Name: סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למד שיטת סינתזה של 1,2-azaborines והכנת קומפלקסי חלבון עם מוטאנטים ליזוזים T4. טכניקה זו מספקת סינתזה אמינה של תרכובות בורון ליישומים ביורפואיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIGMS (R01-GM094541) ומכללת בוסטון.

<ol><li>Ducruix, A., Giége, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDucruix%2C+A+%22Crystallization+of+Nucleic+Acids+and+Proteins%2C+A+Practical+Approach%22">Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach</a>. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).</li>
<li>Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v08-110#.WLBilzsrLIU">B-N as a C-C substitute in aromatic systems.</a> Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).</li>
<li>Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644658">Recent Advances in Azaborine Chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).</li>
<li>Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25469827">Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties.</a> Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).</li>
<li>Zhou, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+isomerism%3A+a+boron-nitrogen+surrogate+for+a+carbon-carbon+double+bond+increases+the+chemical+diversity+of+estrogen+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands.</a> Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).</li>
<li>Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+binding+property+of+isoelectronic+analogues+of+nucleobases%2C+B%286%29-substituted+5-aza-6-borauracils+and+-thymines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines.</a> Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).</li>
<li>Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BN%2FCC+isosterism+in+borazaronaphthalenes+towards+phosphodiesterase+10A+%28PDE10A%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).</li>
<li>Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzazaborinines+as+Novel+Bioisosteric+Replacements+of+Naphthalene%3A+Propranolol+as+an+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example.</a> J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).</li>
<li>Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01060a034">New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).</li>
<li>White, D. G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00905a022">2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).</li>
<li>Ashe III, A. J., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthesis+of+Aromatic+Five-+and+Six-Membered+B%E2%88%92N+Heterocycles+via+Ring+Closing+Metathesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis.</a> Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).</li>
<li>Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hybrid+Organic%2FInorganic+Benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Hybrid Organic/Inorganic Benzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).</li>
<li>Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+Group-Free+Synthesis+of+1%2C2-Azaborines%3A+A+Simple+Approach+to+the+Construction+of+BN-Benzenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).</li>
<li>Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodium-catalyzed+boron+arylation+of+1%2C2-azaborines%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).</li>
<li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond%3A+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1%2C2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li>
<li>Knack, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355270">BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).</li>
<li>Eriksson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+a+Protein+Structure+to+Cavity-Creating+Mutations+and+Its+Relation+to+the+Hydrophobic+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect.</a> Science. 255 (5041), 178-183 (1992).</li>
<li>Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cavity-containing+mutant+of+T4+lysozyme+is+stabilized+by+buried+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene.</a> Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).</li>
<li>Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+Origins+of+Specificity+of+Ligand+Binding+in+an+Interior+Nonpolar+Cavity+of+T4+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme.</a> Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).</li>
<li>Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+Binding+Site+for+Testing+Scoring+Functions+in+Molecular+Docking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking.</a> J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).</li>
<li>Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Bonding+of+1%2C2-Azaborines+in+the+Binding+Cavity+of+T4+Lysozyme+Mutants%3A+Structures+and+Thermodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics.</a> J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).</li>
<li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280707532_Organoboranes_43_A_convenient_highly_efficient_synthesis_of_triorganylboranes_via_a_modified_organometallic_route">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li>
</ol>

כל המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים בכתב יד זה.

בחלקו הראשון של פרוטוקול זה, תארנו סינתזה שונה של 1,2-azaborines מבוסס על שיטות שדווחו בעבר 12, 13. Triallylborane 22 שימש כתחליף המסלולים באמצעות allyltriphenyl allyltrifluoroborate פח או אשלגן להכין N -allyl- N adduct כלוריד -allyl -TBS- B (1). שיטה זו מאפשרת גישה אטומה-חסכונית וידידותית לסביבה יותר. לסינתזה של N -TBS- B -Cl-1,2-azabori...

