Name: חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למדו לזהות מוטציות סומטיות בתדר נמוך בדגימות מח עצם באמצעות חסימת PCR משולבת מסוג Wild ורצף ישיר. שיטה זו מאפשרת איתור מדויק של מוטציות בגן myd88 לצורך חקר אונקולוגי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

למחברים אין אישורים.

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/96/16/9236.abstract">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+and+high+sensitivity+test+for+MYD88+mutations+using+locked+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Lab+Hematol%22%5BJournal%5D)">Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid.</a> Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).</li>
<li>Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+blocking+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+single+nucleotide+minority+mutations+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens.</a> Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).</li>
<li>Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+All+Next+Generation+Sequencing+Diagnostics+are+Created+Equal%3A+Understanding+the+Nuances+of+Solid+Tumor+Assay+Design+for+Somatic+Mutation+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection.</a> Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).</li>
<li>Smith, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+estimates+of+clonal+evolution+and+subclonal+heterogeneity+can+arise+from+PCR+duplicates+in+deep+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments.</a> Genome Biol. 15 (8), 420(2014).</li>
<li>Varettoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+the+MYD88+%28L265P%29+somatic+mutation+in+Waldenstr%C3%B6m%27s+macroglobulinemia+and+related+lymphoid+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms.</a> Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYD88+L265P+in+Waldenstr%C3%B6m+macroglobulinemia%2C+immunoglobulin+M+monoclonal+gammopathy%2C+and+other+B-cell+lymphoproliferative+disorders+using+conventional+and+quantitative+allele-specific+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction.</a> Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).</li>
<li>Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waldenstr%C3%B6m+macroglobulinemia%3A+2012+update+on+diagnosis%2C+risk+stratification%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Amer+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management.</a> Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).</li>
<li>Salar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/124/21/1690">MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL).</a> Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).</li>
<li>Ngo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenically+active+MYD88+mutations+in+human+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma.</a> Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).</li>
<li>Pasqualucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+coding+genome+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).</li>
<li>Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://imbi.bio.indiana.edu/includes/content/documents/3730%20Usage/ABI%203730%20User%20guide.pdf">User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4474242A.pdf">User Guide for SeqScape Software 3</a>. , (2012).</li>
<li>Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+locked+nucleic+acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA).</a> Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).</li>
<li>Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+mutation+artifacts+after+formalin+fixation+and+error+prone+translesion+synthesis+during+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR.</a> BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).</li>
<li>Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+and+K-ras+mutation+analysis+in+non-small+cell+lung+cancer%3A+comparison+of+paraffin+embedded+versus+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol%22%5BJournal%5D)">EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens.</a> Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).</li>
<li>Solassol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+detection+in+paired+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+colorectal+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues.</a> Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).</li>
<li>Yost, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+high-confidence+somatic+mutations+in+whole+genome+sequence+of+formalin-fixed+breast+cancer+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens.</a> Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).</li>
<li>Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+sequence+artifacts+in+amplicon-based+massively+parallel+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+DNA+by+enzymatic+depletion+of+uracil-containing+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates.</a> Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).</li>
<li>Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+amplification+of+rare+mutations+using+locked+nucleic+acid+oligonucleotides+that+competitively+inhibit+primer+binding+to+wild-type+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA.</a> J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).</li>
<li>Mancini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+methods+for+rapid+detection+and+quantification+of+DNMT3A+R882+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia.</a> J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).</li>
<li>Parsons, B. L., Heflich, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+selection+methods+for+the+direct+analysis+of+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Muta+Res%22%5BJournal%5D)">Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations.</a> Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).</li>
<li>Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+amplification%3A+a+method+for+high-fidelity+template-driven+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification.</a> BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).</li>
<li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+a+primer+at+a+mutation%3A+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li>
<li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/126/23/716">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716(2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

