ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

המטרה הכוללת של גישת אלקטרופורציה זו ברחם היא לאפיין את הקישוריות המבנית והריגוש של נוירונים בקליפת המוח בתנאים רגילים וניסיוניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בנוירוביולוגיה ההתפתחותית, כגון ניתוח המבנה והקישוריות התפקודית של המוח והביולוגיה של הפרעות קוגניטיביות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת סימון של אוכלוסייה דלילה של נוירונים ומאפשרת לך להלביש את הדנדריטים ולגשת לנוירונים הבודדים, מה שמוביל לניתוח כמותי יעיל יותר ופימטי יותר.

לפני ההזרקה, הכינו עשרה מיקרוליטרים של תערובת DNA לכל ניתוח לתיוג תא בודד או למחקר מהדק טלאי סטנדרטי. לאחר מכן, תפעל את העוברים בעדינות עם האצבעות כדי לאתר את הטלנצפלון. לאחר מכן, הניחו נימי בורוסיליקט מוכנים בפיפטה בפיה.

העבירו את קצה המחט דרך הרחם, הימנעו מכלי דם, עד שהוא מגיע לחדר הרוחבי. לאחר מכן, הזרקו לאט כמיקרוליטר אחד של תמיסת DNA בצבע ירוק מהיר עד שנצפה כתם כחול גדול. שלב קריטי בהליך זה הוא הזרקת ה-DNA.

יש לעשות זאת בעדינות ככל האפשר. כעת, הנח את אלקטרודות הפלטינה של שבע המילימטר לרוחב על ראש העובר והפעל מתח באמצעות אלקטרודות הפלטינה. בהליך זה, הגן בהקפאה על המוח הקבוע בעשרה מיליליטר של 30% סוכרוז ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים עד שהם שוקעים.

לאחר מכן מכינים קוביות נייר אלומיניום בסנטימטר אחד וממלאים את הקוביות 2/3 או בדרך ב-OCT. לאחר מכן, הכניסו את המוח לקוביות והקפיאו אותן על קרח יבש. לאחר מכן אחסן את המוחות הקפואים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.

כדי לחתוך את המוח בקריוסטט, יש להניח טיפה של OCT על פני דיסק הדגימה. יש לקלף את רדיד האלומיניום מהבלוק ההיסטולוגי ולמקם את הבלוק בכיוון הרצוי על גבי ה-OCT הנוזלי. יש להפעיל לחץ חזק עד שהבלוק ההיסטולוגי מקובע.

לאחר מכן הכנס את דיסק הדגימה לראש הדגימה של הקריוסטט וכוון את הדגימה לחתך. לאחר מכן פורסים חלקים בעובי 50-100 מיקרומטר ומעבירים את הקריוחתים הצפים ל-PBS באמצעות מברשת עדינה. לאחר מכן, יש לחסום את החלקים למשך שעה בטמפרטורת החדר עם סרום בקר עוברי 5% ב-PBS, המכיל 0.5% טריטון X-100.

לאחר מכן, דגרו אותם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני של 1:500 מדולל בתמיסת חסימה. למחרת, שטפו את החלקים שלוש פעמים ב-PBS. הוסף נוגדן משני 1:500 מדולל בתמיסת חסימה ודגירה על החלקים למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן שטפו את החלקים שלוש פעמים ב- PBS. לאחר מכן, צבעו את החלקים עם dapE ב-PBS המכילים 0.5% טריטון X-100 למשך עשר דקות. שוטפים את החלקים עם PBS ומרכיבים אותם עם מדיום הרכבה.

כדי לשחזר את הנוירונים, רכשו תמונות של חלקי המוח בהגדלה גבוהה וברזולוציה גבוהה. לאחר מכן, בחר סריקת אריחים בתוכנת הרכישה כדי לכסות את אזור העניין, המשתרע על כל הדנדריטים והתהליכים האקסונליים. רכוש מספר מספיק של מחסניות על ציר Z כדי למנוע אובדן מידע.

לאחר מכן, פתח את התמונה ובחר באפשרות הקו המפולח מהתפריט. ציירו קו העוקב אחר מבנה הנוירון. לאחר מכן, עבור אל ניתוח, כלים, ואחריו מנהל החזר ROI, ולאחר מכן הוסף כדי לשמור את השורה.

