Name: חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למדו לזהות מוטציות סומטיות בתדר נמוך בדגימות מח עצם באמצעות חסימת PCR משולבת מסוג Wild ורצף ישיר. שיטה זו מאפשרת איתור מדויק של מוטציות בגן myd88 לצורך חקר אונקולוגי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין אישורים.

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/96/16/9236.abstract">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+and+high+sensitivity+test+for+MYD88+mutations+using+locked+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Lab+Hematol%22%5BJournal%5D)">Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid.</a> Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).</li>
<li>Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+blocking+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+single+nucleotide+minority+mutations+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens.</a> Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).</li>
<li>Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+All+Next+Generation+Sequencing+Diagnostics+are+Created+Equal%3A+Understanding+the+Nuances+of+Solid+Tumor+Assay+Design+for+Somatic+Mutation+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection.</a> Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).</li>
<li>Smith, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+estimates+of+clonal+evolution+and+subclonal+heterogeneity+can+arise+from+PCR+duplicates+in+deep+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments.</a> Genome Biol. 15 (8), 420(2014).</li>
<li>Varettoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+the+MYD88+%28L265P%29+somatic+mutation+in+Waldenstr%C3%B6m%27s+macroglobulinemia+and+related+lymphoid+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms.</a> Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYD88+L265P+in+Waldenstr%C3%B6m+macroglobulinemia%2C+immunoglobulin+M+monoclonal+gammopathy%2C+and+other+B-cell+lymphoproliferative+disorders+using+conventional+and+quantitative+allele-specific+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction.</a> Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).</li>
<li>Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waldenstr%C3%B6m+macroglobulinemia%3A+2012+update+on+diagnosis%2C+risk+stratification%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Amer+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management.</a> Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).</li>
<li>Salar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/124/21/1690">MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL).</a> Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).</li>
<li>Ngo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenically+active+MYD88+mutations+in+human+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma.</a> Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).</li>
<li>Pasqualucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+coding+genome+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).</li>
<li>Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://imbi.bio.indiana.edu/includes/content/documents/3730%20Usage/ABI%203730%20User%20guide.pdf">User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4474242A.pdf">User Guide for SeqScape Software 3</a>. , (2012).</li>
<li>Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+locked+nucleic+acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA).</a> Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).</li>
<li>Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+mutation+artifacts+after+formalin+fixation+and+error+prone+translesion+synthesis+during+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR.</a> BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).</li>
<li>Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+and+K-ras+mutation+analysis+in+non-small+cell+lung+cancer%3A+comparison+of+paraffin+embedded+versus+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol%22%5BJournal%5D)">EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens.</a> Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).</li>
<li>Solassol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+detection+in+paired+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+colorectal+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues.</a> Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).</li>
<li>Yost, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+high-confidence+somatic+mutations+in+whole+genome+sequence+of+formalin-fixed+breast+cancer+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens.</a> Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).</li>
<li>Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+sequence+artifacts+in+amplicon-based+massively+parallel+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+DNA+by+enzymatic+depletion+of+uracil-containing+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates.</a> Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).</li>
<li>Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+amplification+of+rare+mutations+using+locked+nucleic+acid+oligonucleotides+that+competitively+inhibit+primer+binding+to+wild-type+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA.</a> J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).</li>
<li>Mancini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+methods+for+rapid+detection+and+quantification+of+DNMT3A+R882+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia.</a> J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).</li>
<li>Parsons, B. L., Heflich, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+selection+methods+for+the+direct+analysis+of+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Muta+Res%22%5BJournal%5D)">Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations.</a> Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).</li>
<li>Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+amplification%3A+a+method+for+high-fidelity+template-driven+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification.</a> BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).</li>
<li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+a+primer+at+a+mutation%3A+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li>
<li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/126/23/716">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716(2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

את assay WTB-PCR המתואר כאן משתמשת בסדרה הגנרית של פריימרים עם אוליגו חסימת נועד לחסום הגברה של DNA WT במהלך הארכה (איור 1). מוצר WTB-PCR הוא רצף אז עבור ניתוח מוטאציות. כלי השירות של WTB-PCR / סאנגר טמון בפשטותה, רגישות גבוהה, ו-תפוקה גבוהה. באמצעות ההנחיות המתוארות כאן, רוב מבחני הקיימים המבוססים סאנגר ניתן לשנות בפשטות באמצעות תוספת של oligonucleotide חסימת להגדיל בהרבה רגישות. ב assay בדוגמה המוצגת כאן תוספת של oligonucleotide חסימת יחיד PCR הגדילה את המגבלה ש...

