שחזור בקנה מידה גדול ועצמאי, Clustering משוחדת בהתבסס על מדדי מורפולוגי לסווג נוירונים באוכלוסיות סלקטיבי

מטרות פרוטוקול זה הן לתאר את השלבים לשחזור המורפולוגיה של נוירונים המסומנים בווירוס ולבצע ניתוחי אשכולות (cluster analyses) עצמאיים ובלתי מוטים על אוכלוסיות של נוירונים מסומנים, כדי לאפשר אפיון מקיף של מדדים מורפולוגיים לאורך תתי-סוגים נוירונליים מובחנים. אנו מתווים גישה חדשנית לאיסוף וניתוח נתונים נוירו-אנטומיים כדי להקל על דגימה מקיפה יותר וסיווג בלתי מוט של סוגי נוירונים ייחודיים מבחינה מורפולוגית בתוך אוכלוסייה נוירונלית סלקטיבית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח רחב היקף של מורפולוגיה נוירונלית ומשתמשת בשיטות בלתי מוטות לסיווג תתי-סוגים נוירונליים מובחנים.

ההיבטים המאתגרים ביותר של שחזורים מורפולוגיים הם בחירת נוירונים מבודדים היטב לשחזור, קביעת עומק ה-z המתאים, ויישור הענפים כדי להמשיך את השחזורים על פני חתכי רקמה סמוכים. התחילו את השחזור בבחירת סלייד הנושא חתך רקמת מוח בעובי 50 micron של פרימט שהוזרק באופן סטריאוטקסי עם נגיף כלב (rabies virus) שעבר מודיפיקציה ומבטא EGFP. הניחו את הסלייד במחזיק הסליידים של המיקרוסקופ והתמקדו בחתך בודד רלוונטי באמצעות עדשה בהגדלה נמוכה.

ודאו שתמונת המצלמה נראית בשידור החי על ידי מיקום נכון של תריס המצלמה. בחרו נוירון מסומן ומבודד במידה סבירה בתוך מבנה המוח הרלוונטי כדי לאפשר שחזור חד-משמעי של הענפיות הדנדריטיות. עברו להגדלה של 10x והביאו את האזור לפוקוס.

יש לבחור באופן מועדף נוירונים שגוף התא שלהם נמצא כולו בתוך חתך בודד, כדי להעריך במדויק את השטח והעגלות שלו. לאחר בחירת נוירון הצבוע והמבודד היטב, לחץ על כפתור החתך החדש (new section) בתוכנה כדי להוסיף את חתך הבית המכיל את גוף התא למנהל החתכים. הזן את מספר החתכים שיש לכלול בשחזור.

מומלץ להכניס שני עד שלושה חתכים להתחלה. הגדירו עובי חתך של 50 מיקרון. בחרו בעדשה עם הגדלה של 2x, לאחר מכן לחצו על כפתור ה-contour בסרגל הכלים העליון ובחרו את סוג ה-contour מהתפריט הנפתח.

עקבו אחר המתאר של המבנה המטרה באמצעות לחיצות עם העכבר על נקודות לאורך המתאר. עם סיום שרטוט המתאר, לחצו קליק ימני בעכבר ובחרו "close contour" מהתפריט כדי לסגור את המתאר. לאחר מכן, כאשר התצוגה עדיין נמצאת על פי שניים (two x), לחצו על סמל הסמן הרצוי בסרגל הכלים השמאלי.

לאחר מכן, לחצו על מרכז מבנה המטרה כדי למקם את הסימון. ברגע שקווי המתאר הושלמו, בחרו בעדשה של 40x או 60x כדי לשרטט את קווי המתאר של גוף התא. לאחר מכן, בחרו בכפתור מעקב הנוירונים (neuron tracing) בסרגל הכלים העליון, ובחרו מהתפריט הנפתח את מבנה הנוירון למעקב, ובמקרה זה, גוף התא.

