שחזור בקנה מידה גדול ועצמאי, Clustering משוחדת בהתבסס על מדדי מורפולוגי לסווג נוירונים באוכלוסיות סלקטיבי

פרוטוקול זה מתאר שחזורים בקנה מידה גדולה של אוכלוסיות נוירונים סלקטיבית, שכותרתו בעקבות זיהום מדרדר עם וירוס כלבת מהונדס להביע סמני ניאון, ואשכול עצמאי, ללא דעות מוקדמות מנתח המאפשר אפיון מקיף של מדדים מורפולוגיים בין subclasses העצבית ברורה.

מטרות פרוטוקול זה הן לתאר צעדים לשחזור המורפולוגיה של נוירונים המסומנים בנגיף ולבצע ניתוחי אשכולות עצמאיים, בלתי מוטים, על אוכלוסיות של נוירונים מסומנים כדי לאפשר אפיון מקיף של מדדים מורפולוגיים לאורך תת-מחלקות עצביות נפרדות. אנו מתארים גישה חדשה לאיסוף וניתוח נתונים נוירו-אנטומיים כדי לאפשר דגימה מקיפה יותר וסיווג בלתי מוטה של סוגי נוירונים ייחודיים מבחינה מורפולוגית בתוך אוכלוסיית נוירונים סלקטיבית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח בקנה מידה גדול של מורפולוגיה עצבית ומשתמשת בשיטות בלתי מוטות כדי לסווג תת-מחלקות עצביות מובהקות.

ההיבטים המאתגרים ביותר של שחזורים מורפולוגיים הם בחירת נוירונים מבודדים היטב לשחזור, הקצאת עומק z מתאים ויישור סוכות להמשך שחזורים על פני קטעי רקמה סמוכים. התחל שחזור על ידי בחירת שקופית הנושאת קטע רקמת מוח מוכתם של 50 מיקרון מפרימט המוזרק באופן סטריאוטקסי עם נגיף כלבת שונה המבטא EGFP. הנח את השקופית במחזיק השקופיות של המיקרוסקופ והתמקד בקטע יחיד של עניין באמצעות מטרת הגדלה נמוכה.

ודא שתמונת המצלמה גלויה בתמונה החיה על ידי מיקום נכון של תריס המצלמה. בחר נוירון מסומן מבודד למדי בתוך מבנה המוח המעניין כדי לאפשר שחזור חד משמעי של ארבוריזציה דנדריטית. עבור להגדלה של פי 10 והבא את האזור למיקוד.

עדיף לבחור נוירונים אם גוף התא נמצא במלואו בתוך קטע יחיד כדי להעריך במדויק את שטחו ועיגולו. לאחר שנבחר נוירון מוכתם היטב ומבודד היטב, לחץ על כפתור הקטע החדש בתוכנה כדי להוסיף את קטע הבית המכיל את גוף התא למנהל המקטע. הזן את מספר החלקים שיש לכלול בשחזור.

ממליץ להוסיף שניים עד שלושה חלקים כדי להתחיל. הקצה עובי חתך של 50 מיקרון. בחר את שני x המטרה ולאחר מכן לחץ על כפתור קווי המתאר בסרגל הכלים העליון ובחר את סוג קווי המתאר מהתפריט הנפתח.

עקוב אחר קווי המתאר של מבנה היעד באמצעות העכבר כדי ללחוץ על נקודות לאורך קווי המתאר. לאחר שתסיים לעקוב אחר קווי המתאר, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על העכבר ובחר סגור קו מתאר מהתפריט כדי לסגור את קווי המתאר. לאחר מכן, כשהתצוגה עדיין בשני x, לחץ על סמל הסמן הרצוי בסרגל הכלים השמאלי.

לאחר מכן לחץ על מרכז מבנה היעד כדי למקם את הסמן. לאחר השלמת קווי המתאר, בחר את המטרה 40x או 60x כדי לעקוב אחר קווי המתאר של גוף התא. לאחר מכן בחר את כפתור מעקב הנוירונים בסרגל הכלים העליון ובחר את מבנה הנוירון כדי לעקוב, במקרה זה, אחר גוף התא, מהתפריט הנפתח.