רצף סנגר באופן מסורתי את תקן הזהב בדיקות עבור שתי מוטציות סומטיות ידועים ובלתי ידועים. אחת המגבלות של רצף סנגר הוא הגבול של זיהוי שלה (~ 10 - אלל מוטנטי 20% בתוך רקע של WT) 1. רמה זו של רגישות אינה מתאימה לזיהוי מוטציות סומטיות ברמה הנמוכה שעשויה להיות נוכח דגימות מרקמות ממאירות או בחולים עם כמה תאים סרטניים במחזור, או כאשר מח עצם (BM), הוא מעשה טלאים. זה גם עושה הערכת מחלה שיורית לאחר טיפול או לגילוי מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול קשה על ידי רצף קונבנציונאלי בלבד 2. על ידי החלפת PCR קונבנציונאלי עם חומצות גרעין נעול (LNA) בתיווך wild-type חסימת PCR (WTB-PCR) ב רצף סנגר, רגישויות של עד 0.1 אלל מוטנטי% בתוך הרקע של WT ניתן להשיג 2, 3, 4. בשנתWTB-PCR, העשרה עבור אללים מוטנטים מושג באמצעות התוספת של קצר (~ 10 - 14 NT) חסימה (LNA) oligonucleotide שקושרה מעדיפים את WT DNA ובכך למנוע ההגברה של WT DNA. מוצר WTB-PCR מועשר המוטציה יכול להיות רצף אז. על ידי חסימת WT DNA ולא בחירת מוטציות ספציפיות WTB-PCR מאפשרת העשרה של שניהם מוטציות ידועות ובלתי ידועים הנוכחות שברי תא דקות. שיטות מרובות כיום משמשות לזיהוי מוטציות שברי תאים קטנים. זה כולל מערכת מוטצית אלל ספציפי PCR, הגברה-עקשנית (נשק), denaturing כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (DHPLC), חרוזים, תחליבים, הגברה, ומגנטיות (קורן), שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM), ברזולוציה גבוהה נקודה ואחרים היתוך. עם זאת, רוב השיטות אלה מוגבלים-תוצאות חיוביות שגויות ואת היכולת לזהות רק מוטציה אחת כי assay תוכנן עבור 4 </sup&gt;. WTB-PCR, לעומת זאת, מאפשרת למשתמש לדמיין עקבות רצף המאפשרת זיהוי של סוגי מוטציה מרובים ויכולים לסייע פוסלים תוצאות חיוביות שגויות עקב ממצאים או אירועים דיאמינציה. סידור הדור הבא (NGS) עשוי להציע חלופה הולמת סידור קונבנציונלי, אולם, עלויות משמעותיות גדולות יותר, מורכבות, וזמן assay כבר לדקלם את זה אופציה מיותרת עבור סוגי מחלות רבים עם כמה סמנים מולקולריים ברורים או לניטור מטופלים בתרופה עבור מתעוררים מוטציות עמידות. יתר על כן, שיעורי חיובי כוזבים גבוהים כאשר הגירסות באיתור עם תדרי אלל מוטנטי של פחות מ 5% יכולות להוות בעיה עבור NGS מבוסס amplicon 5, 6. כאן אנו מדגימים את הגידול רגיש מושג על ידי WTB-PCR הקרנה עבור מוטציות בגן 88 גורם בידול מיאלואידית כפי שתואר על ידי Albitar ואח. 3 MYD88 mutatioNS הם גורמים אבחון פרוגנוסטי חשוב Macroglobulinemia של Waldenström (WM), gammopathy מונוקלונלי IgM בעל משמעות לא ידוע (IgM-MGUS), לימפומה אזור שוליים הטחול (SMZL), מפוזר לימפומה B-cell גדול (DLBCL). מוטציות MYD88 נמצאים כמעט בכל המקרים של WM וכ 50% מהחולים עם אימונוגלובולין M (IgM) -secreting MGUS. וחשוף, מוטציות MYD88 נמצאות רק 0-6% מחולים עם SMZL ו נעדרות מיאלומה נפוצה 7, 8. מכיוון מורפולוגיים חופפים, immunophenotypic, ציטוגנטית, ואת המאפיינים הקליניים בין WM ו- SMZL או מיאלומה נפוצה-IgM יכול לעתים קרובות לסבך אבחנות דיפרנציאלי, בנוכחות מוטציה MYD88 עשוי לשמש כגורם 9 זיהוי שימושי. מוטציות MYD88 גם קושרו עם נטל המחלה יותר בחולים עם DLBCL והישרדות כוללת עניים לאחר טיפול 7, </sup&gt; 10. בנוסף, בגלל מוטציות MYD88 נמצאים בתדירות גבוהה יותר B-cell-like מופעל (ABC) DLBCL מ מרכז נבטי B-cell-like (GCB) DLBCL או לימפומה B-cell mediastinal העיקרי (PMBL), מצב המוטציה MYD88 עשויה לשמש סמן פונדקאי עבור תת ABC 11, 12. הפרוטוקול המפורט הניתן כאן משמש כתבנית שממנו המבחנים חדשים ניתן לפתח או ברוב מבחני רצף הקיימים ניתן להתאים בקלות לזהות מוטציות בתדירות נמוכות במדויק סוגים שונים מדגמים. הגישה יכולה לשמש גם עבור ניטור ואיתור מוטציות עמידות שעשויות להתפתח גידולים או אפילו חיידקים שעלולים להתפתח תוך חולי מטופלים עם טיפול ממוקד או אנטיביוטיקה. יתר על כן, היא מתייחסת ותרופות רבות מהבעיות הקשורות להעשרת מוטציה, במיוחד משובץ-פרפין קבוע פורמלין (FFPE) רקמות.

