Name: חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: למד הדמיה חיה בקונפוקל לפיתוח פרחים ב-Arabidopsis thaliana. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תהליכים דינמיים של יצירת איברי פרח ותאי גזע בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחבר מבקש להודות לפרופ &#39;אליוט מ Meyerowitz על תמיכתו, ואת הערות על כתב היד, וכן באן Lavanway ב Dartmouth College וד&quot;ר אנדרס קולזו במתקן הדמיה ביולוגית בקלטק עזרתם בפתרון בעיות טכניות עם הדמית confocal לחיות. עבודתו של נתנאל Prunet נתמך על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות באמצעות גרנט R01 GM104244 כדי אליוט מ Meyerowitz.

<ol><li>Prunet, N., Jack, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flower+Development+in+Arabidopsis%3A+There+Is+More+to+It+Than+Learning+Your+ABCs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).</li>
<li>Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+regulatory+mechanisms+controlling+floral+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development.</a> FEBS J. , (2016).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+auxin+transport+and+gene+expression+during+primordium+development+revealed+by+live+imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).</li>
<li>Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+homeostasis+and+growth+dynamics+can+be+uncoupled+in+the+Arabidopsis+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex.</a> Science. 310 (5748), 663-667 (2005).</li>
<li>Yadav, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WUSCHEL+protein+movement+mediates+stem+cell+homeostasis+in+the+Arabidopsis+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex.</a> Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).</li>
<li>Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DORNROSCHEN-LIKE+expression+marks+Arabidopsis+floral+organ+founder+cells+and+precedes+auxin+response+maxima%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima.</a> Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).</li>
<li>Urbanus, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+localisation+patterns+of+MADS+domain+proteins+during+floral+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 9, (2009).</li>
<li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+Cell+Growth+Yields+Reproducible+OrganDevelopment+through+Spatiotemporal+Averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging.</a> Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).</li>
<li>Roeder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+in+the+control+of+cell+division+underlies+sepal+epidermal+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 8 (5), e1000367(2010).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24395274">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Lineage+Analysis+to+Study+Cell+Division+Orientation+in+the+Arabidopsis+Shoot+Meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li>
<li>Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Dev. Biol. , (2016).</li>
<li>Fernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+plant+growth+in+4D%3A+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. , (2010).</li>
<li>Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+GFP%3A%3AcDNA+fusions+enable+visualization+of+subcellular+structures+in+cells+of+Arabidopsis+at+a+high+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).</li>
<li>Irish, V. F., Sussex, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+apetala-1+gene+during+Arabidopsis+floral+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development.</a> Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).</li>
