אבחון הרומן ב מהדורה שכיחיםהחלפת: שתל Sonication ואת תגובת שרשרת פולימראזית מולטיפלקס
3 בדצמבר 2017
אבחון משלים בשכיחיםהחלפת כואב היא קריטית להצלחה בטיפול. השאיפה המשותפת מתבצע באופן שגרתי preoperatively. מולטיפלקס תגובת שרשרת פולימראזית בין וביופסיה משותפת את הנוזל sonication, כלי ריאלי עבור זיהוי הפתוגן מהירה מדגימות אלה מתואר.
המטרה הכללית של הפרוצדורות המתוארות באמצעות שאיבה ממפרק, תגובת שרשרת פולימראז רב-מטרה (multiplex polymerase chain reaction) וסוניקציה היא לספק תוצאות מיקרוביולוגיות מהירות ואמינות למנתחי אורתופדיה במקרים של חשד לזיהום מפרקי פרי-פרוטזה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האבחוני והטיפולי של זיהום מפרקי פרי-פרוטזה, כגון זיהוי מוקדם של פתוגנים, ובכך לאפשר טיפול ממוקד ומוקדם. היתרון המרכזי של טכניקות אלה הוא אספקת תוצאות מהירות.
הדבר יכול להאיץ את האבחנה המבדלת במקרים של חשד לזיהום פרוטזת מפרק. הנח את המטופל במצב שכיבה גב על מיטת בדיקה. אם יש לבצע ניקור בברך, הנח גליל ברך מתחת לברך המטופל כך שהברך תהיה במצב של כיפוף קל.
השתמשו במכונת גילוח חשמלית כדי לקצר שיער גוף סמיך או ארוך. לאחר מכן, הכינו את שולחן הכלים והתלבשו לניתוח בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, השתמשו בחומר חיטוי לעור כדי לשטוף ביסודיות את עור המטופל באתר הדקירה.
כסו את נקודת הדקירה באמצעות סדין סטרילי מחורר (fenestrated drape). לאחר מכן, זהו את נקודת הדקירה דרך הסדין. בעזרת להב סקלפל מחודד, בצעו חתך דקירה קטן דרך העור בנקודת החתך.
חבר את הקנולה למחבר הלואר (luer-slip) של המזרק. לאחר מכן, הכנס את הקנולה דרך חתך הדקירה. במגרעת העליונה של מפרק הברך, כוון בזווית של 45 מעלות לכיוון הגבי (dorsal) והמדיאלי לעבר המגרעת, מתחת לקוטב העליון של הפיקה, והכנס את המחט לעומק של כ-5 cm.
שאבו את נוזל המפרק על ידי משיכת בוכנת המזרק. כדי למנוע היווצרות המטומה, החבישו את מקום החתך בבית חולה, ולאחר מכן גרשו אותו בתחבושת. השתמשו בחומר חיטוי אלכוהולי כדי לחטא את הממברנה של בקבק לתרבית דם פדיאטרית.
לאחר מכן, התקינו קנולה חדשה על המזרק והזריקו לתוך הבקבוק 1 עד 3 mL של נוזל מפרק שנשאב. ערבבו על ידי ניעור עדין או סיבוב. להכנת דגימה של שאיבת מפרק טבעית, הסירו את הקנולה מהמזרק.
לאחר מכן, פתחו מבחנה לאיסוף דם ללא תוספים והזריקו 1 mL של נוזל השאיבה אל תוך מבחנת האיסוף. החזירו והדקו את המכסה לצורך אנליזת PCR. העבירו 1 עד 4 mL של נוזל השאיבה מהמפרק אל מבחנה לאיסוף דם המכילה EDTA לצורך ספירת תאים ודיפרנציאציה.
הפשיקו את מבחנת התערובת הראשית (master mix) על ידי השארתה בטמפרטורת החדר. העבירו 180 mcL מהדגימה שנאספה אל מבחנת הדגימה. סגרו את מבחנת הדגימה באמצעות מכסה מבחנת הדגימה המכיל protein kinase K וגן בקרה פנימי לבקרת איכות של כל תהליך העבודה.