בורון-חנקן המכיל heterocycles (כלומר 1,2-azaborines) משך תשומת לב משמעותית לאחרונה isosteres של ארנס. Isosterism זה יכול להוביל גיוון של מוטיבים מבניים קיימים כדי להרחיב את השטח הכימי 2, 3, 4. יש Azaborines שירות פוטנציאל היישום במחקר ביו 5, 6, 7, 8, במיוחד בתחום של כימיה רפואית שבה כימאים לבצע סינתזה של ספריות של מבנית ומולקולות רלוונטיות מבחינה תפקודית. ראוי לציין, עם זאת, בעוד ישנם מסלולים סינטטיים מפותחים רבים למולקולות arene המכיל זמינות, רק מספר מצומצם של שיטות לסינתזה של azaborines דווח 9, 10, </sעד&gt; 11, 12, 13. זאת בעיקר בשל מספר מצומצם של אפשרויות עבור מקור בורון ואת האוויר והטבע רגיש לחות של המולקולה בשלב המוקדם של רצף סינטטי. בחלקו הראשון של מאמר זה, נתאר סינתזה סולם רב-גרם של N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) תוך שימוש בטכניקות אוויר ללא תקן. תרכובת זו משמשת ביניים צדדיים שיכול להיות פונקציונלי נוסף למולקולות מורכבות יותר מבחינה מבנית 14, 15. החל מ 3, סינתזה וטיהור N -H- B -ethyl-1,2-azaborine (5) לשימוש במחקרים חלבון מחייב יתוארו. בשל התנודתיות של 5, הבידוד היעיל שלה דורש שליטה מדויקת של טמפרטורת תגובה, זמן, distillation תנאים. בחלק השני, פרוטוקולים עבור ביטוי חלבון ובידוד של מוטציות ליזוזים T4 (L99A ו L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 יוצגו, ואחריו התגבשות חלבון והכנת מתחמי קריסטל חלבון-ליגנד. מוטציות ליזוזים T4 L99A ו L99A / M102Q נבחרו כמערכות מודל ביולוגי לבחון את יכולת מליטה המימן של NH המכיל מולקולות azaborine 17. באמצעות פרוטוקול ביולוגיה מולקולרית סטנדרטי, החלבון מתבטא המתח Escherichia coli RR1 המושרה עם איזופרופיל- β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). טיהור חלבון מתבצעת באמצעות כרומטוגרפיה טור-חילוף יונים. התגבשות חלבון מתבצעת עם פתרון חלבון מטוהר מרוכז מאוד (&gt; טוהר 95% על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה) באמצעות התלייהטיפת שיטת דיפוזיה אדי. בשל הרגישות של ליגנדים של מחקר זה לחמצן, המתחמים ליגנד החלבון מוכנים בתנאי אוויר חינם.

<table><tbody><tr><td>טטרהידרופוראן (THF), ללא מעכבים, עבור HPLC, &ge; 99.9%</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>אתר דיאתיל (Et2O), עבור HPLC, &ge; 99.9%, ללא מעכבים</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כלוריד&nbsp; (CH2Cl2), (ACS מיוצב/מוסמך)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>טולואן</td><td></td><td>פישר T290-4</td><td></td></tr><tr><td>פנטן, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>פישר</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>סידן הידריד (CaH2), דרגת ריאגנט, 95%</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>208027</td><td>פלדיום פירופורי</td></tr><tr><td>על פחם פעיל (Pd/C), 10 wt% Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת בורון טריכלוריד 1.0 M בהקסאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>211249</td><td>טריאתילאמין רעיל/פירופורי מאוד</td></tr><tr><td>, &ge; 99.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st generation זרז&nbsp;</td><td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>אצטמיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-בוטנול, נטול מים, 99.8%</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אתיליתיום, 0.5&nbsp; M בבנזן/ציקלוהקסאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>561452</td> תמיסת HCl <td>רעילה מאוד/פירופורית</td></tr><tr><td>, 2.0 מ' ב-Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-מתילבוטן, נטול מים, &ge; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4 lysozyme WT* (L99A)</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 מוטציה ליזוזים (S38D, L99A, M102Q N144D)</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr>, <tr><td>מלח נתרן אמפיצילין</td><td>, סיגמא אולדריץ'</td>, <td>A0166</td><td></td></tr>, <tr><td>איזופרופיל-ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט חד בסיסי נטול מים</td><td>פישר</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים</td><td>פישר</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic חומצה</td><td>פישר</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>קורוזיבי</td></tr><tr><td>תרמו מדעי פירס DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE בריאות&nbsp; Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>רעיל מאוד</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>פישר</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סרטוריוס&nbsp; Vivaspin 20 רכזים צנטריפוגליים</td><td>פישר</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-הידרוקסיאתיל דיסולפיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paratone&nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC צינורות ממברנת דיאליזה 12,000 עד 14,000 דלטון MWCO&nbsp;</td><td>פישר</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; </td> צינורות קריוגניים של <td>CryoLoop Hampton Research</td><td></td><td>בצורת לולאה</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>מלקחיים קריוגניים</td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>תמונות צפיפות אלקטרונים נוצרות מהתוכנה</td></tr></tbody></table>