<table><tbody><tr><td>1.5 או 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה מנעול בטוח</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100% אלכוהול</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>כיתה היסטולוגיה; 91.5% אתנול, 5% אלכוהול איזופרופיל, 4.5% מתיל אלכוהול</td></tr><tr><td>3730XL רצף</td><td>ABI</td><td></td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td>לטיהור PCR חרוז</td></tr><tr><td>מגנטי אלומיניום רדיד איטום</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>עבור PCR ואחסון קר</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 ערכת רצף מחזור</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>לרצף דו-כיווני. עם 5x רצף מאגר</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5804 סדרת</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP רוטור (לצלחת PCR)</td></tr> <tr><td>צלחת קרה ל-96 צלחות</td><td>באר Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, RNAse, מים</td><td></td><td></td><td></td>טהורים במיוחד</tr><tr><td>dNTPs (100 מ"מ)</td> <td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 מגנט עם חצאית צד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>לשימוש בטיהור PCR.</td></tr><tr><td>אתנול אבסולוט&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 הוכחה, לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>אתר Exiqon Oligo Tools</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA פולימראז (5 U/&micro; L)</td> <td>Roche</td><td>12032937001</td><td>With10x מאגר תגובת PCR מרוכז, עם 20 מ"מ MgCl2</td></tr><tr><td>Gel מכשיר</td><td></td><td></td> אלקטרופורזה 2<td>% ג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי DNA FFPE של GeneRead&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td><td>מכיל אורציל DNA גליקוזילאז הדרוש להפחתת חפצי ריצוף</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>לריצוף.</td></tr><tr><td>LNA oligonucleotide</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+G+A+T+T+C/INVDT/ (+N = בסיסי LNA)</td></tr><tr><td>M13-F פריימר רצף</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R פריימר רצף</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה דגם 5430</td>רוטור <td>Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 (עבור צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5/2 מ"ל</td></tr>) <tr><td>NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR קדימה פריימר</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR פריימר הפוך</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR לוחות</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>פיפטורים</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1,000 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>מחיצת צלחת, 96 באר</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>עבור BM שאיבה ודם היקפי</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>לניתוח רצף</td></tr><tr><td>סל</td><td></td><td></td><td></td>שקופיות</tr><tr><td>נתרן אצטט (3 M, pH 5.2)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr>קצות <td></td><td></td><td>פיפטה מסוננים סטריליים</td><td>20, 200, 1,000 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>תרמומיקסר C&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> שטיפה <td>~ 1,000 מ"ל</td></tr><tr><td>קסילן</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>כיתה היסטולוגיה</td></tr></tbody></table>