בתא הבקרה, פתח את תוכנת ההפעלה על ידי לחיצה על כפתור New Test בפינה השמאלית התחתונה. השתמש במסך המגע כדי להזין את נתוני המטופל או את מזהה הדגימה. כדי לבחור את הדגימה מהתפריט הנפתח, בחר תחילה ב-ITI Cartridge, לאחר מכן ב-Orthopedics כמצב יישום, ולבסוף בחר ב-Synovial Fluid או ב-Sonication Fluid כסוג הדגימה. לאחר מכן לחץ על כפתור Start.
סרקו את הברקוד בתחתית מבחנת הדגימה. לאחר מכן, הכניסו את מבחנת הדגימה לתוך ה-Lysator. בשלב הבא, בחרו את הדגימה במסך הבקרה (cockpit screen) כדי לשחרר את מבחנת הדגימה מה-Lysator.
לאחר מכן, הוצא את מבחנת הדגימה מה-Lysator וסגור את המכסה העליון של ה-Lysator. העבר את מבחנת הדגימה לתוך חריץ מבחנת הדגימה של מחסנית ה-PCR. לאחר מכן, הכנס את מבחנת ה-master mix שהופשרה לתוך חריץ ה-master mix של מחסנית ה-PCR.
פעלו לפי ההוראות על מסך הבקרה כדי לסרוק את מחסנית ה-PCR עם תערובת ה-master mix ושפחור הדגימה. הכניסו את מחסנית ה-PCR לתוך חריץ המחסנית המצוין במנתח. במסך המגע של מערכת הבקרה, בפינה השמאלית התחתונה, בחרו ב-Active Tests, ולאחר מכן בחרו את מזהה הדגימה הנכון כדי להציג את תוצאות הבדיקה.
שמרו את התוצאות בזיכרון המכשיר והדפיסו או ייצאו אותן לעיון נוסף. דברו עם המיקרוביולוג שלכם ועדכנו אותו בפרטי המקרה, כדי שיהיה מוכן לניתוח הדגימות ללא דיחוי. תחת מכסה מזרים אוויר למינרי, פתחו את המיכל הפלסטיסטי המכיל את הפרוטזה שהוצאה מחדר הניתוח, והוסיפו תמיסת sodium chloride סטרילית בריכוז 0.9% עד שהגוף הזר שהוצא מכוסה לפחות ב-80%. סגרו את המיכל הפלסטיסטי.
לאחר מכן, נערו או ערבבו היטב את המיכל פלסטיק במשך 30 שניות. העבירו את מיכל הפלסטיק לאמבט הסוניקציה. לאחר מכן, בדקו את מפלס הנוזל באמבט.
בצע סוניקציה לדגימה למשך חמש דקות, בתדר של 40 פלוס או מינוס 2 kilohertz ובצפיפות הספק של 0.22 פלוס או מינוס 0.04 watts per square centimeter. לאחר מכן, נער או בצע וורטקס יסודי לדגימה למשך 30 שניות. בתוך תא זרימה למינרית, אסוף 50 mL מנוזל הסוניקציה והעבר אותו לפראגון סטרילי לפני סגירה הדוקה של הפראגון.
כדי להכין נוזל סוניקציה רכז, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-4200 ×g למשך 10 דקות, עד להשארת נפח שארית של 10 mL, והשתמשו בפיפטה כדי להסיר את העלייה שנותרה. השעיקו מחדש את המשקע באמצעות פיפטור וערבוב בוורטקס. זרעו בכל בקבוק של מצע תרבית מתאים 0.5 mL של נוזל סוניקציה רכז.
יש להחדיר לבקבוק תרבית דם פדיאטרי 2 mL של נוזל סוניקציה רכז, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר מכן, יש להעביר 1 mL של נוזל סוניקציה רכז לשפרו sterility ללא תוספים לצורך אנליזת PCR. יש להעביר את מצע התרבית המוחדר לאינקובטור.
דגרו את התרביות למשך 14 ימים ובדקו את הצמיחה מדי יום. נוכחות של זיהום במפרק פרי-פרוטזה נחשבה למוכחת כאשר היה קיים קריטריון מרכזי אחד או לפחות שלושה מתוך חמישה קריטריונים משניים. קריטריונים מרכזיים כוללים נוכחות של פיסטולה או זיהוי של פתוגן בשתי דגימות מיקרוביולוגיות נפרדות.