את assay WTB-PCR המתואר כאן משתמשת בסדרה הגנרית של פריימרים עם אוליגו חסימת נועד לחסום הגברה של DNA WT במהלך הארכה (איור 1). מוצר WTB-PCR הוא רצף אז עבור ניתוח מוטאציות. כלי השירות של WTB-PCR / סאנגר טמון בפשטותה, רגישות גבוהה, ו-תפוקה גבוהה. באמצעות ההנחיות המתוארות כאן, רוב מבחני הקיימים המבוססים סאנגר ניתן לשנות בפשטות באמצעות תוספת של oligonucleotide חסימת להגדיל בהרבה רגישות. ב assay בדוגמה המוצגת כאן תוספת של oligonucleotide חסימת יחיד PCR הגדילה את המגבלה ש...

רצף סנגר באופן מסורתי את תקן הזהב בדיקות עבור שתי מוטציות סומטיות ידועים ובלתי ידועים. אחת המגבלות של רצף סנגר הוא הגבול של זיהוי שלה (~ 10 - אלל מוטנטי 20% בתוך רקע של WT) 1. רמה זו של רגישות אינה מתאימה לזיהוי מוטציות סומטיות ברמה הנמוכה שעשויה להיות נוכח דגימות מרקמות ממאירות או בחולים עם כמה תאים סרטניים במחזור, או כאשר מח עצם (BM), הוא מעשה טלאים. זה גם עושה הערכת מחלה שיורית לאחר טיפול או לגילוי מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול קשה על ידי רצף קונבנציונאלי בלבד 2. על ידי החלפת PCR קונבנציונאלי עם חומצות גרעין נעול (LNA) בתיווך wild-type חסימת PCR (WTB-PCR) ב רצף סנגר, רגישויות של עד 0.1 אלל מוטנטי% בתוך הרקע של WT ניתן להשיג 2, 3, 4. בשנתWTB-PCR, העשרה עבור אללים מוטנטים מושג באמצעות התוספת של קצר (~ 10 - 14 NT) חסימה (LNA) oligonucleotide שקושרה מעדיפים את WT DNA ובכך למנוע ההגברה של WT DNA. מוצר WTB-PCR מועשר המוטציה יכול להיות רצף אז. על ידי חסימת WT DNA ולא בחירת מוטציות ספציפיות WTB-PCR מאפשרת העשרה של שניהם מוטציות ידועות ובלתי ידועים הנוכחות שברי תא דקות. שיטות מרובות כיום משמשות לזיהוי מוטציות שברי תאים קטנים. זה כולל מערכת מוטצית אלל ספציפי PCR, הגברה-עקשנית (נשק), denaturing כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (DHPLC), חרוזים, תחליבים, הגברה, ומגנטיות (קורן), שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM), ברזולוציה גבוהה נקודה ואחרים היתוך. עם זאת, רוב השיטות אלה מוגבלים-תוצאות חיוביות שגויות ואת היכולת לזהות רק מוטציה אחת כי assay תוכנן עבור 4 </sup&gt;. WTB-PCR, לעומת זאת, מאפשרת למשתמש לדמיין עקבות רצף המאפשרת זיהוי של סוגי מוטציה מרובים ויכולים לסייע פוסלים תוצאות חיוביות שגויות עקב ממצאים או אירועים דיאמינציה. סידור הדור הבא (NGS) עשוי להציע חלופה הולמת סידור קונבנציונלי, אולם, עלויות משמעותיות גדולות יותר, מורכבות, וזמן assay כבר לדקלם את זה אופציה מיותרת עבור סוגי מחלות רבים עם כמה סמנים מולקולריים ברורים או לניטור מטופלים בתרופה עבור מתעוררים מוטציות עמידות. יתר על כן, שיעורי חיובי כוזבים גבוהים כאשר הגירסות באיתור עם תדרי אלל מוטנטי של פחות מ 5% יכולות להוות בעיה עבור NGS מבוסס amplicon 5, 6. כאן אנו מדגימים את הגידול רגיש מושג על ידי WTB-PCR הקרנה עבור מוטציות בגן 88 גורם בידול מיאלואידית כפי שתואר על ידי Albitar ואח. 3 MYD88 mutatioNS הם גורמים אבחון פרוגנוסטי חשוב Macroglobulinemia של Waldenström (WM), gammopathy מונוקלונלי IgM בעל משמעות לא ידוע (IgM-MGUS), לימפומה אזור שוליים הטחול (SMZL), מפוזר לימפומה B-cell גדול (DLBCL). מוטציות MYD88 נמצאים כמעט בכל המקרים של WM וכ 50% מהחולים עם אימונוגלובולין M (IgM) -secreting MGUS. וחשוף, מוטציות MYD88 נמצאות רק 0-6% מחולים עם SMZL ו נעדרות מיאלומה נפוצה 7, 8. מכיוון מורפולוגיים חופפים, immunophenotypic, ציטוגנטית, ואת המאפיינים הקליניים בין WM ו- SMZL או מיאלומה נפוצה-IgM יכול לעתים קרובות לסבך אבחנות דיפרנציאלי, בנוכחות מוטציה MYD88 עשוי לשמש כגורם 9 זיהוי שימושי. מוטציות MYD88 גם קושרו עם נטל המחלה יותר בחולים עם DLBCL והישרדות כוללת עניים לאחר טיפול 7, </sup&gt; 10. בנוסף, בגלל מוטציות MYD88 נמצאים בתדירות גבוהה יותר B-cell-like מופעל (ABC) DLBCL מ מרכז נבטי B-cell-like (GCB) DLBCL או לימפומה B-cell mediastinal העיקרי (PMBL), מצב המוטציה MYD88 עשויה לשמש סמן פונדקאי עבור תת ABC 11, 12. הפרוטוקול המפורט הניתן כאן משמש כתבנית שממנו המבחנים חדשים ניתן לפתח או ברוב מבחני רצף הקיימים ניתן להתאים בקלות לזהות מוטציות בתדירות נמוכות במדויק סוגים שונים מדגמים. הגישה יכולה לשמש גם עבור ניטור ואיתור מוטציות עמידות שעשויות להתפתח גידולים או אפילו חיידקים שעלולים להתפתח תוך חולי מטופלים עם טיפול ממוקד או אנטיביוטיקה. יתר על כן, היא מתייחסת ותרופות רבות מהבעיות הקשורות להעשרת מוטציה, במיוחד משובץ-פרפין קבוע פורמלין (FFPE) רקמות.