חסימת pcr משולבת מסוג wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

גילוי וזיהוי מדויק של מוטציות בתדירות נמוכה יכול להיות בעייתי כאשר להערכת מחלת שיורי לאחר טיפול, בדיקות סקר לאיתור מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול, או כאשר יש מטופלים כמה תאים סרטניים במחזור. Wild-סוג חסימת PCR ואחריו לניתוח רצפי מציעה רגישות גבוהה, גמישות, ופשטות כמו מתודולוגיה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה אלה. על ידי הוספת מעוצבים בהתאמה אישית נעול oligonucleotide חומצות גרעין אל assay סידור חדש או בעבר הקים קונבנציונאלי המבוסס PCR, רגישויות של כ 1 אלל מוטנטי רקע של 1000 אללים WT יכולה להיות מושגת (1: 1000). חפצי רצף אירועים הקשורים דיאמינציה נפוצים ברקמות מוטבעות פרפין קבוע בפורמלין ניתן לתיקון חלקי על ידי שימוש glycosylase DNA אורציל במהלך שלבי חילוץ. הפרוטוקול המותאם כאן הוא ספציפי לזיהוי מוטצית MYD88, אך יכול לשמש כתבנית לעצב כלassay WTB-PCR. יתרונות של assay WTB-PCR מעל מבחני אחרים מנוצלים בדרך כלל לאיתור מוטציות בתדירות הנמוכה כולל אלל ספציפי PCR ו PCR כמוני בזמן האמת כוללים מופעים פחות של תוצאות חיוביות שגויות, גמישות רבה יותר וקלות ליישום, ואת היכולת לזהות הן ידוע ומוטציות ידועות.

סקירה מושגית של WTB-PCR במהלך ההארכה מוצגת באיור 1. בגלל חוסר התאמה של נוקלאוטיד יחיד ההיברידי החוסם-DNA מקטינה טמפרטורת ההתכה שלה מאוד (ΔT מ = 20 - 30 מעלות צלזיוס), הגברה של אלל WT חסום בזמן DNA תבנית מוטציה אינה כרוכה בתשלום כדי להשלים ארכה 17. באופן זה, ה- DNA מוטציה מוגבר אקספוננציאלית בזמן WT דנ&quot;א מוגבר באופן ליניארי. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";...