קריטריונים משניים כוללים ספירת תאים חיובית או דיפרנציאציה חיובית של תאים בנוזל שנשאב מהמפרק, CRP חיובי ושיעור שקיעה חיובי בדגימות דם, היסטולוגיה חיובית בדגימות רקמה, או זיהוי של פתוגן בדגימה מיקרוביולוגית אחת בלבד. התוצאות כאן הראו רגישות מתונה עבור אבחון PCR של נוזל סוניקציה ונשוא מפרקי, אך סגוליות חזקה מאוד של 100%. בכל פעם ש-PCR הראה ממצא חיובי בנוזל שנשאב מהמפרק או בנוזל הסוניקציה, אותו פתוגן זוהה מאוחר יותר באחד התרביות המיקרוביולוגיות הקונבנציונליות. בדיקות PCR של דגימות שונות ממקרי אי-זיהום לא הראו תוצאות חיוביות שגויות.
שש מתוך 16 פתוגנים אמיתיים בדגימות נוזל הסוניקציה וחמישה מתוך 13 פתוגנים מתרבית נוזל המפרק לא זוהו בבדיקת PCR. האבחון המשולב ב-PCR של שני החומרים, השאיבה מהמפרק ונוזל הסוניקציה, זיהה נכון 12 מתוך 18 מקרי זיהום. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של הדרכים לשיפור נתיב האבחון שלכם בזיהום פרוטזה של מפרק.
ניתן לראות כיצד מיקרוביולוגים ומנתחים אורתופדיים חייבים לעבוד בשיתוף פעולה הדוק כדי לשפר את האבחנה המבדלת באופן מיטבי. אם הפעולה תבוצע נכון, תקבלו תוצאות בעלות ערך קליני מ-multiplex PCR מבוסס מחסירה בתוך חמש שעות לאחר שאיבת נוזל מהמפרק. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד באופן סטרילי לאורך כל התהליך.
אין לשכוח שעבודה עם דגימות רקמה אנושית או דגימות מיקרוביולוגיות עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד בכל אמצעי הזהירות, כגון ציוד הגנה אישי, בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה דן בחשיבותם של אבחנות מבדלות במקרי ארתרופלסטיקה כואבת, תוך התמקדות מיוחדת בשאיבת נוזל מהמפרק ובבדיקת multiplex polymerase chain reaction לזיהוי פתוגנים. שיטות אלו שואפות לספק תוצאות מיקרוביולוגיות מהירות ואמינות למנתחים אורתופדים המטפלים בחשד לזיהומים פרי-פרוטטיים במפרק.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- כירורגיה אורתופדית
- מיקרוביולוגיה
- אבחון זיהומים
רקע
- ארתרופלסטיקה כואבת דורשת אבחון מדויק לצורך טיפול יעיל.
- שאיבת נוזל מפרק היא הליך נפוץ לפני ניתוח.
- PCR מולטיפלקס וסוניקציה הם כלים מתהווים לגילוי פתוגנים.
- תוצאות מהירות עשויות להשפיע באופן משמעותי על החלטות טיפוליות.
מטרת המחקר
- לשיפור הדיוק האבחנתי במקרים של חשד לזיהומים פרי-פרוטזתיים במפרקים.
- לזירוז זיהוי הפתוגנים לצורך טיפול ממוקד.
- להערכת היעילות של שיטות שאיבת נוזל מפרקי וסוניקציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שאיבת נוזל מפרק שבוצעה בתנאים סטריליים.
- ניתוח Multiplex PCR של נוזל השאיבה מהמפרק ושל נוזל הסוניקציה.
- סוניקציה של תותבות שהוצאו מהגוף לצורך השגת פתוגנים.
- הערכה של קריטריונים אבחנתיים לזיהום מפרק סביב תותבת (peri-prosthetic joint infection).
תוצאות עיקריות
- הדגמה של רגישות בינונית של אבחון PCR לנוזל סוניקציה.
- זיהוי קריטריונים אבחנתיים מרכזיים לאישור זיהומים.
- הדגשת החשיבות של קבלת תוצאות מיקרוביולוגיות מהירות.
- מתן גישה מובנית עבור מנתחים אורתופדיים.
מסקנות
- שאיבת מפרק ו-multiplex PCR יעילים לאבחון מהיר.
- זיהוי מוקדם של פתוגנים יכול להוביל לטיפול בזמן.
