Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להבין אסטרטגיות של virulent ומערכות של פתוגן ומאחס על ידי זיהוי האינטראקציה של חלבון malefactor של candidatus phytoplasma עם חלבוני מאחס מ-malus domestica. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי מחקר ביולוגיים שונים, ובמקרה זה היא משמשת במחקר צמחים כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מחלת ה-Apple Proliferation. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לסרוק effector בודד של פתוגן מול אלפי אינטראקטורים פוטנציאליים, מה שהופך שיטה זו לנקודת התחלה ישימה וקלה למחקר זיהומים.

ראשית, זהו עצים נגועים בעל תסמינים ספציפיים של Apple Proliferation ועצים בקבוצת ביקורת שאינם מראים תסמינים. באמצעות מזמרה נקייה, גזרו דגימות שורש משלושה אתרים שונים של מערכת השורשים, בעלות קוטר של 0.5 1 cm ואורך של כ-5 cm. הניחו את דגימות השורש בתוך שקיות פלסטיק מסומנות כראוי.

לאחר מכן, הניחו את הדגימות בתיבה קרה עם קרחומים ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4 °C עד לעיבוד נוסף. שטפו את דגימות השורש במים כדי להסיר את האדמה. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לצחנת פטרי סטרילית והשתמשו בסכין מנתח (scalpel) שעברה סטריליזציה כדי להסיר את האפידרמיס של השורש ואת הקורטקס.

נגב את הסקלפל באמצעות טישיו נקי וללא סיבים. לאחר מכן, טבול את המכשיר ב-70% ethanol וסטריליז אותו בחום מעל להבה גלויה. השתמש בסקלפל כדי לגרד את הפלואם.

קטע את הדגימה לחתיכות קטנות והעבר מנה של 30-100 מיליגרם מהחתיכות למבחנת תגובה סטרילית של שני מיליליטר. אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס או השתמש בהן באופן מיידי לבידוד DNA, המשמש כתבנית להגברה של גן האפקטור ולשיבוט מאוחר יותר של האפקטור אל תוך וקטור הפיתיון. לאחר בידוד DNA פוליספציפי של פיתופלסמה מעצים נגועים, בצע שיבוט לתוך וקטורי פיתיון ובחן אותם לאקטיבציה עצמית וביטוי בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

בצעו מריחה של plex A ATP 00189 effector שהועבר ל-NMY51 על פלטת SD-trp טרייה, וגדלו אותה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך יומיים עד שלושה ימים עד להופעת מושבות אדומות. השתמשו במושבה אדומה מפלטת האגר כדי להחדיר תרבית לשלושה milliliters של מצע SD-trp בבקבוק ניעור קטן, ודגרו את התרבית למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ניעור ב-120-150 rotations per minute. למחרת, בעזרת one milliliter מהתרבית של הלילה, החדירו תרבית ל-20 milliliters של SD-trp בבקבוק ניעור והניחו לה לגדול במשך שמונה שעות.

השתמש במצע SD-trp כדי להביא את התרבית ל-OD600 של 0.2, وباמצעות עשרה מיליליטר של התרבית, חדיש שני בקבוקים המכילים כל אחד 100 מיליליטר של מצע SD-trp. דגרו את התרביות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ניעור למשך לילה. לאחר מכן, מדדו את ה-OD600 של התרבית והשקיעו 120 יחידות OD600.

לדוגמה, אם נמדד OD600 של 1.2, יש לסובב במרכזפוגה 100 milliliters של דגימה, להסיר את הנוזל העליון, ולהשתמש ב-800 milliliters של 2xYPAD שחומם מראש כדי לערבב מחדש את המשקע בשני בקבוקי שייקר ולהדגיר בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. יש להדגיר את תרבית השמרים בטמפרטורה של 30 degrees Celsius ובמהירות של 120-150 rotations per minute. יש למדוד את ה-OD600 בערך כל 1.5 hours בהתאם לפרוטוקול הכתוב עד להגעה ל-OD600 של 0.6.

לאחר הכנת DNA מזרה של סלמון, Te Lithium OAc ו-PEG Lithium OAc בהתאם לפרוטוקול הכתוב, סבב במערבל צנטריפוגה 800 מיליליטר של תרבית שמרים ב-700 x G למשך חמש דקות כדי להשקיע את התאים. הסר את הנוזל העליון (supernatant) וערבב מחדש את המשקעים בתוך סך של 200 מיליליטר של מים מזוקקים כפולה סטריליים. לאחר מכן, השקע את התאים שוב והשלך את הנוזל העליון.

יש להשעות מחדש את המשקע ב-16 milliliters של תערובת Te Lithium OAc ולסבב את הדגימה שוב בcenterY. לאחר השלכת הנוזל העליון, השתמש ב-9.6 milliliters של Te Lithium OAc להשעיה מחדש של המשקע. בכלי תגובה בגודל מתאים, הכן שתים-עשרה מבחנות המכילות שבע micrograms של וקטור ספריית DNA מסוג peak Add HAC, 100 microliters של 2% salmon sperm DNA, ו-2.5 milliliters של תערובת PEG Lithium OAc.

הוסיפו 600 µL מת сусפנזיית תאי השמרים שהוכנה קודם לכן לכל אחד משנים עשר המבחנות וערבבו בעוצמה במשך דקה אחת. לאחר מכן, דגרו את התגובות במקלח מים בטמפרטורה של 30 °C למשך 45 דקות, תוך ערבוב כל 15 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 160 µL של DMSO לכל מבחנה וערבבו בעוצמה.

