Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחשוף אסטרטגיות אלימות ומערכות פתוגנים מארחות על ידי זיהוי האינטראקציה של חלבון זדוני קנדידטוס פיטופלזמה עם חלבוני מארח מ- malus domestica. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי מחקר ביולוגיים רבים ושונים, והיא משמשת כאן במחקר צמחים כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מחלת התפשטות התפוחים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לסנן אפקטור פתוגן יחיד מול אלפי אינטראקטורים פוטנציאליים, מה שהופך שיטה זו לנקודת התחלה אפשרית בקלות בחקר זיהומים.

כדי להתחיל, זהה עצים נגועים עם תסמינים ספציפיים של Apple Proliferation ושלוט בעצים ללא תסמינים. בעזרת מזמרות נקיות חותכים דגימות שורש משלושה אתרים שונים של מערכת השורשים בקוטר של 0.5 1 ס"מ ואורך של כ -5 ס"מ. הנח את דגימות השורש בשקיות ניילון עם תווית מספקת.

לאחר מכן מניחים את הדגימות בקופסה קרה עם אריזות תרמיות צוננות ומאחסנים אותן בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. שוטפים את דגימות השורש במים כדי להסיר את האדמה. לאחר מכן העבירו את הדגימות לצלחת פטרי סטרילית והשתמשו באזמל מעוקר כדי להסיר את שורש האפידרמיס וקליפת המוח.

בעזרת ממחטת נייר נקייה ונטולת מוך, נגב את האזמל. לאחר מכן טובלים את המכשיר באתנול 70% ומעקרים אותו בחום על להבה פתוחה. השתמש באזמל כדי לגרד את הפלום.

קוצצים את הדגימה לחתיכות קטנות ומכניסים 30-100 מיליגרם מהחתיכות לצינור תגובה סטרילי של שני מיליליטר. אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס או השתמש בהן מיד כדי לבודד DNA, המשמש כתבנית להגברת גן האפקטור ושיבוט לאחר מכן של האפקטור לתוך וקטור הפיתיון. לאחר בידוד DNA פוליספציפי של פיטופלזמה מעצים נגועים, שיבוט לווקטורים של פיתיון ובדיקתו להפעלה עצמית וביטוי על פי פרוטוקול הטקסט.

פס פלקס אפקטור ATP 00189 הפך את NMY51 לצלחת SD-trp טרייה ותרבית אותו ב-30 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה עד להופעת מושבות אדומות. השתמש במושבה אדומה מצלחת האגר כדי לחסן שלושה מיליליטר של מדיום SD-trp בבקבוק טלטול קטן ודגירה על התרבית למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-120-150 סיבובים לדקה. למחרת, עם מיליליטר אחד של תרבית הלילה, חסנו 20 מיליליטר של SD-trp בבקבוק רועד ותנו לו לגדול במשך שמונה שעות.

השתמש במדיום SD-trp כדי להתאים את התרבית ל-OD600 של 0.2, ועם עשרה מיליליטר מהתרבית, חסן שתי צלוחיות המכילות 100 מיליליטר כל אחת של מדיום SD-trp. דגרו על התרביות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך הלילה. לאחר מכן, מדוד את ה-OD600 של התרבית והגלולה 120 יחידות OD600.

לדוגמה, אם נמדד OD600 של 1.2, סובב 100 מיליליטר של דגימה, השליך את הסופרנטנט והשתמש ב-800 מיליליטר של 2xYPAD מחומם מראש כדי להשעות את הגלולה לשתי צלוחיות שייקר ולדגור ב-30 מעלות צלזיוס. דגרו על תרבות השמרים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-120-150 סיבובים לדקה. מדוד את ה-OD600 בערך כל 1.5 שעות לפי פרוטוקול הטקסט עד שמגיעים ל-OD600 של 0.6.

לאחר הכנת DNA של זרע סלמון, Te Lithium OAc ו- PEG Lithium OAc על פי פרוטוקול הטקסט, צנטריפוגה 800 מיליליטר של תרבית שמרים ב 700 x G למשך חמש דקות כדי לגלול את התאים. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הכדורים בסך הכל 200 מיליליטר מים סטריליים מזוקקים כפולים. לאחר מכן גלול שוב את התאים והשליך את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הגלולה ב-16 מיליליטר של תערובת Te Lithium OAc וסובבו שוב את הדגימה. לאחר מכן לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש ב-9.6 מיליליטר של Te Lithium OAc כדי להשעות מחדש את הגלולה. בכלי תגובה בגודל מתאים, הכינו שנים עשר בקבוקונים עם שבעה מיקרוגרם של שיא הוסף וקטור ספריית DNA HAC, 100 מיקרוליטר של 2% DNA זרע סלמון ו-2.5 מיליליטר של תערובת PEG Lithium OAc.

הוסף 600 מיקרוליטר מתרחיף תאי השמרים שהוכן בעבר לכל אחד משנים עשר הבקבוקונים וערבב במרץ במשך דקה אחת. לאחר מכן דגרו את התגובות באמבט מים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות תוך ערבוב כל 15 דקות. לאחר מכן, הוסף 160 מיקרוליטר DMSO לכל בקבוקון וערבב במרץ.

