חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה במגוון סוגי דגימות. מתודולוגיה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בבדיקת מוטציות סומטיות על ידי הקלה על איתור מוטציות בתדירות נמוכה מאוד. כאן נחפש מוטציות בגן myd88 בדגימות מח עצם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת מידע מדויק ורגיש ביותר על נוכחותן של מוטציות סומטיות, אפילו עם מעט מאוד תאים ניאופלסטיים. בדיקת ריצוף מבוססת PCR מסוג פראי זה פותחה כדי להגביר חלק מאקסון חמש בגן myd88, מה שמבטיח כיסוי של הנקודה החמה L265. הפריימרים קדימה ואחורה תוכננו עם רצף M13 של חמישה ראשוניים כדי לאפשר כריעה של פריימרים משלימים לרצף.

תכנן את האוליגונוקלאוטיד החוסם כך שיהיה באורך של כ-10 עד 15 בסיסים ומשלים לתבנית מסוג הבר שבה רצוי העשרה מוטנטית. אוליגו קצר יותר ישפר את אפליית אי ההתאמה. כדי להשיג ספציפיות מטרה גבוהה חשוב לא להשתמש יותר מדי בנוקלאוטידים החוסמים, מכיוון שהדבר יגרום לאוליגונוקלאוטידים דביקים מאוד.

כדי לעצב את האוליגונוקלאוטיד החוסם, התחל בניווט לאתר האינטרנט של Oligo Tools. בחר בכלי החיזוי Oligo TM. ייפתח חלון חדש.

הדבק את הרצף של תבנית הסוג הפראי שיש לחסום בתיבת רצף האוליגו. הוסף סימן פלוס לפני בסיסי החוסם כדי לסמן אותם. לחץ על כפתור החישוב כדי לקבוע את ה-TM המשוער של הכלאה חוסמת ה-DNA.

טמפרטורות ההיתוך המחושבות יופיעו בתיבות למטה. תכנן את האוליגו החוסם כך שיהיה לו טמפרטורת התכה של 10 עד 15 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת ההארכה במהלך רכיבה תרמית. כאן, טמפרטורת ההארכה היא 72 מעלות צלזיוס.

כדי להתאים את טמפרטורת ההיתוך, הוסף, הסר או החלף בסיסים חוסמים. הימנע ממתיחות ארוכות של שלושה עד ארבעה בסיסי C או G חוסמים. לאחר מכן, כדי למנוע היווצרות מבנה משני או דימריזציה עצמית, חזור למסך הבית של אתר Oligo Tools ובחר בכלי Oligo Optimizer.

ייפתח חלון חדש. הדבק את הרצף של תבנית הסוג הפראי שתיחסם לתוך התיבה. הוסף סימן פלוס כדי לציין בסיסים חוסמים.

בחר את שתי התיבות עבור מבנה משני ועצמי בלבד ולחץ על כפתור הניתוח כדי לראות את הציונים עבור הכלאה ומבנה משני. ציונים אלה מייצגים הערכות גסות מאוד של טמפרטורות ההיתוך של הדימרים העצמיים והמבנים המשניים בהתאמה. ציונים נמוכים יותר הם אופטימליים וניתן להשיג אותם על ידי הגבלת זיווג חוסמי חוסמים.

הסר או מקם מחדש נוקלאוטידים חוסמים על מנת להשיג ציונים נמוכים יותר. נוקלאוטיד האוליגו החוסם האופטימלי עבור myd88 המוצג כאן יוצר איזון בין טמפרטורת ההיתוך ההיברידית של חוסם ה-DNA לבין הכלאה נמוכה מספיק וציוני מבנה משני. הוא תוכנן לכסות חומצות אמינו Q262 עד I266, וכולל DT הפוך בעל שלושה ראשונים כדי לעכב הן התפשטות על ידי DNA פולימראז והן פירוק על ידי שלושה אקסונוקלאז ראשוני

לאחר תכנון הפריימרים, הגדר את הסוג הפראי החוסם PCR ובצע רכיבה תרמית כמתואר במסמך הנלווה. הסר חרוזים מגנטיים מהאחסון בארבע מעלות צלזיוס והביא אותם לטמפרטורת החדר. העבירו 10 מיקרוליטר ממוצר ה-PCR לצלחת PCR חדשה.

מערבולת את החרוזים המגנטיים במרץ כדי להשעות מחדש את החלקיקים המגנטיים ואז להוסיף 18 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לכל באר בלוח החדש. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים לערבוב. ואז דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר הדגירה, הנח את לוחית ה-PCR על לוחית המגנט הצדדית למשך שתי דקות כדי להפריד את החרוזים מהתמיסה. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לשאוב את הסופרנטנט. הקפד להימנע מכדור החרוזים.