חזור על תהליך זה עבור כל אקסון או דנדריט של תא העצב המנותח. בתפריט מנהל החזר ההשקעה, לחץ על מדידה כדי לקבל את האורך. ייצא את המדידות לקובץ טקסט או לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.

כדי לבצע הקלטה של תא עצב מבוטא GFP מעכבר אלקטרופוט GFP, הניחו את המוח בצלחת תרבית צוננת. חותכים את המוח הקטן במספריים קטנים. לאחר מכן הרימו את המוח בעזרת מרית וייבשו אותו על מגבת נייר.

הדביקו את מישור הזנב הגחוני של המוח על מחזיק ויברטום. הנח את המחזיק על ויברטום מלא ב-ACSF קר כקרח וודא שלתא הוויברטום יש קרבוגנציה רציפה. לאחר מכן, השג פרוסות חריפות על ידי חיתוך 300 מיקרומטר קטעי עטרה תוך 15 דקות.

לאחר מכן, דגרו את הפרוסות החריפות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפחות ב-ACSF תוך כדי בעבוע עם קרבוגן. לאחר 60 דקות, העבירו פרוסה לתא ההקלטה באמצעות פיפטה פסטר או מברשת קטנה. החזיקו את הפרוסה בעזרת נבל והשתמשו בה ב-ACSF בקצב של שני מיליליטר לדקה.

כדי לתקן נוירון חיובי GFP, אתר את אזור העניין דרך המיקרוסקופ ב-10x. לאחר מכן מצא תא חיובי GFP באמצעות המטרה 60x. לאחר מכן, מלאו את אלקטרודת ההקלטה בתמיסה תוך תאית.

לאחר מכן, הניחו פיפטה מזכוכית במחזיק הפיפטה. לאחר מכן, הניחו את קצה הפיפטה באמבטיה והתמקדו בקצה. לאחר שהפיפטה נמצאת באמבטיה, הפעל לחץ חיובי דרך מערכת בקרת הלחץ האחורי.

התקרב לתא המעניין תחת הנחיה חזותית תוך שמירה על לחץ אחורי בפיפטה. עם הופעת גומה קטנה על פני התא, שחרר את הלחץ. בשלב זה עשוי להיווצר אטימה הדוקה עם התנגדות גדולה מג'יגה-אוהם אחד.

אחרת, הפעל לחץ שלילי קל כדי להקל עליו. בזמן היווצרות החותם, הביאו את מהדק מתח האחיזה ל 60 מילי-וולט. לאחר שנוצר אטם הג'יגה-אוהם, הפעל דופק יניקה כדי לקרוע את קרום התא ולפרוץ למצב התא כולו.

ברגע שהוא במצב תא שלם, עבור ממתח clamp לזרם clamp מצב והתחל להקליט. תמונות אלה מראות את העברת הווקטורים לתאי עצב בשכבה 2/3 על ידי אלקטרופורציה ברחם ביום העוברי 15.5, והחתכים העטרתיים הוכנו ביום 16 לאחר הלידה. וקטור CAG DsRed2 הועבר כבקרה.

GFP מתבטא רק באותם נוירונים ששילבו גם cre, מה שמאפשר רקומבינציה של אתרי LoxP בווקטור CALNL GFP. הנה תמונה קונפוקלית בהגדלה גבוהה של הסוכות הדנדריטיות של נוירון GFP אחר המסומן בדלילות. זהו נוירון פירמידלי אלקטרופוטרי עם GFP שנצפה בשדות בהירים ובתנאי פלואורסצנציה ירוקה.

הנה תגובת זינוק טיפוסית וקבועה של נוירון בקרה אלקטרופוטרי CAG-GFP בשכבה 2/3. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות עבור אלקטרופורציות ברחם וחצי יום עבור הקלטת מהדק המדבקה אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את הניתוח מהר ככל האפשר כדי להפחית את הלחץ של האם ולהגדיל את סיכויי ההישרדות של הגורים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ביטוי על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו הקשר בין ביטוי של גנים ספציפיים והשפעתם על התפתחות הפונדקאית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח ההתפתחותיים לחקור קישוריות ומורפולוגיה של נוירונים בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש בניתוח הרחם כדי לתאר את המבנה והקישוריות של תאי עצב ברמת התא הבודד ואת הריגוש של נוירונים המסומנים באופן פלואורסצנטי.