PCR חוסם מסוג פרא ואחריו ריצוף ישיר מציע שיטה רגישה ביותר לזיהוי מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה במגוון סוגי דגימות.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה במגוון סוגי דגימות. מתודולוגיה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בבדיקות של מוטציות סומטיות על ידי הקלה בזיהוי מוטציות בתדירות נמוכה מאוד. כאן נחפש מוטציות בגן myd88 בדגימות מחילק מוחרי).היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מידע מדויק ורגיש ביותר לגבי נוכחותן של מוטציות סומטיות, אפילו כאשר מספר התאים הניאופלסטיים קטן מאוד. בדיקת ריצוף זו, המבוססת על PCR עם חסימת סוג 야רי (wild type blocking), פותחה כדי להגביר חלק מאקסון 5 בגן myd88, ובכך להבטיח כיסוי של נקודת החום (hotspot) L265. הפריימרים הקדמי וההפוכי תוכננו עם רצף M13 בקצה 5' כדי לאפשר חיבור של פריימרים משלימים לריצוף.תכננו את האוליגונוקלאיד החוסם כך שאורכו יהיה כ-10 עד 15 בסיסים, ויהיה משלים לתבנית מסוג הפרא (wild type) במקום שבו רצוי להשיג העשרה של מוטציות. אוליגו קצר יותר ישפר את היכולת להבחין בין רצפים לא תואמים (mismatch discrimination). כדי להשיג ספציפיות גבוהה למטרה, חשוב שלא להשתמש בכמות גדולה מדי של נוקלאוטידים חוסמים, שכן הדבר יוביל לאוליגונוקלאידים בעלי קישוריות גבוהה מדי (sticky).כדי לתכנן את האוליגונוקלאוטיד החוסם, התחילו בניווט לאתר Oligo Tools. בחרו בכלי לחיזוי Oligo TM. חלון חדש ייפתח.הדביקו את הרצף של תבנית סוג הבר (wild type) שאתם מעוניינים לחסום לתוך תיבת רצף האוליגו. הוסיפו סימן פלוס לפני הבסיסים החוסמים כדי לסמן אותם. לחצו על כפתור החישוב כדי לקבוע את ה-TM המשוער של ההיבריד של חוסם ה-DNA.טמפרטורות ההמסה המחושבות יופיעו בתיבות למטה. תכננו את האוליגו החוסם כך שטמפרטורת ההמסה שלו תהיה גבוהה ב-10 עד 15 מעלות צלזיוס מטמפרטורת ההארכה במהלך המחזור התרמי. במקרה זה, טמפרטורת ההארכה היא 72 מעלות צלזיוס.כדי להתאים את טמפרטורת ההמסה, יש להוסיף, להסיר או להחליף בסיסי חסימה. הימנעו מרצפים ארוכים של שלושה עד ארבעה בסיסי C או G חוסמים. לאחר מכן, כדי למנוע היווצרות מבנה שניוני או דימריזציה עצמית, חזרו למסך הבית של אתר Oligo Tools ובחרו בכלי ה-Oligo Optimizer.חלון חדש ייפתח. הדביקו בתיבה את הרצף של תבנית סוג הפרא (wild type) שיש לחסום. הוסיפו סימן פלוס (+) כדי לציין את הבסיסים החוסמים.בחרו בשתי התיבות עבור מבנה שניוני ו-self בלבד ולחצו על כפתור ה-analyze כדי לראות את הציונים עבור היברידיזציה ומבנה שניוני. ציונים אלו מייצגים הערכות גסות מאוד של טמפרטורות ההמסה של הדימרים העצמיים והמבנים השניוניים, בהתאמה. ציונים נמוכים יותר הם האופטימליים, וניתן להשיגם על ידי הגבלת הצימוד של blocker-blocker.הסר או שנה את מיקום הנוקלאוטידים החוסמים כדי להגיע לציונים נמוכים יותר. האוליגו-נוקלאוטיד החוסם האופטימלי עבור myd88 המוצג כאן משיג איזון בין טמפרטורת ההתכה של היבריד ה-DNA החוסם לבין ציונים נמוכים מספיק של היברידיזציה ומבנה שניוני. הוא תוכנן לכסות את חומצות האמינו Q262 עד I266, וכולל DT הפוך בקצה '3 כדי למנוע הן מאך על ידי DNA polymerase והן דגרדציה על ידי '3 exonuclease.לאחר תכנון הפריימרים, הגדירו את תגובת ה-PCR החוסמת לסוג הפרא ובצעו את מחזורי התרמוסייקלינג כפי שמתואר במסמך המצורף. הוציאו את החרוזיים המגנטיים מהאחסון בטמפרטורה של 4°C והביאו אותם לטמפרטורת החדר. העבירו 10 µL מתוצר ה-PCR ללוח PCR חדש.ערבבו את החרוזים המגנטיים באמצעות Vortex בעוצמה כדי להחזיר את החלקיקים המגנטיים לתמיסה באופן מלא, ולאחר מכן הוסיפו 18 µL של חרוזים מגנטיים לכל באער בלוח החדש. בצעו פיפוט למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, הדגרירו את הלוח בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.לאחר האינקובציה, הניחו את פלטת ה-PCR על פלטת מגנט עם שוליים למשך שתי דקות כדי להפריד את החרוזים מהתמיסה. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי לשאוב את הנוזל העליון (supernatant). יש להיזהר כדי לא לשאוב את משקע החרוזים.בשלב הבא, העבירו 150 µL של 70% ethanol לכל באער והדגירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות לפחות. לאחר מכן, שאבו את ה-ethanol באמצעות פיפט רב-ערוצי והשליכו את הטיפים. חזרו על תהליך שטיפה זה פעם נוספת.