<table><tbody><tr><td>1.5 או 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה מנעול בטוח</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100% אלכוהול</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>כיתה היסטולוגיה; 91.5% אתנול, 5% אלכוהול איזופרופיל, 4.5% מתיל אלכוהול</td></tr><tr><td>3730XL רצף</td><td>ABI</td><td></td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td>לטיהור PCR חרוז</td></tr><tr><td>מגנטי אלומיניום רדיד איטום</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>עבור PCR ואחסון קר</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 ערכת רצף מחזור</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>לרצף דו-כיווני. עם 5x רצף מאגר</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5804 סדרת</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP רוטור (לצלחת PCR)</td></tr> <tr><td>צלחת קרה ל-96 צלחות</td><td>באר Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, RNAse, מים</td><td></td><td></td><td></td>טהורים במיוחד</tr><tr><td>dNTPs (100 מ"מ)</td> <td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 מגנט עם חצאית צד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>לשימוש בטיהור PCR.</td></tr><tr><td>אתנול אבסולוט&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 הוכחה, לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>אתר Exiqon Oligo Tools</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA פולימראז (5 U/&micro; L)</td> <td>Roche</td><td>12032937001</td><td>With10x מאגר תגובת PCR מרוכז, עם 20 מ"מ MgCl2</td></tr><tr><td>Gel מכשיר</td><td></td><td></td> אלקטרופורזה 2<td>% ג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי DNA FFPE של GeneRead&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td><td>מכיל אורציל DNA גליקוזילאז הדרוש להפחתת חפצי ריצוף</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>לריצוף.</td></tr><tr><td>LNA oligonucleotide</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+G+A+T+T+C/INVDT/ (+N = בסיסי LNA)</td></tr><tr><td>M13-F פריימר רצף</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R פריימר רצף</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה דגם 5430</td>רוטור <td>Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 (עבור צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5/2 מ"ל</td></tr>) <tr><td>NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR קדימה פריימר</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR פריימר הפוך</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR לוחות</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>פיפטורים</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1,000 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>מחיצת צלחת, 96 באר</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>עבור BM שאיבה ודם היקפי</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>לניתוח רצף</td></tr><tr><td>סל</td><td></td><td></td><td></td>שקופיות</tr><tr><td>נתרן אצטט (3 M, pH 5.2)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr>קצות <td></td><td></td><td>פיפטה מסוננים סטריליים</td><td>20, 200, 1,000 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>תרמומיקסר C&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> שטיפה <td>~ 1,000 מ"ל</td></tr><tr><td>קסילן</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>כיתה היסטולוגיה</td></tr></tbody></table>