לאחר מכן דגרו את הבקבוקונים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות נוספות. לאחר הטלת התאים, השליכו את הסופרנטנט והשתמשו בשלושה מיליליטר של 2xYPAD כדי להשעות מחדש כל כדור. אסוף את התאים מכל שנים עשר הבקבוקונים בבקבוק שייקר של 100 מיליליטר ודגירה על השמרים למשך 90 דקות ב-30 מעלות צלזיוס ו-120 סיבובים לדקה.

לאחר הדגירה, לאחר הטלת התאים והשלכת הסופרנטנט, השתמש בפיפטה סרולוגית של עשרה מיליליטר ו-4.5 מיליליטר של נתרן כלורי סטרילי של 0.9% כדי להשעות מחדש את הגלולה ביסודיות על ידי פיפטינג זהיר למעלה ולמטה. משוך 50 מיקרוליטר מהתרחיף והשתמש ב-0.9% נתרן כלורי להכנת דילולים פי עשרה מ-1:10 עד 1:1000. לאחר מכן צלחת 100 מיקרוליטר מכל דילול על צלחות פטרי 90 מילימטר המכילות אגר SD-trp-leu

מורחים את שאר מתלי השמרים הלא מדוללים על צלחות פטרי בקוטר 16x150 מילימטר עם אגר SD-trp-leu-His-ade. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים עבור צלחות SD-trp-leu ולמשך ארבעה ימים עבור צלחות SD-trp-leu-his-ade. קבע את יעילות הטרנספקציה על ידי ספירת המושבות של הדילולים הסדרתיים השונים על לוחות הבחירה SD-trp-leu.

העבירו כל שיבוט באמצעות קצה פיפטה סטרילי כדי לבחור ולפספס את המושבה על צלחות סלקטיביות טריות SD-trp-leu-his-ade. דגרו את הצלחות בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. חזור על העברת השיבוטים כל יום עד שמגיעים לחמישה מעברים.

כדי לנתח שיבוטים, מתחת למכסה מנוע סטרילי, הכינו צינור תגובה סטרילי אחד של שני מיליליטר עם מיליליטר אחד של SD-trp-leu-his-ade עבור כל שיבוט. השתמש במחט חמה כדי לנקב חור בכל צינור והשתמש בסילר חדיר גז כדי לכסות את החור. יש לחסן כל בקבוקון בחומר מושבה טרי משיבוט אחד ולדגור את הבקבוקונים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-150 סיבובים לדקה למשך 24 שעות.

לאחר הטלת התאים והשלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הכדור במאגר המתאים והעבירו אותו לצינור תגובה טרי של שני מיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטר חרוזי זכוכית שטופים בחומצה למתלה וערבב את הצינור במרץ במשך חמש דקות. לבסוף, טהר את ה- DNA של הפלסמיד על פי פרוטוקול הטקסט.

סיכום התוצאות הצפויות של בדיקת ההפעלה העצמית והפרשנות שלהן מסופק בטבלה ובאיור זה. הפעלה עצמית חלשה מובילה לצמיחה על צלחות בחירה מדוללות trp-leu-his-ade. בעוד ששמרים שעברו טרנספורמציה עם פיתיון חזק להפעלה עצמית יצמחו על trp-leu-his-ade חסר מדיום.

טרנספורמציה משותפת מוצלחת של פיתיון ונטרף מאופיינת בצמיחה על צלחות סלקטיביות חסרות trp ו-leu. אינטראקציה של הפיתיון וחלבון הטרף מובילה להשלמה של האוקסיטרופיה שלו ושל ה-ade של NMY51 מוצגת כאן דוגמה לאינטראקציה בין פיתיון לטרף בניסוי היברידי של שמרים 2. שותפי האינטראקציה המארחים malus domestica, MdTCP24 ו-MdTCP25 זוהו והאינטראקציה אושרה על ידי טרנספורמציה של חרוט denovo עם האפקטור.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את היברידית השמרים 2 ביום אחד אם כל הציוד והחומרים הדרושים, במיוחד השמרים, מוכנים כראוי מראש. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להימנע מזיהום ולעבוד תמיד בתנאים סטריליים. בעקבות הליך זה, יש לבצע שיטה עצמאית נוספת כמו השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית למשל, כדי לאשר את האינטראקציות בין חלבון לחלבון שנמצאו.

זה חשוב במיוחד מכיוון שהשמרים או ההיברידיים כשלעצמם מועדים יחסית ליצירת תוצאות חיוביות כוזבות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי מחקר רבים ושונים להבין טוב יותר את העקרונות המולקולריים הכרוכים באינטראקציות חלבון-חלבון, במיוחד באינטראקציות מארח-פתוגן, ותחומי מחקר ביולוגיים רבים אחרים. יתר על כן, תבינו שביצוע שיטה זו אפשרי בקלות בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית מאובזרת כהלכה.

אל תשכח שעבודה עם כימיקלים מסוימים, אזמלים ולהבות פתוחות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן בעת ביצוע הליך זה, אתה תמיד צריך לשקול אמצעי זהירות מסוימים. זה אומר להשתמש בציוד הבטיחות האישי שלך כמו כפפות ומשקפי מגן, ולהשתמש בציוד הבטיחות הכללי של המעבדה.