באמצעות פיפט רב-ערוצית של 20 µL, שאבו את האתנול שנותר מכל באר והשליכו את הטיפים. לאחר המתנה של כ-10 דקות לייבוש הבארות של הפלטה, הסירו אותה מהמגנט והוסיפו 40 µL של מים נקיים מנוקליאז (nuclease free water) לכל באר. ערבבו על ידי שאיבה ושחרור (pipette up and down) 15 פעמים.לאחר מכן, דגרו בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר הדגירה, החזירו את לוחית ה-PCR למגנט למשך דקה אחת כדי להפריד את החרו지를 מהתמיסה. העבירו 35 µL מהמוצר המטוהר ללוחית PCR חדשה, ובצעו ריצוף דו-כיווני כפי שמתואר במסמך הנלווה.לאחר ביצוע ריצוף דו-כיווני, כדי לטהר את תוצרי הריצוף, הכין תמיסה טרייה של sodium acetate בריכוז 3M ב-pH 5.2 ב-100% ethanol. כמו כן, הכין תמיסה טרייה של 70% ethanol. לכל באער בלוחות הריצוף קדימה (forward) ואחורה (reverse), הוסף 30 µL של sodium acetate ב-100% ethanol וערבב באמצעות שאיבה ופליטה (pipette up and down) חמש פעמים.לאחר מכן, אטמו שוב את הפלטה והדגירו אותה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר שחלפו 20 דקות, סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-2,250 ×g למשך 15 דקות. לאחר הסבב, הסירו את האטם והפוך את הפלטה פעם אחת מעל מיכל פסולת.אם הפלטה הופכת מספר פעמים, תרחיפי התאים עשויים להשתחרר מתחתית הבארות. הניחו את הפלטה ההפוכה על נייר סופג נקי, וסובבו בצנטריפוגה ב-150 ×g למשך דקה אחת. לאחר מכן, הוסיפו 150 µL של 70% ethanol לכל בארה ואטמו מחדש את הפלטה.סבבו בצנטריפוגה ב-2,250 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן חזרו על תהליך הסרת אטם הפלטה והפיכתה. אם הבארות אינן יבשות לחלוטין, השאירו אותן להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.וודאו שהדגימות מוגנות מאור. לאחר שהבארות יבשו לחלוטין, הוסיפו 10 µL של formamide לכל בארה ובצעו פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב. סגרו שוב את הפלטה.בצעו דנטורציה באמצעות תרמוסייקלר בטמפרטורה של 95 degrees Celsius למשך שלוש דקות, ולאחר מכן בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך חמש דקות. לאחר הדנטורציה, החליפו את סגירת הפלטה (plate sealer) בספטה (septa) ובצעו ריצוף במערכת ריצוף בהתאם להוראות היצרן. באמצעות תוכנה לניתוח רצפים, בצעו ויזואליזציה של העקבים (traces) והתאימו את הרצפים לרצפי הייחוס המתאימים.בצעו יישור (Align) של myd88 לרצף הייחוס של NCBI מספר NM002468. DNA גנומי ממטופלים עם ובלי מוטציות עבר PCR קונבנציונלי וכן PCR עם חסימה של סוג בר (wild type blocking PCR), והתוצריים של ה-PCR שסולדו לאחר מכן רצפו. כפי שניתן לראות כאן, האלל המוטנטי הועשר כאשר בוצע PCR עם חסימה של סוג בר, ולא נצפו תוצאות חיוביות שגויות ב-DNA מסוג בר.ירידה מאפיינת בעוצמת האות כפי שמוצג כאן נראית לעיתים קרובות כאשר נעשה שימוש בריכוז גבוה מדי של חומר חוסם (blocker), או אם טיהור לאחר ה-PCR נכשל בהסרת החומר החוסם לפני ריצוף דו-כיווני. הדבר קורה כאשר טיהור אנזימטי מבוצע במקום טיהור באמצעות חרוזי מגנט. כל בדיקה מבוססת PCR המעשירה אללים מוטנטיים תזהה ארטיפקטים בתדירות נמוכה.עקבות אלו מראים עלייה בארטיפקטים של רצף CG, ביחס לארטיפקטים של TA ברקמה בשימור FFPE, כאשר ציטוזין או ציטוזין מתילated עוברים דהימינציה באמצעות קיבוע בפורמלין לאורציל או תימין, בהתאמה. Uracil DNA glycosylase או UDG יכול להסיר אורציל לפני PCR של חסימת סוג פראי (wild type blocking PCR), ובכך לסייע בהפחתת ארטיפקטים של רצף. עם זאת, תימין הנובע מדהימינציה של five methyl cytosine, המתרחש לעיתים קרובות באיי CpG, אינו יכול להיות מוסר על ידי UDG.הפחתת ריכוז החוסם המשמש ב-PCR לחסימת סוג פרוע (wild type blocking PCR) עשויה לסייע בהפחתת השכיחות של ארטיפקטים של ריצוף שאינם מטופלים על ידי טיפול ב-UDG. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכוש הבנה טובה לגבי אופן בדיקת מוטציות סומטיות ברמת דיוק ורגישות גבוהה, תוך שימוש בטכניקת חסימת הסוג הפרוע. ניתן להחיל את העיקרון של טכנולוגיה זו לצורך זיהוי מוטציות באוכלוסיות תאים קטנות.לפיכך, יש לו תועלת בזיהוי מחלה שיורית מינימלית, במעקב אחר חולים ובחיזוי רגרסיה מוקדמת בחולים עם גידולים שונים.