<li>Vernoux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auxin+signalling+network+translates+dynamic+input+into+robust+patterning+at+the+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Systems+Biol%22%5BJournal%5D)">The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex.</a> Mol. Systems Biol. 7, 508(2011).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell+shape+and+gene+expression+in+the+shoot+apical+meristem+using+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX.</a> Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).</li>
</ol>

המחבר יש מה למסור.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול עבור ההדמיה של חיה, ניצני פרחים ארבידופסיס מתפתחים עם מיקרוסקופ confocal עדשה-טבילה במים. אמנם זה יכול להיעשות גם עם זקופה או מיקרוסקופ הפוכה, זה קל ומהיר להשתמש לשעבר. כמו כן ראוי לציין כי מערכות confocal שונות להשתנות באופן משמעותי במונחים של מהירות, רגישות, ואת היכולת להפריד אורכי גל. מיקרוסקופי confocal הטובים כעת לאפשר לערוצים שונים תמונה מספר (למשל GFP, YFP, dsRed ו יודיד propidium; 2G האיור) באותו דגימות. מיקרוסקופים confocal חלקם מצוידים בגלאי רפאים, אשר יכולים לאסוף את הקרינה מכמה fluorophores זמנית ולהפריד אותם לאחר מכן. בעת שימוש בגלאי רגיל, לעומת זאת, קבוצה של לייזרים ומסננים יש להשתמש כדי להלהיב ולהפריד את הקרינה מן fluorophores השונה. Fluorophores לחלקם יש ספקטרום פליטה ברור לחלוטין (בלתי CFP למשלד YFP), ויכול להיות צלם בו זמנית. Fluorophores האחר יש ספקטרום פליטה חופף חלקית (GFP למשל ו YFP), ובדרך כלל צריך להיות צלם בנפרד, אשר מגדיל את זמן הדמיה. הדמית fluorophores הקרובה גם לעתים קרובות דורשת הגבלה כמה הקשת נאספת עבור כל ערוץ למנוע קרינה מן fluorophore אחד מ דולף לתוך ערוץ אחר. זו גורמת לאובדן של עוצמת האות שנאספו, אשר יכול להיות מפוצה על ידי עלייה כוח לייזר ורווח. עם זאת, זמן הדמיה ממושכת וכוח לייזר מוגבר עלול להלבין ו / או נזק המדגם. כוח הליזר מוגבר ו / או רווח עשוי גם להגביר את רעשי רקע. אופטימיזציה של עוצמת אות, רזולוציה וזמן הדמיה עבור כל דגימה נעשתה באמצעות תהליך של ניסוי וטעייה, והיא כרוכה בפשרות קבעו. פרוטוקול זה מסביר כיצד לבצע הדמיה confocal לחיות ניצני פרחים לפתח על צלעותיה של איפקס לירות גזור. זהניתן לטעון כי העובדה איפקס לירות אינה מחוברת לשאר הצמח גדלה במצע המכיל Cytokinins עלול להשפיע SAM ופיתוח פרח. עם זאת, המדיום הזה תוכנן באופן אמפירי באמצעות תהליך של ניסוי וטעייה כדי להבטיח צילומים הגזורים meristems הפסגה לייצר ניצני פרחים חדשים על פלסטוכרון הנורמלי, וכי ניצני פרחים אלה להתפתח בצורה תקינה 15. באופן דומה, דיסקציה עָלֶה גָבִיעַ אינה מופיעה להשפיע דפוסי ביטוי גנים או ההתפתחות של שאר הפרחים. פרוטוקולים אחרים בפירוט כיצד לבצע הדמיה confocal לחיות של SAM עדיין מחוברת לשאר הצמח (למשל הפניה 11). פרוטוקולים כזה יכול להתאים, ולהציע אלטרנטיבה שימושית עבור ההדמיה של פיתוח פרחים, במיוחד כאשר לומד תהליכים הקשורים לציטוקינין. הם מציגים כמה חסרונות עם זאת: מתארך הגבעול ומסובב, ומשנה את הכיוון של ניצני פרחים; אnd תוך הדמיה איפקס לירות מצורפת לשאר המפעל עובד היטב עם מיקרוסקופ זקוף, זה הרבה יותר מסובך לעשות זאת עם מיקרוסקופ הפוכה. עדשות Immersion יש צמצם מספרי טוב (NA) מאשר עדשות &quot;יבשות&quot; (עדשות כלומר המופרדים מן המדגם על ידי אוויר), ולכן מספקות רזולוציה עדינה של המדגם, שהוא קריטי כאשר באמצעות מיקרוסקופ confocal. באמצעות עדשת מי טבילה ובכך מספק NA הרבה יותר טוב מאשר עדשה יבשה, תוך מניעת איפקס לירות מן להתייבשות במהלך תהליך ההדמיה. בעוד גליצרין ועדשות שמן יש NA אפילו גבוה יותר מאשר עדשות מים, הם דורשים את השימוש coverslip, וזה מאוד חסר מעשיות עם מדגם בגודל של איפקס לירות, אשר גם ממשיך לגדול במהלך ניסויים זמן לשגות. בהתחשב בגודל של הדגימות (תלוי בשלבים הפרחוניים, ערימות יכולות להיות מעל 150 מיקרומטר עבה), חשוב גם להשתמש בעדשה עם מרחק עבודה ארוך. אנחנו