חסימת pcr משולבת מסוג wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

גילוי וזיהוי מדויק של מוטציות בתדירות נמוכה יכול להיות בעייתי כאשר להערכת מחלת שיורי לאחר טיפול, בדיקות סקר לאיתור מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול, או כאשר יש מטופלים כמה תאים סרטניים במחזור. Wild-סוג חסימת PCR ואחריו לניתוח רצפי מציעה רגישות גבוהה, גמישות, ופשטות כמו מתודולוגיה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה אלה. על ידי הוספת מעוצבים בהתאמה אישית נעול oligonucleotide חומצות גרעין אל assay סידור חדש או בעבר הקים קונבנציונאלי המבוסס PCR, רגישויות של כ 1 אלל מוטנטי רקע של 1000 אללים WT יכולה להיות מושגת (1: 1000). חפצי רצף אירועים הקשורים דיאמינציה נפוצים ברקמות מוטבעות פרפין קבוע בפורמלין ניתן לתיקון חלקי על ידי שימוש glycosylase DNA אורציל במהלך שלבי חילוץ. הפרוטוקול המותאם כאן הוא ספציפי לזיהוי מוטצית MYD88, אך יכול לשמש כתבנית לעצב כלassay WTB-PCR. יתרונות של assay WTB-PCR מעל מבחני אחרים מנוצלים בדרך כלל לאיתור מוטציות בתדירות הנמוכה כולל אלל ספציפי PCR ו PCR כמוני בזמן האמת כוללים מופעים פחות של תוצאות חיוביות שגויות, גמישות רבה יותר וקלות ליישום, ואת היכולת לזהות הן ידוע ומוטציות ידועות.

סקירה מושגית של WTB-PCR במהלך ההארכה מוצגת באיור 1. בגלל חוסר התאמה של נוקלאוטיד יחיד ההיברידי החוסם-DNA מקטינה טמפרטורת ההתכה שלה מאוד (ΔT מ = 20 - 30 מעלות צלזיוס), הגברה של אלל WT חסום בזמן DNA תבנית מוטציה אינה כרוכה בתשלום כדי להשלים ארכה 17. באופן זה, ה- DNA מוטציה מוגבר אקספוננציאלית בזמן WT דנ&quot;א מוגבר באופן ליניארי. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";...