עקוב אחר גוף התא על ידי לחיצה על נקודות סביב ההיקף הגדול ביותר של גוף התא, והתאם את עומק ה-z לפי הצורך כדי להביא את גוף התא למיקוד. ולחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על העכבר כדי לסיים את קווי המתאר של גוף התא. לאחר מכן, מקם סמן בסגנון שונה במרכז קווי המתאר של גוף התא, וודא שהסמן נמצא בערך במרכז בעומק z.

זה קריטי לקבוע את עומק ה-z הנכון במקטע הבית. כמו גם במקטעים סמוכים, לפני תחילת כל מעקב כך שערכי ציר z יהיו מדויקים. כדי להתחיל לעקוב אחר סוכות דנדריטיות, בחר דנדריט מהתפריט הנפתח העליון.

לאחר מכן עקוב אחר כל דנדריט החל מגוף התא. כאשר דנדריט מסתעף, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על העכבר ובחר צומת מתפצל או צומת משולש כדי למקם צומת בנקודת הסתעפות זו. הקפד להתאים את עומק ה-z לאורך המעקב כדי ללכוד במדויק את הזווית והכיוון של הדנדריט.

בסוף הדנדריט בחלק זה, לחץ לחיצה ימנית על העכבר ובחר סיום מהתפריט הנפתח. כאשר כל הסוכות הדנדריטיות מאותרות בחלק הבית, זהה את הקצוות הדנדריטיים שסביר להניח שימשיכו לתוך החלק הסמוך. והבא אותם למיקוד בעומק z המתאים בתמונת המיקרוסקופ ב-20x.

כלול ציוני דרך עיקריים בקרבת מקום כגון כלי דם או דפוסי דנדריטים או צרורות הניתנים לזיהוי בקלות בתמונת המיקרוסקופ. לאחר מכן, צלם תמונה של התמונה החיה באמצעות מצלמה דיגיטלית המוחזקת ביד על מסך המחשב. לאחר מכן העבר את מטרת המיקרוסקופ לשני x ועבור לחלק הסמוך בשקופית.

לאחר מכן יישר את קווי המתאר של הקטע שאותר בעבר בתצוגת התוכנה עם גבולות ה- LGN וה- TRN בקטע החדש. חזור ל-20x ויישר באמצעות ציוני דרך. לאחר מכן, בעזרת התמונה של קצות הדנדריטים מהקטע שאותר קודם לכן, הזז את המעקב כדי ליישר את הדנדריטים על ידי שימוש תחילה בכלי החץ כדי לבחור את השחזור.

לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית ובחר העבר מהתפריט הנפתח והעבר את המעקב בהתאם. כדי לסובב את העקיבה, לחץ לחיצה ימנית ובחר סובב מהתפריט הנפתח וסובב את העקיבה בהתאם. לחלופין, בחר את כלי ההתאמה מהתפריט הנפתח של הכלים העליונים ובחר את מספר הנקודות להתאמה.

לאחר מכן לחץ על הסוף בשחזור ועל נקודת ההמשך המתאימה בתמונה החיה כדי להתאים סיומות דנדריטיות להתחלות. לאחר שהמעקב מהקטע הקודם מסודר עם הדנדריטים בקטע החדש, הוסף קטע חדש למנהל המקטע כמו קודם. לחלופין, פשוט בחר את המקטע הסמוך שנוצר קודם לכן והתאם את עומק ה-z באותו אופן.

ודא שהקטע החדש המתאים נבחר במנהל המקטעים על ידי לחיצה על המקטע הנוכחי. לאחר מכן, לאחר הגדלת ההגדלה ל-40x או 60x, בחר את הדנדריט באמצעות החץ. לחץ לחיצה ימנית על העכבר בקצה הדנדריט מהסעיף הקודם ובחר הוסף לסיום מהתפריט הנפתח.