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מתאר תגובת שרשרת פולימראז חוסמת מסוג פראי, או WTB-PCR, המזהה מוטציות סומטיות. הטכניקה מבוססת PCR משתמשת בחומצת גרעין נעולה, או LNA, אוליגונוקלאוטיד שנקשר לאלל הבר המשלים שלו וחוסם את התארכותו. החסימה מאפשרת באופן סלקטיבי הגברה של אללים מוטנטיים ברמה נמוכה על פני הגרסאות הפראיות שלהם בדגימה.

חסימת PCR מסוג Wild לאיתור מוטציות סומטיות בתדר נמוך

אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ולכידת אקסון הבא המבוסס על הכלאה לזיהוי של מוטציות סרטן קשור מפתח בדגימות גידול קליניים על ידי רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי. רצף אקסון ממוקד מציע יתרונות של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מניב רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים קליניים עבור שני לוחות ריצוף מהדור הבא. פאנל אחד חוקר ממאירויות המטולוגיות ואילו הפאנל השני מתמקד בגנים שעברו מוטציה בדרך כלל בגידולים מוצקים. סיווג מולקולרי של מוטציות מניעות בגידולים ממאירים אנושיים מציע מידע פרוגנוסטי וחיזוי רב ערך.

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

מאמר זה מתאר שיטה לזהות שינויים של שבטים ושבטים תת-שבטיים בין דגימות שונות ממטופל נתון. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסוג גידול מסוים, הגישה ישימה באופן כללי לגידולים מוצקים אחרים.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

מאמר זה מציג את היישום של שיטת זיהוי בתדר נמוך המבוססת על ריצוף Sanger בלימפומה אנגיואימונובלסטית. לספק בסיס ליישום שיטה זו על מחלות אחרות.

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

רצף תא בודד הוא כלי פופולרי ונגיש יותר ויותר לטיפול שינויים הגנומי ברזולוציה גבוהה. אנו מספקים פרוטוקול המשתמש רצף תא בודד לזהות שינויי מספר עותק תאים בודדים.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

למדו לזהות מוטציות סומטיות בתדר נמוך בדגימות מח עצם באמצעות חסימת PCR משולבת מסוג Wild ורצף ישיר. שיטה זו מאפשרת איתור מדויק של מוטציות בגן myd88 לצורך חקר אונקולוגי מתקדם.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

גלה סרטונים נוספים