בדרך כלל להשתמש בעדשה 20 או 40X עם NA של 1 ו מרחק עבודה של 1.7-2.5 מ&quot;מ. תוכנת מיקרוסקופ Confocal מציעה מספר דרכים כדי להמחיש נתונים confocal, כולל שחזורים תלת-ממדיים (איור 2, B1, B2 ו- B4) ונוף פרוסה (איור 2, B3). בעוד תצוגות תלת מימדי הנפוץ ביותר הן תחזיות בעוצמה מקסימלית של Z- ערימות confocal (איור 2, B1 ו- B4), תוכנה כלשהי (למשל זן Imaris) מציעים גם נוף שקיפות שמסננת את האות מ בחלקים עמוקים יותר של המדגם (איור 2, B2), אשר יכול להיות שימושי כאשר מסתכלים תהליכים המתרחשים, או הגנים מתבטאת, שכבת אפידרמיס. עוצמת האות יכול להיות מקודד או עם צבע אחד (איור 2, B1), באמצעות פיקסל intensity, או באמצעות קוד צבע (איור 2, B4). הדמית confocal לחיות לא רק מציעה תובנה איכותיות רבות ערך על פיתוח פרח, זה גם מספק לביולוגים התפתחותי פוטנציאלי עם שפע של נתונים כמותיים. תוכנות שונות (למשל Imaris, פיג&#39;י, MARS-ALT, 15 MorphographX, 20, 21) מאפשרת כימות של מספר או נפח של תאים המבטאים אחד או כמה עיתונאים, או את רמת הביטוי של עיתונאי בתאים שונים. תוכנה כזו יכולה לשמש גם כדי לבצע פילוח תא אוטומטי, לעקוב אחר שושלות תאים ולכמת צמיחה. תוכנות שונות זו מציעות כלים דומים, אך גם שונות במובנים רבים. MARS-ALT ו- MorphoGraphX תוכננו במיוחד עבור צמחים 15, 20, 21, שבניגוד Imarisnd בפיג&#39;י. MorphoGraphX ​​מאפשר רק עבור פילוח וניתוח של שכבת אפידרמיס, בעוד Imaris ומאדים-ALT לאפשר פילוח וניתוח של המדגם כולו. עם זאת, MARS-ALT דורש הדמיה לפני מאותו מדגם משלוש זוויות שונות 15, ו Imaris רק דורש בערימה אחת. גישה למידע כמותי הוא קריטי כדי לקדם את ההבנה של התפתחות הפרח שלנו.

רוב בגוף הצמח יוצר פוסט-בעוברים מקבוצות של תאי גזע הנמצאים ליד או הקצה - או meristems פסגה - היורה והשורשים. כל המבנים מעל פני הקרקע של המפעל המבוגר נובעות meristem הפסגה לירות (SAM), אשר מייצרת איברים לרוחב ברציפות על צלעותיו: משאירה בשלב צומח meristems פרח (FMS) לאחר מעבר שלב הרבייה. FMS בתורו להתפתח פרחים. בעוד ארבידופסיס SAM מייצרת איברים לרוחב אחד בכל פעם, כמו בדגם איטרטיבי, ספירלה, FMS לייצר ארבעה סוגים של איברים פרחוניים בתוך ארבעה דורות, באופן סינכרוני חלקית, עם תוכניות התפתחותיים מרובות נפרמות זמנית. הרשתות הגנטיות שבבסיס המפרט של זהות האורגנים הפרחוניים השונים פוענחו חלקית (לביקורות, לראות אזכור 1, 2), אך היבטים רבים של developme פרחNT, כגון מיצוב פרחוני איברים בהגדרת גבולות בין דורות, להישאר ממעטים להבין. מחקרים גנטיים מולקולריים מוקדם של התפתחות צמח הסתמכו בעיקר על טכניקות כגון כלאה באתרו וכתבים גאס לנתח ביטוי גנים. בעוד שיטות אלה סיפקו שפע של מידע ותרם רבות להבנתנו של גידול צמחים ופיתוח פרח, יש מגבלות חשובות: הם חסרים ברזולוציה הסלולר טוב, לא מאפשרים התבוננות קלה של דפוס הביטוי של גנים מרובים באותו דגימות, וחשוב, יכולות להיות מיושמות רק רקמות מתות, קבועות. התקדמות מיקרוסקופיה confocal יש להתגבר על המגבלות האלה, ולספק ביולוגים התפתחותיים עם כלי רב עצמה כדי לחקור את התהליכים morphogenesis צמח בסיסי. בפרט, מיקרוסקופיה confocal מאפשרת תצפית של חיות רקמות ואיברים ברחבי היווצרותם, המהווה גritical כדי להבין תהליך דינמי מובהק כגון פיתוח. הדמית confocal לחיות נעשתה שימוש נרחב כדי לנתח את הגידול האווירי של צמחים ובעלי לייצור איברים לרוחב ידי SAM (למשל שמייחס 3, 4, 5, 6), אך למעט כמה דיווחים (אזכור למשל 7, 8, 9, 10), זה לא יושם נרחב לחקר התפתחות הפרח. פרוטוקולים עבור הדמית confocal לחיות של SAM זמינים (למשל שמייחס 11, 12), ולספק בסיס טוב איך תמונת ניצני פרחים בפיתוח המקיפים את SAM. עם זאת, ניצני פרחי הדמיה מציב אתגרים ספציפיים: למשל,ניצני פרחים במהירות להיות גדול יותר SAM, ובשלב 4, עלי גביע להתחיל כיסוי FM (שלבים כמתואר התייחסות 13), ואת עמעום הקרינה מן היסוד רקמות (איור 2 א). כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המסביר כיצד לבצע הדמית confocal לחיות בפיתוח ניצני פרחים ארבידופסיס או באמצעות זקופה או מיקרוסקופ הפוך עדשת מי טבילה. אנחנו קודם לכן פרסמנו פרוטוקול זה ביחס 14.

