חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין תפרחות Arabidopsis thaliana להדמיית ניצני פרחים חיים מתפתחים במיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות הפרחים לגבי היווצרות ומיצוב איברי הפרח והדינמיקה של תאי גזע של פרחים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה חיה של פרחים בזמן היווצרותם, שהיא קריטית להבנת מהו תהליך דינמי במהותו.

כדי לחשוף את ניצני הפרחים להדמיה, השתמש במלקחיים כדי להסיר את התפרחות המשניות, וניצני פרחים ישנים יותר מהתפרחת הראשונית. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לנקב חור אנכי באגרוז של צלחת ניתוח. כעת חתכו את 0.5 הסנטימטרים האחרונים של התפרחת והתקינו אותה זקופה לתוך האגרוז עם ניצני הפרחים הנותרים מעל פני האגרוז.

מלאו את הכלי במים סטריליים נטולי יונים כך שקודקוד היורה יהיה שקוע במלואו והשתמשו בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי לשטוף את כל האוויר הכלוא סביב קודקוד היורה. לאחר מכן הניחו את הדגימה מתחת למיקרוסקופ סטריאו. השתמש במלקחיים כדי להסיר את ניצני הפרחים שאין לצלם מהדגימה הטבולה.

כשמגיעים לשלב שבע ניצני פרחים, הוציאו את המים מכלי הניתוח, החליפו את כלי החיתוך מתחת למיקרוסקופ וסיימו את החיתוך. לאחר מכן ניתן למקם את הקודקוד זקוף לתוך המדיום של צלחת הדמיה כך שרק המריסטם האפיקלי של היורה וניצני הפרחים שמסביב נמצאים מעל פני המדיום. אם לא מכתים את הקודקוד מיד, השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוסיף טיפת מים לדגימה כדי לשמור על לחותה.

כדי להכתים את ניצני הפרחים, הסר תחילה את המים מפני השטח של צלחת ההדמיה בעזרת פיסת נייר טישו. לאחר מכן הניחו את המנה על צדה כדי לנקז את כל המים שנותרו מהמשטח הבינוני. המתן דקה ואז הסר את המים שנאגרו עם טישו חדש.

לאחר מכן, מתחת למיקרוסקופ, השתמש בפיפטה של 10 מיקרוליטר כדי למרוח 20 עד 30 מיקרוליטר מהכתם המתאים, תוך הקפדה על כיסוי הדגימה כולה כדי להבטיח צביעה הומוגנית. לאחר תקופת הדגירה המתאימה, יש לשטוף את הניצנים פעמיים במים סטריליים נטולי יונים. להדמיה במיקרוסקופ הפוך, השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להניח טיפת מים סטריליים נטולי יונים על קצה העדשה.

לאחר מכן הופכים את צלחת ההדמיה, מוסיפים טיפת מים סטריליים נטולי יונים לקודקוד הניתוח ומניחים את הדגימה הפוכה על במת המיקרוסקופ, תוך הקפדה לא לרסק את הדגימה. השתמש בבקרי X, Y ו-Z כדי לשים את הקודקוד המנותח במגע עם הטיפה בקצה העדשה. ייווצר עמוד מים.

להדמיה במיקרוסקופ זקוף, מלאו את צלחת ההדמיה במים סטריליים נטולי יונים כך שפני המדיום והדגימות יהיו שקועים לחלוטין ב-2.5 עד חמישה מילימטרים של מים. לאחר מכן, הניחו את הכלי על המיקרוסקופ הזקוףtagה והתאימו את עדשת טבילת המים ב-stagה כך שקצה העדשה יטבול במים. לאחר מכן השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי לשטוף כל בועת אוויר שנלכדה בקצה העדשה.

עבור כל אחד מסוגי המיקרוסקופ, כאשר הדגימה מוכנה, השתמש בבקר X, Y כדי למקם את אחד הקודקודים המנותחים בתוך שדה העדשה ובבקר Z כדי להתמקד בדגימה. כאשר דגימה נמצאה, השתמש בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי להתקרב לניצן הפרח המעניין כדי לקבל תמונה. הגדר את פרמטרי ההדמיה והגדר את החלק העליון והתחתון של מחסנית ה-Z ולאחר מכן המשך להדמיה של ניצן הפרח.

לאבלציה בלייזר של פרימורדיית הגביע יש להעביר את נתיב האור למצלמה המשויכת למערכת אבלציה בלייזר. לאחר מכן, השתמש בתוכנת מערכת אבלציה בלייזר כדי להגדיר את אזור האבלציה. לאחר מכן הגדר את עוצמת הלייזר וזמן השהייה לפרמטרים המתאימים להסרת מספיק תאים מבלי לגרום נזק רב מדי לרקמות הבסיסיות ולאחר מכן התחל באבלציה.

אם יש לבצע ניסויי זמן-lapse, שפכו את המים וכסו את הצלחת כדי למנוע התייבשות בין נקודות הזמן של ההדמיה. לאחר מכן הניחו את הדגימות בתנאי התרבות המתאימים. רוב המערכות הקונפוקליות מאפשרות הדמיה של שני פלואורופורים עם ספקטרום פליטה לא חופף יחד כגון GFP או YFP עם פרופידיום יודיד או FM4-64.

המערכות הקונפוקליות הטובות ביותר מסוגלות גם להפריד בין פלואורופורים מרובים עם ספקטרום פליטה חופף חלקית באותן דגימות כגון GFP או YFP, DsRed ופרופידיום יודיד כפי שמוצג בתמונה מייצגת זו. כאן מוצגות דוגמאות לניסויי זמן-lapse עם ניצני פרחים שהתפתחו באופן נורמלי לאחר אבלציה של גביע עם מערכת אבלציה בלייזר או באופן ידני עם מברג סיכה וסיכת מתכת. אבלציה בלייזר של פרימודיה הגביע המתהווה של ניצן פרח זה מנעה מהם לכסות את מריסטם הפרח שעדיין ניתן היה לצלם בשלב חמש.

לעומת זאת, בניצן פרח זה, אבלציה בלייזר רק עיכבה את צמיחת הגביע, אם כי הגביעים גדלו בסופו של דבר כדי לכסות את רוב המריסטמים של הפרחים בשלב החמישי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ארבידופסיס להדמיה קונפוקלית של ניצני פרחים חיים. בעקבות הליך זה, ניתן לחלץ נתונים איכותיים וכמותיים מהתמונות הקונפקוליות שלך באמצעות תוכנות שונות לניתוח תמונות.

טכניקה זו תסייע לחוקרים בתחום התפתחות הצמח לחקור את הדינמיקה של ביטוי גנים, חלוקת תאים ויצירת איברים בפרחים חיים מתפתחים.