סינתזה של 1,2-azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים t4

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

אנו מתארים סינתזה כללית של 1,2-אזבורינים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות נטולות אוויר והכנת קומפלקס חלבונים עם מוטציות ליזוזים T4 על ידי דיפוזיה של אדים. תרכובות רגישות לחמצן ולחות מוכנות ומבודדות תחת אטמוספירה אינרטית (N2) באמצעות סעפת גז ואקום או תא כפפות. כדוגמה לסינתזה של אזבורין, אנו מדגימים את הסינתזה והטיהור של ה-N-H-B-ethyl-1,2-azaborine הנדיף על ידי רצף בן חמישה שלבים הכולל זיקוק וכרומטוגרפיה של עמודות לבידוד מוצרים. מוטציות ליזוזים T4 L99A ו-L99A/M102Q באות לידי ביטוי בזן Escherichia coli RR1. פרוטוקולים סטנדרטיים לליזה של תאים כימיים ואחריהם טיהור באמצעות עמודת חילופי יונים קרבוקסימתיל מעניקים חלבון בעל טוהר גבוה מספיק להתגבשות. התגבשות החלבון מתבצעת בריכוזים שונים של משקעים בטווחי pH שונים בשיטת דיפוזיה של אדי טיפה תלויה. הכנה מורכבת עם המולקולות הקטנות מתבצעת בשיטת דיפוזיה של אדים תחת אטמוספירה אינרטית. ניתוח עקיפה של קרני רנטגן של קומפלקס הגביש מספק ראיות מבניות חד משמעיות לאינטראקציות קשירה בין אתר קשירת החלבון ל-1,2-אזבורינים.

המסלול סינתטי סכמטי עבור 1,2-azaborines מוצג באיור 1. פרוטוקול זה חל על סינתזה של חמש מולקולות המכילות חנקן בורון שונים. איור 2 מייצג 11 ספקטרום B התמ&quot;ג נמדד במהלך הצעד 1.3 לפקח על היווצרות של המוצר הרצוי (3). טיהור חלבון בוצעה באמצעות מערכת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך ו הכרומתוגרמה נציג מוצגת באיור 3. הטוהר של השברים שנאספו נקבע על ידי SDS-PAGE. קריסטלים של L99A מוטציה ל...

מוצג פרוטוקול לסינתזה של 1,2-אזבורינים והכנת קומפלקסי החלבון שלהם עם מוטציות ליזוזים T4.

סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה כללית לסינתזה של 1, 2-Azaborines, ואת יישומה הפוטנציאלי במחקר ביו-רפואי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מראה סינתזה ודאית של תרכובות 1, 2-azaborine, שהן איזוסטרים המכילים בורון הממזגים את מוטיב הבנזן הנפוץ. ניתן לבצע פונקציונליזציה נוספת של הפרקורור המתואר למולקולות פוטנציאליות מורכבות יותר.הכנת קומפלקסים של חלבונים עם 1, 2-azaborine תספק תובנות לגבי יישומים עתידיים במחקר ביו-רפואי. כדי להתחיל בהליך זה, הכין את תוצר סגירת הטבעת כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 14 גרם של פלדיום על פחמן לתוצר שהוכן זה בטולואן.לאחר מכן, הוצא את הבקבוק מהקופסה. חבר לבקבוק קונדנסור רפלקס 24/40 שעבר ייבוש בתנור, נוקה בחנקן וחובר למים קרים. הנח את הבקבוק באמבט שמן, וחמם את התגובה לרפלקס נמרץ ב-135 degrees celsius תוך כדי ערבוב.שמרו את התגובה בריפלקס למשך 16 שעות. לאחר מכן, הוציאו את הבקבוק מאמבט השמן כדי לצנן את התגובה לטמפרטורת החדר. לאחר שהתגובה התקררה, החליפו את קונדנסור הריפלקס בספטום על בקבוק התגובה.באמצעות מזרק המצויד במחט Luer Lock שעברה ייבוש בתנור, שאבו מנה של 5 milliliter. העבירו את המנה לנבובת NMR עם פקק הברגה. נתחו את הדגימה באמצעות Boron-11 NMR.אם התגובה אינה שלמה, העבירו את בקבוק התגובה לתא כפפות (glove box). לאחר מכן, הוסיפו שלושה גרמים נוספים של פלדיום על פחם. לבסוף, הוציאו את הבקבוק מתא הכפפות.חברו לבקבוק מקטורת רפלקס 24/40 שנוקתה בחנקן ושמחוברת למים קרים. באמצעות אמבט שמן, חממו את התגובה לרפלקס נמרץ בטמפרטורה של 135 °C תוך כדי ערבוב למשך 24 שעות. השתמשו ב-Boron-11 NMR כדי לנתח מנה נוספת ולוודא שהתגובה הושלמה.לאחר מכן, העבירו את בקבוק התגובה חזרה לתא הכפפות. העבירו את תערובת התגובה דרך עמודת כרומטוגרפיה מהירה (flash chromatography) ארוזה בנייר סופג. לאחר מכן, אספו את התסנן לבקבוק עגול תחתון בנפח של 1 liter המצויד במגנט ערבוב.שטפו את העמודה עם 50 milliliters של toluene. הוציאו את כלי התסנין מתיבת הכפפות וחברו אותו למניפולד גז בוואקום המצויד בקו חנקן. הניחו אמבט מים מתחת לבקבוק, וכלול דואר (dewar) המכיל חנקן נוזלי ללכידת הממס.פתח את שסתום הוואקום הגבוה כדי להתחיל בהסרת כל החומרים הנדיפים מהתסנין. לאחר מכן, החזר את תערובת התגובה לתא הכפפות. העבר את התערובת לבקבוק בעל תחתית עגולה בנפח 250 milliliter עם פתח 24/40, שיובש בתנור, ובתוכו מוט ערבוב.שטפו את שאריות תערובת התגובה בעזרת dichloromethane, והעבירו אותן אל הבקבוק. אטמו את הבקבוק באמצעות septum. העבירו את הבקבוק מתיבת הכפפות (glove box) אל סבון הוואקום (vacuum manifold), וחברו אותו.פתח את שסתום הוואקום הגבוה כדי להסיר את שאריות הממס. לאחר מכן, הסר במהירות את הספטום והוסף סידן הידריד באמצעות סקופולה. חבר את הבקבוק עגול התחתית למערכת הזיקוק המפורטת בפרוטוקול הטקסט, והגדר את טמפרטורת אמבט השמן ל-100 °C.לאחר סיום הזיקוק, הסר את מקור החום וקרר את המערכת לטמפרטורת החדר. החזר את הלחץ למערכת המקוררת באמצעות חנקן, וסגור היטב את שסתומי הפקק של בקבוק האחסון נטול האוויר. לאחר העברת המוצר המבודד מהבקבוק למבחנה בתוך תא כפפות, אחסן את המבחנה במקפיא של תא הכפפות.