הנחיה תשאל אם ההמשך נמצא במקטע חדש. לחץ על כן. לאחר מכן עקוב אחר המשך הדנדריט באמצעות העכבר ככלי ציור.

צלם תמונות של הסופים כהכנה ליישור לחלק הבא. לאחר מכן הוסף המשכיות למעקב דנדריטי עד שלפחות שלושה מקטעים יתגלו עבור הנוירון או עד שלא ניתן יהיה עוד לעקוב אחר הדנדריטים או למצוא אותם. באמצעות תוכנית מיצוי הקשורה למערכת שחזור הנוירונים, פתח תיק שחזור שהושלם.

מהתפריט הנפתח עריכה, בחר בחר את כל האובייקטים. בחר ניתוח מבנה ענף מסרגל הכלים העליון של הניתוח ולאחר מכן לחץ על כל כרטיסייה ובחר את אפשרויות הניתוח הרצויות בכל כרטיסייה. חלץ את כל הנתונים הרצויים על ידי לחיצה על OK כפתור בחלון הניתוח ושמור בפורמט גיליון אלקטרוני על ידי לחיצה ימנית על חלונות הפלט ובחירת ייצוא ל-Excel להמשך ניתוח.

תצלום זה מראה חתך עטרה יחיד דרך ה-LGN הגבי של בעל חיים אחד. צביעת ציטוכרום אוקסידאז משמשת להדמיית שכבות LGN. וצביעת GFP מסמנת את אתר הזרקת הנגיף.

החץ מציין אזורים של נוירונים צפופים ומסומנים רטרוגרדית. כיוון החתך הוא על פי המצפן הצדדי המדיאלי הגחוני הגבי המצויר. סרגל קנה המידה מוצג בפינה הימנית התחתונה.

תמונה זו מציגה את קווי המתאר של ה-LGN באדום וה-TRN בצבע חום עבור כל החלקים המכילים הזרקת וירוס כפי שמצוין על ידי קווי המתאר השחורים. כוכבים צהובים מציינים מרכזים של אתרי הזרקה. תמונה זו מציגה את העיבוד התלת-ממדי של קווי המתאר ואתר ההזרקה.

זוהי מפה של המיקומים של נוירוני TRN משוחזרים המקודדים בצבע על פי הקצאת אשכול בתוך מתאר TRN מצטבר יחיד המוצג בצבע חום. סרגל קנה המידה מייצג 500 מיקרון. תמונה זו מציגה קווי מתאר מצטברים של TRN בשחור ו-LGN באפור עם חמישה נוירוני TRN משוחזרים צבועים חם עד קריר בהתאם למיקומם הצדדי המדיאלי בתוך ה-TRN.

סרגל קנה המידה מייצג 500 מיקרון. תצלומים אלה מראים את הפרטים של אותם חמשת נוירוני TRN עם פסי סולם תואמים בצבע המייצגים 100 מיקרון. עץ דנדרוגרמה היררכי זה ממחיש מרחקי קישור בין 160 נוירוני TRN משוחזרים בהתבסס על 10 מדדים מורפולוגיים בלתי תלויים ומציג את התוצאות הכוללות של ניתוח האשכולות.

שלושה אשכולות נפרדים של נוירוני TRN מוצגים בכחול, ירוק ואדום. לאחר שליטה בטכניקות שחזור עצביות אלה, ניתן לשחזר נוירון בודד לחלוטין תוך שעה עד שעתיים. חשוב לנטר ולהתאים כל הזמן את עומק ה-z תוך כדי שחזור נוירונים.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיפור על שיטות ניתוח נוירו-אנטומיות מסורתיות, מוטות יותר, ומאפשר לחוקרים לחקור תת-קבוצות חדשות של נוירונים על סמך נתונים מורפולוגיים בקנה מידה גדול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לשחזר נוירונים דרך קטעי רקמה סמוכים ולחלץ נתונים מורפולוגיים להמשך ניתוח.