לאחר מכן, חלקו 150 מיקרוליטר של 70% אתנול לכל באר ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות לפחות. לאחר מכן שאפו את האתנול בעזרת פיפטה רב ערוצית והשליכו את הקצות. חזור על הליך כביסה זה פעם נוספת.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית של 20 מיקרוליטר שואבים את האתנול הנותר מכל באר וזורקים את הקצות. לאחר מתן כ-10 דקות לייבוש בארות הצלחת, הסר אותה מהמגנט והוסף 40 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה 15 פעמים לערבוב.

ואז לדגור בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר הדגירה, הנח את לוחית ה-PCR בחזרה על לוחית המגנט למשך דקה אחת כדי להפריד את החרוזים מהתמיסה. העבר 35 מיקרוליטר של מוצר מטוהר ללוחית PCR חדשה, ובצע ריצוף דו-כיווני כמתואר במסמך הנלווה.

לאחר שבוצע ריצוף דו-כיווני לטיהור מוצרי הריצוף, הכינו תמיסה טרייה אחת מתוך 25 של שלוש נתרן אצטט מולארי ב-PH 5.2 ו-100% אתנול. הכינו גם תמיסה טרייה של 70% אתנול. לכל באר של לוחות הריצוף קדימה ואחורה הוסף 30 מיקרוליטר נתרן אצטט ב-100% אתנול ופיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים לערבוב.

לאחר מכן אטמו מחדש את הצלחת, ודגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר שחלפו 20 דקות, צנטריפוגה את הצלחת ב -2, 250 פעמים G למשך 15 דקות. לאחר הסיבוב, הסר את אוטם הצלחות והפוך את הצלחת פעם אחת מעל מיכל פסולת.

אם הצלחת הפוכה מספר פעמים, הכדורים עלולים להשתחרר מתחתית הבאר. מניחים את הצלחת ההפוכה על מגבת נייר נקייה, וצנטריפוגה בחום של 150 פעמים G למשך דקה. לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטר של 70% אתנול לכל באר ואטמו מחדש את הצלחת.

סובב ב -2, 250 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן חזור על תהליך הסרת אוטם הצלחות והיפוך הצלחת. אם הבארות אינן יבשות לחלוטין, הניחו להן להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.

ודא שהדגימות מוגנות מפני אור. לאחר שהבארות יבשות לחלוטין מוסיפים 10 מיקרוליטר פורממיד לכל באר ופיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים לערבוב. אטום מחדש את הצלחת.

דנטור באמצעות תרמו-סייקלר ב-95 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות ואחריו ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הדנטורציה, החלף את אוטם הצלחות במחיצה ורצף על פלטפורמת רצף בהתאם להוראות היצרן. באמצעות תוכנת ניתוח רצפים, דמיין את העקבות ויישר את הרצפים לרצפי הייחוס המתאימים.

יישר את myd88 לרצף הייחוס של NCBI NM002468. DNA גנומי מחולים עם ובלי מוטציות עבר PCR חוסם קונבנציונלי ופראי ולאחר מכן רוצפו תוצרי ה-PCR שהתקבלו. כפי שניתן לראות כאן, האלל המוטנטי הועשר כאשר בוצע PCR חוסם מסוג פראי, ותוצאות חיוביות כוזבות לא נראו ב-DNA מסוג פראי.

ירידה אופיינית בעוצמת האות כפי שמוצג כאן נראית לעתים קרובות אם נעשה שימוש בריכוז גבוה מדי של חוסם, או אם טיהור לאחר PCR לא הצליח להסיר את החוסם לפני ריצוף דו-כיווני. זה קורה כאשר טיהור אנזימטי מתבצע במקום טיהור חרוזים מגנטיים. כל בדיקה מבוססת PCR המעשירה אללים מוטנטיים תזהה חפצים בתדר נמוך.

עקבות אלה מראים עלייה בחפצי ריצוף CG, ביחס לחפצי TA ברקמת FFPE כאשר ציטוזין או ציטוזין שעבר מתילציה עוברים פירוק באמצעות קיבוע פורמלי לאורציל או תיאמין בהתאמה. Uracil DNA glycosylase או UDG יכול לכרות אורציל לפני חסימת PCR מסוג פראי, מה שעוזר להפחית את חפצי הריצוף. עם זאת, תיאמין הנובע מחמישה מתיל ציטוזין מפורק המופיע לעתים קרובות באיי CPG אינו יכול להיכרת על ידי UDG.

הפחתת ריכוז החוסם המשמש ב-PCR חוסם מסוג בר עשויה לסייע בהפחתת התרחשותם של חפצי ריצוף שאינם מתוקנים על ידי טיפול ב-UDG. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבדוק מוטציות סומטיות ברמת דיוק ורגישות גבוהה, תוך שימוש בטכניקת חסימת הסוג הפראי. ניתן ליישם את העיקרון של טכנולוגיה זו לאיתור מוטציות בתת-אוכלוסיות קטנות של תאים.

לכן, יש לו תועלת באיתור מחלה שיורית מינימלית, ניטור חולים וחיזוי הישנות מוקדמת בחולים עם ניאופלזמות שונות.