- שיטות אלו משפרות את הניהול של זיהומים במפרקים פרוסטטיים (peri-prosthetic joint infections).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
אבחון מדויק ומהיר של זיהום סביב שתל מפרקי (PJI) הוא קריטי להכוונת התערבות טיפולית בזמן ולהפחתת נטל ניתוחי החלפת המפרק החוזרים. שילוב של סוניקציה של השתל עם multiplex PCR מציע גישה אבחנתית בעלת סגוליות גבוהה התומכת בזיהוי מוקדם של פתוגנים ובקבלת החלטות טיפוליות מושכלות. מתודולוגיה זו מגבירה את הביטחון האבחנתי במחקר ופיתוח אורתופדי על ידי אספקת תוצאות מיקרוביולוגיות הניתנות לשחזור, שניתן להשתמש בהן להערכת אסטרטגיות אנטי-מיקרוביאליות ומודלים של זיהומים הקשורים לשתלים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת נוכחות של פתוגנים בביופילמים הקשורים לאשתלים כדי לתקף מטרות של מחלות זיהומיות.
- ערך תפעולי: מספק שיטה סטנדרטית להשגת מיקרואורגניזמים בריכוז נמוך ממשטחי אשתלים לצורך מחקרים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות מבוססות Multiplex PCR מנוזל סוניקציה כדי לתמוך בסטנדרטיזציה ובשחזור של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות מהירות תוך חמש שעות, מה שמאפשר סריקה של תפוקה גבוהה (high-throughput) של תרכובות אנטימיקרוביאליות נגד פתוגנים רלוונטיים ל-PJI.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בפיתוח של מודלים של זיהום רלוונטיים למחלה באמצעות פרוטזות שהוצאו מהגוף כדי להעריך אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן.
- ערך תפעולי: מקל על דגימה אורכית והערכת עומס מיקרוביאלי במודלים פרה-קליניים של זיהום בשתלים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליך העבודה של אבחון זיהומים, החל מאיסוף הדגימה ועד לזיהוי הפתוגן, ומאפשרת מעבר חלק משאיבת נוזל מפרק לניתוח מולקולרי במסגרות פרה-קליניות ותרגומיות.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות בנוגע להיווצרות ביופילם ולהישרדות פתוגנים על פני השטחים של שתלים.
- סריקה: מאפשר הכנה סטנדרטית של נוזל סוניקציה לצורך בדיקות רגישות לאנטימיקרוביאליים עקביות.
- אנליטיקה: מספק תוצרי multiplex PCR המאפשרים זיהוי סימולטני של פתוגנים מרובים, ובכך משפר את הרזולוציה האבחנתית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ניתוח של שתלים שהוצאו במהלך ניתוח לבין תיקוף פרה-קליני של מודלי זיהום באמצעות השגה סטנדרטית של פתוגנים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לבדיקות של זיהומים הקשורים לשתלים במספר תוכניות מו"פ אורתופדיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ספציפיות גבוהה (100%) מפחיתה זיהויים שגויים (false-positive) של פתוגנים, ובכך מגבירה את הביטחון באימות המטרה ובמחקרים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: תהליכי עבודה סטנדרטיים של סוניקציה ו-PCR משפרים את השחזוריות בין מעבדות ואתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: זמן תגובה מהיר תומך בקבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) בתוכניות לפיתוח תרופות אנטימיקרוביאליות.
- השפעה על פורטפוליו הפיתוח: מאפשר קידום מועמדים מבוסס ניהול סיכונים, בהתבסס על נוכחות מאומתת של הפתוגן במודלים של זיהום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקה אספטית, שאיבת נוזל מפרקים והליכי סוניקציה.
- תלוי בגישה לאמבטיות סוניקציה, למבני זרימה למינרית ואנליזרים של PCR מבוססי מחסניות.
- מחייב תיאום רב-תחומי בין צוותי אורתופדיה, מיקרוביולוגיה ומו"פ לצורך טיפול בדגימות ופירוש התוצאות.
- התאמה לחומרי שתלים וסוגי מפרקים שונים עשויה לדרוש תיקוף של יעילות הסוניקציה.
- רגישות ה-PCR היא בינונית, מה שמחייב שימוש בשיטות תרבית משלימות לצורך זיהוי מקיף של פתוגנים.