לאחר טיהור החלבון, העבירו את התמיסה המטוהרת לתוך צינורית ממברנת דיאליזה. הניחו את צינורית הדיאליזה בתוך מיכל המכיל תמיסה של ארבעה ליטרים של 100 millimolar sodium phosphate, 550 millimolar sodium chloride ו-02% sodium azide. ערבבו למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.ביום למחרת, הוסיפו 2-mercaptoethanol לדגימה שעברה דיאליזה, כך שהריכוז הסופי יהיה 5 mM. לאחר מכן, השתמשו במרכז צנטריפוגלי כדי לרכז את התמיסה ל-40 mg/mL. סובבו את הדגימה במהירות של 5,000 RPM ובטמפרטורה של 6 °C, והסירו כל משקע לאחר הריכוז.בשלב הבא, בלוחית 24 בארות, הגדירו תנאים שונים עם תמיסת המאגר, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. השתמשו בגריז לאטימה הרמטית על ידי מריחתו על שפת כל בארה. ערבבו 5 µL של תמיסת החלבון המרוכזת עם 5 µL של תמיסת המאגר על זכוכית כיסוי מסליקוניזציה.הנח את זכוכית הכיסוי הפוך מעל הבארים המכילות את תמיסת המאגר. אחסן את הפלטה בטמפרטורה של 4 degrees celsius לצורך גידול הגבישים. באמצעות לולאת צינור קריוגני, אסוף את הגבישים שגדלו והעבר אותם למבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 6 milliliter.הוסיפו 50 µL של תמיסת אם. לאחר מכן, העבירו את המבחנה לתא כפפות. העבירו 5 µL של ליגנד azaborine שהוכן לחלק הפנימי של מכסה הנקישה של המבחנה.סגרו את המבחנה ואחסנו אותה במקרר בתוך תא הכפפות למשך יומיים עד שבעה ימים לצורך שיווי משקל באמצעות דיפוזיית אדים. לאחר מכן, הניחו טיפה של N Paratone על עלית זכוכית. בעזרת מיקרופיפט, העבירו גביש לעלית.בשלב הבא, השתמש בלולאת צינור קריוגני כדי לאסוף את הגביש ולהעבירו מהתמיסה המימית לתוך N Paratone. טבול את הגביש המוגן ב-N Paratone בתוך כלי דואר (dewar) המכיל חנקן נוזלי. באמצעות מלקחיים קריוגניים, רכוב את הגביש שהוקפא במהירות על הלולאה.לאחר מכן, נתחו את נתוני הגבישים שנאספו כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. במחקר זה, מוצגת סינתזה שונה של 1, 2-azaborines המבוססת על שיטות שדווחו בעבר. נעשה שימוש ב-Tri-allele borine כדי להכין N-allele NTBSB-allele chloride adduct.לסינתזה של NTBS BCl 1, 2-azaborine, נעשה שימוש ברצף "one pot" בן שני שלבים, המניב תפוקה מבודדת גבוהה יותר מאשר בשיטות קודמות. הסינתזה של N-H-B-ethyl-1, 2-azaborine מבוצעת בשני שלבים, תוך שימוש ב-ethyllithium במקום בקומפלקס כרום ששימש בשיטות שדווחו בעבר. החלבון מטוהר באמצעות מערכת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך.כרומטוגרמה שבוצעה באורך גל של 280 nanometers מראה שיא התואם למוטציה של T4 Lysozyme, L99am102q. לאחר מכן החלבון מוקצן ויוצר קומפלקס עם ליגנדים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי סינתזת ה-azaborine דורשת תנאים נטולי אוויר, כגון תא כפפות (glove box) ומערכת ואקום לגזים (vacuum gas manifold), כדי למנוע פירוק של התרכובות.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך לחקר התכונות הכימיות והפיזיקליות הייחודיות של azaborines בהשוואה לארומטים פחמניים בכיסי שיקום אזוריים ביולוגיים קלאסיים.