סמנו את גוף התא על ידי לחיצה על נקודות מסביב להיקפו הרחב ביותר של גוף התא, תוך התאמת עומק ה-z לפי הצורך כדי להביא את גוף התא לפוקוס. לחצו לחיצה ימנית בעכבר כדי לסיים את תיחום גוף התא. לאחר מכן, מקמו סמן בסגנון שונה במרכז תיחום גוף התא, תוך הבטחה כי הסמן נמצא בקירוב במרכז עומק ה-z.

קריטי לקבוע את עומק ה-z הנכון בחלק הבית, כמו גם בחלקים הסמוכים, לפני תחילת כל שרטוט כדי שערכי ציר z יהיו מדויקים. כדי להתחיל בשרטוט ענפי דנדריטים, בחר dendrite מהתפריט הנפתח העליון.

לאחר מכן, עקבו אחר כל דנדריט החל מגוף התא. כאשר דנדריט מתפצל, לחצו על המקש הימני בעכבר ובחרו ב-bifurcating node או ב-trifurcating node כדי למקם צומת בנקודת פיצול זו. ודאו שאתם מתאימים את עומק ה-z לאורך כל המעקב כדי ללכוד במדויק את הזווית והכיוון של הדנדריט.

בסוף הדנדריט בחלק זה, לחצו לחיצה ימנית בעכבר ובחרו ב-ending מהתפריט הנפתח. כאשר כל הענפים הדנדריטיים יסומנו בחלק הראשי, זהו את אותם קצוות דנדריטיים שסביר להניח שיימשכו אל החלק הסמוך. והביאו אותם למיקוד בעומק ה-z המתאים בתמונת המיקרוסקופ בהגדלה של 20x.

כללו נקודות ציון מרכזיות בסביבה, כגון כלי דם או תבניות דנדריטים או צרורים שניתן לזהות בקלות בתמונת המיקרוסקופ. לאחר מכן, צלמו את התמונה החיה באמצעות מצלמה דיגיטלית המוחזקת ביד מול מסך המחשב. לאחר מכן, העבירו את עדשת המיקרוסקופ למצב two x ועברו לחתך הסמוך על השקופית.

לאחר מכן, יישרו את קווי המתאר של החלק שסומן קודם לכן בתצוגת התוכנה עם הגבולות של ה-LGN וה-TRN בחלק החדש. חזרו להגדלה של 20x ויישרו באמצעות נקודות ייחוס. לאחר מכן, בעזרת התמונה של קצות הדנדריטים מהחלק שסומן קודם לכן, העבירו את הסימון כדי ליישר את הדנדריטים, ראשית באמצעות כלי החץ לבחירת השחזור.

לאחר מכן, לחצו לחיצה ימנית ובחרו "move" (הזזה) מהתפריט הנפתח והזיזו את השרטוט בהתאם. כדי לסובב את השרטוט, לחצו לחיצה ימנית ובחרו "rotate" (סיבוב) מהתפריט הנפתח וסובבו את השרטוט בהתאם. לחלופין, בחרו את כלי ההתאמה (match tool) מתפריט הכלים העליון ובחרו את מספר הנקודות להתאמה.

לאחר מכן, לחצו על הקצה בשחזור ועל נקודת ההמשך המתאימה בתמונה החיה כדי להתאים את סופי הדנדריטים לתחילותיהם. לאחר ששרטוט השכבה הקודמת מיושר עם הדנדריטים בשכבה החדשה, הוסיפו שכבה חדשה למנהל השכבות כפי שנעשה קודם לכן. לחלופין, בחרו פשוט בשכבה הגובלת שנוצרה קודם לכן והתאימו את עומק ה-z באותו אופן.

וודאו שהסעיף החדש המתאים נבחר במנהל הסעיפים על ידי לחיצה על הסעיף הנוכחי. לאחר מכן, לאחר הגדלת ההגדלה ל-40x או 60x, בחרו את הדנדריט באמצעות החץ. לחצו לחיצה ימנית עם העכבר על קצה הדנדריט מהסעיף הקודם ובחרו "add to ending" מהתפריט הנפתח.

הודעה תבקש לציין אם ההמשך נמצא במקטע חדש. לחצו על כן. לאחר מכן, עקבו אחר המשכו של הדנדריט באמצעות העכבר ככלי רישום.