PCR חוסם מסוג פרא ואחריו ריצוף ישיר מציע שיטה רגישה ביותר לזיהוי מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה במגוון סוגי דגימות.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה במגוון סוגי דגימות. מתודולוגיה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בבדיקות של מוטציות סומטיות על ידי הקלה בזיהוי מוטציות בתדירות נמוכה מאוד. כאן נחפש מוטציות בגן myd88 בדגימות מחילק מוחרי).היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מידע מדויק ורגיש ביותר לגבי נוכחותן של מוטציות סומטיות, אפילו כאשר מספר התאים הניאופלסטיים קטן מאוד. בדיקת ריצוף זו, המבוססת על PCR עם חסימת סוג 야רי (wild type blocking), פותחה כדי להגביר חלק מאקסון 5 בגן myd88, ובכך להבטיח כיסוי של נקודת החום (hotspot) L265. הפריימרים הקדמי וההפוכי תוכננו עם רצף M13 בקצה 5' כדי לאפשר חיבור של פריימרים משלימים לריצוף.תכננו את האוליגונוקלאיד החוסם כך שאורכו יהיה כ-10 עד 15 בסיסים, ויהיה משלים לתבנית מסוג הפרא (wild type) במקום שבו רצוי להשיג העשרה של מוטציות. אוליגו קצר יותר ישפר את היכולת להבחין בין רצפים לא תואמים (mismatch discrimination). כדי להשיג ספציפיות גבוהה למטרה, חשוב שלא להשתמש בכמות גדולה מדי של נוקלאוטידים חוסמים, שכן הדבר יוביל לאוליגונוקלאידים בעלי קישוריות גבוהה מדי (sticky).כדי לתכנן את האוליגונוקלאוטיד החוסם, התחילו בניווט לאתר Oligo Tools. בחרו בכלי לחיזוי Oligo TM. חלון חדש ייפתח.הדביקו את הרצף של תבנית סוג הבר (wild type) שאתם מעונ

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מתאר תגובת שרשרת פולימראז חוסמת מסוג פראי, או WTB-PCR, המזהה מוטציות סומטיות. הטכניקה מבוססת PCR משתמשת בחומצת גרעין נעולה, או LNA, אוליגונוקלאוטיד שנקשר לאלל הבר המשלים שלו וחוסם את התארכותו. החסימה מאפשרת באופן סלקטיבי הגברה של אללים מוטנטיים ברמה נמוכה על פני הגרסאות הפראיות שלהם בדגימה.

חסימת PCR מסוג Wild לאיתור מוטציות סומטיות בתדר נמוך

אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ולכידת אקסון הבא המבוסס על הכלאה לזיהוי של מוטציות סרטן קשור מפתח בדגימות גידול קליניים על ידי רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי. רצף אקסון ממוקד מציע יתרונות של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מניב רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים קליניים עבור שני לוחות ריצוף מהדור הבא. פאנל אחד חוקר ממאירויות המטולוגיות ואילו הפאנל השני מתמקד בגנים שעברו מוטציה בדרך כלל בגידולים מוצקים. סיווג מולקולרי של מוטציות מניעות בגידולים ממאירים אנושיים מציע מידע פרוגנוסטי וחיזוי רב ערך.

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

מאמר זה מתאר שיטה לזהות שינויים של שבטים ושבטים תת-שבטיים בין דגימות שונות ממטופל נתון. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסוג גידול מסוים, הגישה ישימה באופן כללי לגידולים מוצקים אחרים.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

מאמר זה מציג את היישום של שיטת זיהוי בתדר נמוך המבוססת על ריצוף Sanger בלימפומה אנגיואימונובלסטית. לספק בסיס ליישום שיטה זו על מחלות אחרות.

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

רצף תא בודד הוא כלי פופולרי ונגיש יותר ויותר לטיפול שינויים הגנומי ברזולוציה גבוהה. אנו מספקים פרוטוקול המשתמש רצף תא בודד לזהות שינויי מספר עותק תאים בודדים.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

למדו לזהות מוטציות סומטיות בתדר נמוך בדגימות מח עצם באמצעות חסימת PCR משולבת מסוג Wild ורצף ישיר. שיטה זו מאפשרת איתור מדויק של מוטציות בגן myd88 לצורך חקר אונקולוגי מתקדם.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

גלה סרטונים נוספים