לאחר מכן, דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 42 °C למשך 20 דקות נוספות. לאחר השקעת התאים, השליכו את הנוזל העליון והשתמשו ב-3 mL של 2xYPAD כדי להשעות מחדש כל משקע. רכזו את התאים מכל אחת משתים עשרה המבחנות בבקבוק שייקר של 100 mL ודגרו את השמרים למשך 90 דקות בטמפרטורה של 30 °C ובמהירות של 120 rpm.

בעקבות הדגירה, לאחר שקיעת התאים והסרת הנוזל העליון (supernatant), השתמש בפיפט סרולוגי של עשרה מיליליטר וב-4.5 milliliters של 0.9%sodium chloride סטרילי כדי לערבב מחדש את המשקע ביסודיות על ידי פיפוט עדין מעלה ומטה. הוצא 50 microliters מהתמיסה והשתמש ב-0.9%sodium chloride להכנת דילול עשירתי מ-1:10 ועד 1:1000. לאחר מכן, פזר 100 microliters מכל דילול על צלחות פטרי של 90 millimeter המכילות מצע agar מסוג SD-trp-leu.

פזרו את שאר תרחיף השמרים ללא הדילול על 16 צלחות פטרי בקוטר 150 מילימטר עם אגר SD-trp-leu-His-ade. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך שלושה ימים עבור צלחות ה-SD-trp-leu ולמשך ארבעה ימים עבור צלחות ה-SD-trp-leu-his-ade. קבעו את יעילות הטרנספקציה על ידי ספירת המושבות של הדילולות הסדרתיות השונות על צלחות הברירה SD-trp-leu.

העבירו כל שיבט באמצעות טיפ פטה סטרילי על ידי הרמת המושבה ומריחתה על מצעי בחירה טריים מסוג SD-trp-leu-his-ade. דגרו את המצעים בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 24 שעות. חזרו על העברת השיבטים מדי יום עד להגעה לחמישה מעברים בסך הכל.

כדי לנתח שיבוטים, הכין תחת מנדף סטרילי מבחנת תגובה סטרילית אחת בנפח 2 ml המכילה 1 ml של SD-trp-leu-his-ade עבור כל שיבוט. השתמש במחט לוהטת כדי ליצור חור בכל מבחנה, וכסה את החור באמצעות סוגר חדיר לגזים. הזריק לכל מבחנה חומר טרי מקולוניה של שיבוט אחד, והדגר את המבחנות בטמפרטורה של 30 °C ובמהירות של 150 rpm למשך 24 שעות.

לאחר השקעת התאים והסרת הנוזל העליון (supernatant), השביה מחדש את המשקע בבופר המתאים והעבר אותו למבחנת תגובה נקייה של 2 mL. הוסף לתמיסה 100 µL של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה וערבב את המבחנה בעוצמה במשך חמש דקות. לבסוף, טהר את ה-plasmid DNA בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

סיכום של התוצאות הצפויות של בדיקת ההפעלה העצמית (self-activation assay) והפרשנות שלהן מופיעים בטבלה ובאיור זה. הפעלה עצמית חלשה מובילה לצמיחה על מצעי ברירה דלילי ב-trp-leu-his, אך לא על מצעים דליליים ב-trp-leu-his-ade. לעומת זאת, שמרים שעברו טרנספורמציה עם פיתיון (bait) בעל הפעלה עצמית חזקה יצמחו על מצע חסר trp-leu-his-ade.

טרנספורמציה משותפת מוצלחת של ה-bait וה-prey מאופיינת בצמיחה על מצעים סלקטיביים החסרים trp ו-leu. אינטראקציה בין חלבון ה-bait לחלבון ה-prey מובילה להשלמה (complementation) של ה-oxytrophy של his ו-ade ב-NMY51. מוצג כאן דוגמה לאינטראקציה בין bait ל-prey בניסוי Yeast 2 Hybrid. שותפיו לאינטראקציה של המארח malus domestica,‏ MdTCP24 ו-MdTCP25, זוהו והאינטראקציה אוששה באמצעות טרנספורמציית cone de novo עם האפקטור.

ברגע שהשיטה נלמדת היטב, ניתן לבצע את בדיקת ה-2 hybrid בשמרים ביום אחד, במידה וכל הציוד והחומרים הדרושים, ובמיוחד השמרים, הוכנו כראוי מראש. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להימנע מזיהומים ולעבוד תמיד בתנאים סטריליים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, יש לבצע שיטה עצמאית נוספת, כגון bimolecular fluorescence complementation לדוגמה, כדי לאשש את אינטראקציות החלבון-חלבון שנמצאו.

דבר זה חשוב במיוחד מכיוון שהשמרים או ההיבריד כשלעצמם נוטים יחסית להניב תוצאות חיוביות שגויות. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי מחקר רבים ושונים להבנה טובה יותר של העקרונות המולקולריים המעורבים באינטראקציות בין חלבונים, במיוחד באינטראקציות בין מאחס לפתוגן, ובתחומי מחקר ביולוגיים רבים אחרים. יתרה מכך, תבינו כי ביצוע שיטה זו הוא ברך והשגה בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית המצוידת כראוי.

זכרו כי עבודה עם כימיקלים מסוימים, סכיני ניתוח ולהבות גלויות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן בעת ביצוע פרוצדורה זו, עליכם תמיד להקפיד על אמצעי זהירות מסוימים. המשמעות היא שיש להשתמש בציוד מגן אישי כגון כפפות ומשקפי מגן, ולהשתמש בציוד הבטיחות הכללי של המעבדה.