צלם את הסיומות כהכנה ליישור למקטע הבא. לאחר מכן, הוסף המשכים לשרטוטים הדנדריטיים עד שסורטטו לפחות שלושה מקטעים עבור הנוירון, או עד שלא ניתן יהיה לעקוב אחר הדנדריטים או למצוא אותם יותר. באמצעות תוכנת חילוץ הקשורה למערכת שחזור הנוירונים, פתח קובץ שחזור שהושלם.

בתפריט הנפתח "עריכה" (edit), בחר ב-"בחר את כל האובייקטים" (select all objects). בחר ב-"ניתוח מבנה ענפים" (branch structure analysis) מסרגל כלי הניתוח העליון, לאחר מכן לחץ על כל לשונית ובחר את אפשרויות הניתוח הרצויות בכל לשונית. חלץ את כל הנתונים הרצויים על ידי לחיצה על כפתור ה-OK בחלון הניתוח, ושמור אותם בפורמט של גיליון אלקטרוני על ידי לחיצה ימנית על חלונות הפלט ובחירה ב-"ייצוא ל-Excel" (export to Excel) לצורך ניתוח נוסף.

תמונה זו מציגה חיתוך קורונלי בודד דרך ה-LGN הגבי של חיה אחת. צביעת cytochrome oxidase משמשת להדמיית שכבות ה-LGN, וצביעת GFP מסמנת את אתר הזרקת הווירוס.

החץ מצביע על אזורים של נוירונים צפופים המסומנים באופן רטרוגרדי בגרעין הרשת התלמי (thalamic reticular nucleus). כיוון החיתוך הוא בהתאם למצפן הגבי-בטני (dorsal ventral) והמדיאלי-לטרלי (medial lateral) המוצג. סרגל המقياس מוצג בפינה השמאלית התחתונה.

תמונה זו מציגה את קווי המתאר של ה-LGN באדום ושל ה-TRN בבורדו עבור כל החתכים המכילים הזרקת נגיף, כפי שמסומן על ידי קווי המתאר השחורים. כוכבים צהובים מצביעים על מרכזי אתרי ההזרקה. תמונה זו מציגה את הדמיית התלת-ממד של קווי המתאר ואתר ההזרקה.

זוהי מפה של מיקומי נוירונים משוחזרים ב-TRN, המקודדים בצבעים לפי השיוך לצבירה (cluster) בתוך קו מתאר מצטבר בודד של ה-TRN המוצג בצבע בורדו. סרגל המقياس מייצג 500 microns. תמונה זו מציגה קווי מתאר מצטברים של ה-TRN בשחור ושל ה-LGN באפור, עם חמישה נוירונים משוחזרים ב-TRN הצבועים מצבעים חמים לקרירים בהתאם למיקומם המדיאלי-לטרלי בתוך ה-TRN.

סרגל המقياس מייצג 500 מיקרון. תמונות אלה מראות את הפרטים של אותם חמישה נוירונים של ה-TRN עם סרגלי מידה תואים בצבע המייצגים 100 מיקרון. עץ דנדרוגרמה היררכי זה ממחיש את מרחקי הקישור בין 160 נוירוני TRN ששוחזרו, בהתבסס על 10 מדדים מורפולוגיים בלתי תלויים, ומציג את התוצאות הכוללות של ניתוח האשכולות.

שלושה מקבצים נפרדים של נוירונים ב-TRN מוצגים בכחול, ירוק ואדום. ברגע ששולטים בטכניקות שחזור נוירונים אלו, ניתן לשחזר נוירון בודד באופן מלא בתוך שעה עד שעתיים. חשוב לנטר ולהתאים באופן רציף את עומק ה-z בזמן שחזור הנוירונים.

הפרוטוקול המתואר כאן מהווה שיפור ביחס לשיטות ניתוח נוירו-אנטומיות מסורתיות ומוטות יותר, והוא מאפשר לחוקרים לחקור תתי-סוגים חדשים של נוירונים על בסיס נתונים מורפולוגיים רחבי היקף. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השחזור של נוירונים באמצעות חתכים רקמתיים סמוכים והפקת נתונים מורפולוגיים לצורך ניתוח נוסף.