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר...

שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

פרוטוקול להכנת diastereoselective בסיר אחד של ציס - N-TS-iodoaziridines מתואר. הדור של diiodomethyllithium, בנוסף לaldimines N-Ts וcyclization של אמין פנינה-diiodide ביניים לiodoaziridines מודגם. כן נכלל בפרוטוקול במהירות וכמותית להעריך את השלב נייח המתאים ביותר לטיהור על ידי כרומטוגרפיה.

סינתזה וטיהור של Iodoaziridines עירוב כמותי בחירת האופטימלית נייח השלב לכרומטוגרפיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להחדרת בדיקות כימיות באופן ספציפי לתוך מקטע נוגדנים על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד, ולאחר מכן צימוד האזיד עם בדיקה כימית על ידי תוספת ציקלו-אזיד-אלקין המקודמת על ידי זן (SPAAC).

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

Bicyclic aziridinium יונים כגון תוזילאט heptane ב 1-azoniabicyclo [4.1.0] נוצרו מ- 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl] aziridine, אשר היה מנוצל עבור הכנת piperidines שהוחלפו, azepanes דרך regio - ו stereospecific טבעת-הרחבה עם נוקלאופילים עם שונים. פרוטוקול יעילים ביותר זה מותר לנו להכין azaheterocycles מגוונים כולל מוצרים טבעיים כגון fagomine, febrifugine אנלוגי ו- balanol.

הכנת יציב Aziridinium Bicyclic יונים, פתיחת הטבעת שלהם לסינתזה של Azaheterocycles

3-ארוקסיל-N-הידרוxy-5-ניטרוניזים היו מסונתז על ידי ציקלותוספת של 4-nitronitroבנזן עם מסוף מבצואלאין בהליך תרמית צעד אחד. הכנת הניטרוגליצרין והאלאלאים דווחו כראוי ובהתאמה באמצעות הליכי חמצון על אנילין המקביל ועל האלנונול.

סינתזה ישירה, בררנית ואטומית-כלכליים של 3-ארוקסיל-N-הידרוxy-5-ניטרומים על-ידי ציקלותוספת של 4-ניצני בנזין עם אלדולונס

במחקר זה אנו מכינים את שני האננטיומרים של אזירידין-2-קרבוקסילאט, המשמשים בסינתזה האסימטרית של אלקלואידים, כולל ביאממיד B ו-D, ו-(-)-אפיאלו-איזומוסקרין.

הכנת אזירידינים לא פעילים של אננטיופור וסינתזה של ביאמאמיד B, D ואפיאלו-איזומוסקרין

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג חלבונים ספציפיים לסוג התא עם אזידונורלאוצין (ANL) באמצעות קו עכבר המבטא מוטציה L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*) ואת השלבים הדרושים לבידוד חלבונים ספציפיים לסוג התא המסומנים. אנו מתארים שני מסלולי מתן ANL אפשריים בעכברים חיים על ידי (1) מי שתייה ו-(2) זריקות תוך-צפקיות.

טיהור וזיהוי חלבונים ספציפיים מסוג תא מרקמות מורכבות באמצעות קו עכברים מוטנטי מתיונין tRNA Synthetase

ביסאזירידינים רציפים המכילים אזירידינים לא מופעלים ומופעלים סונתזו על ידי אזירידינציות אורגנוקטליטיות אסימטריות ולאחר מכן היו נתונים לתגובות כימוסלקטיביות של פתיחת טבעת בתנאים חומציים או בסיסיים. טבעת האזירידין הלא מופעלת נפתחת עם פחות נוקלאופילים תגובתיים בתנאים חומציים, ואילו טבעת האזירידין המופעלת נפתחת עם נוקלאופילים תגובתיים יותר בתנאים בסיסיים.

הכנת ביסאזירידינים רציפים לתגובות פתיחת טבעת רגיוזלקטיביות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור והערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית והציטוטוקסיות של הפפטיד הקטיוני Mel4 ושל הפפטיד המדמה RK758. על ידי שילוב סינתזה כימית, ביטוי רקומביננטי ובדיקות פונקציונליות סטנדרטיות, הוא מספק תהליך עבודה יעיל לייצור ובדיקה של פפטידים וחיקוי מולקולות קטנות.

ייצור ובדיקות של פפטידים אנטימיקרוביאליים והחיקויים שלהם

אנו מתארים נהלים להכנה ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון ממברנה בשלב מעוקב ליפידי עבור קריסטלוגרפיה סדרתית בלייזרים אלקטרונים חופשיים של קרני רנטגן ומקורות סינכרוטרון. ניתן ליישם פרוטוקולים אלה גם לשילוב ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון מסיסים, מה שמוביל להפחתה משמעותית בצריכת הדגימה בהשוואה להזרקת נוזלים.

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

למד שיטת סינתזה של 1,2-azaborines והכנת קומפלקסי חלבון עם מוטאנטים ליזוזים T4. טכניקה זו מספקת סינתזה אמינה של תרכובות בורון ליישומים ביורפואיים.

סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4

גלה סרטונים נוספים