהוי רגיש ובסביבת תפוקה גבוהה של פוספוהיסטידין, ובכך תומכת בתיקוף יעילים (target validation) ובמחקרים מכניסטיים של מערכות סיגנלינג דו-רכיביות. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בנקודות המפנה של בחינת המטרה ופיתוח הבדיקה, ובכך משפיעה ישירות על מיון ותעדוף של תיק הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה כמותית של פעילות היסטידין קינאז בתגובה לגירויים סביבתיים או כימיים.
- תומך בהסרת סיכונים מנגנונית על ידי הבהרת התפקיד התפקודי של חלבוני סיגנלינג דו-מרכיביים.
- מסייע בתיקוף יעדים איתן באמצעות מדידה ישירה של אירועי אוטופוספורילציה.
- משפר את הביטחון החזוי לקידום יעדי סיגנלינג בקטריאליים בתהליכי גילוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פורמט בדיקה סטנדרטי בעל תפוקה גבוהה להערכת פעילות קינאז תחת תנאים מרובים.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור ומתאימות לסריקת ספריות תרכובות או מודולטורים של חלבונים.
- מאפשר הקמה מהירה של הבדיקה ויכולת הרחבה (scalability) עבור זרימות עבודה של סריקה מבוססת פלטפורמה.
- תומך בהשוואה מהימנה של פעילות קינאז תחת משתנים ניסיוניים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים (translational biomarkers) על ידי אפשור כימות של מצבי הפעלה של מסלולים.
- מקל על הרצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני עבור מטרות אות (signaling targets) חיידקיות.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת נתונים מכניסטיים על מעורבות המטרה (target engagement).
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
בדיקת קישור זו לניטרוסלולוז משתלבת ברצף שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת פלטפורמה לשימוש חוזר לבדיקת השערות וניתוח מסלולים במערכות חיידקיות.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת אוטופוספורילציה כדי להבהיר את הפעלת המסלול ומעורבות המטרה.
- סריקה: מספק מוכנות של הבדיקה ויכולת שחזור להערכת מודולטורים של פעילות קינאז.
- אנליטיקה: מייצר קריאות כמותיות ועקומות סטנדרט להשוואה רחבה של נתונים.
- מחקר תרגומי: תומך בהלימה של סממנים ביולוגיים על ידי מדידת תוצרי מסלול פונקציונליים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס בדיקה ניתנת להרחבה ולהתאמה עבור מחקר מתמשך של איתות חיידקי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה של בדיקות (assays) סטנדרטיות, בעלות תפוקה גבוהה וניתנות לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות איתות חיידקיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחומרים רדיואקטיביים ובתכנון בדיקות קינאז (kinase assay).
- נדרש גישה למכשור סינון ניטרוסלולוז ותשתית לספירה ניצנוטית (scintillation counting).
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות של התוצאות ושלמות הנתונים.
- ניתן להתאמה למערכות קינאז חיידקיות שונות באמצעות אופטימיזציה מתאימה.
- פרוטוקולי בטיחות רדיואקטיבית וניהול פסחים הם דרישות תפעוליות חיוניות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Setting up the 96-well Dot Blot Apparatus
2:02
Reaction Initiation and Quenching
2:57
Spotting of Quenched Reactions on Nitrocellulose
4:51
Nitrocellulose Processing
5:48
Preparing Nitrocellulose Membrane for Scintillation Counting
7:31
Results: Quantification of the Autophosphorylation of V. parahaemolyticus H-NOX Associated Histidine Kinase (Vp1876)
8:35
Conclusion