<table><tbody><tr><td>מלקחיים&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72701-D</td><td>Dumont Style 5 Inox, לדיסקציה קודקודית</td></tr><tr><td>פין</td><td>Vise Ted Pella, Inc.</td><td>13560</td><td>אורך 80 ס"מ, לאבלציה של גביע</td></tr><tr><td>מחטי נירוסטה ישרות&nbsp;</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>13561-50</td><td>0.1 מ"מ קוטר, אורך 1.2 ס"מ, לאבלציה של גביע</td></tr><tr><td>קופסאות פלסטיק עגולות</td><td>אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה</td><td>64332</td><td>שקופים, קוטר 6 ס"מ, עומק 2 ס"מ, לשימוש ככלים לניתוח</td></tr><tr><td>קופסאות צירים מלבניות</td><td>Durphy Packaging Co.&nbsp;</td><td>DG-0730</td><td>שקוף, אורך 2-7/8 אינץ', רוחב 2 אינץ', עומק 1-1/4 אינץ', לשימוש ככלי הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף</td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות, פוליסטירן, סטרילי</td><td>VWR</td><td>25382-064</td><td>שקוף, קוטר 3.5 ס"מ, עומק 1 ס"מ, לשימוש ככלי הדמיה עם מיקרוסקופ הפוך</td></tr><tr><td>פיפטות P10 ו-P1000&nbsp;</td><td></td><td></td><td>עם קצות סינון מתאימים</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td>עם הגדלה מקסימלית של 80-90X</td></tr><tr>מערכת <td></td><td></td><td>אבלציה בלייזר</td><td>לאבלציה של גביע</td></tr> מערכת <tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>קונפוקלי סריקת לייזר</tr><tr>עדשת <td></td><td></td><td>טבילה במים 20 או 40X</td><td>עם NA של 1 ומרחק עבודה של 1.7-2.5 מ"מ</td></tr><tr><td>אגרוז</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige ו-Skoog תערובת מלח בסיסית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>ללא ויטמינים</td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td>ויטמין</td></tr><tr><td>חומצה ניקוטינית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0761</td><td>ויטמין</td></tr><tr><td>פירידוקסין הידרוכלוריד&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6280</td><td>ויטמין</td></tr><tr><td>תיאמין הידרוכלוריד&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>ויטמין</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8790</td><td>ויטמין</td></tr><tr><td>N6-בנזילאדנין&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td>BAP, תמיסת ציטוקינין</td></tr><tr><td>פרופידיום יודיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל במים, כדי לצבוע את דפנות התא</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td>לדלל במים ל-80&nbsp; &mu; g/mL, כדי לצבוע את ממברנות הפלזמה</td></tr></tbody></table>

חי confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

המחקר של גידול צמחים ופיתוח הסתמך ארוך על טכניקות ניסוי באמצעות מתות, רקמות קבועות וחסרות ברזולוציה הסלולר נכונה. התקדמות מיקרוסקופיה confocal, בשילוב עם הפיתוח של fluorophores הרב, יש להתגבר על בעיות אלה ופתחה את האפשרות ללמוד את הביטוי של גנים אחדים בעת ובעונה אחת, עם רזולוצית הסלולר טובה, בדגימות לחיות. הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים צמח עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח, וכן נעשה שימוש נרחב ללמוד צמיחה שורש היווצרות של איברים לרוחב על צלעותיה של meristem לירות הפסגה. עם זאת, זה לא יושם באופן נרחב לחקר התפתחות פרח, בין שאר בשל לאתגרים ייחודיים הדמית פרחים, כמו עליי גביע גדלים מעל meristem פרח, ולסנן את הקרינה מן הרקמות בסיסיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה confocal לחיות על חיים, פיתוח הערביניצני פרחי idopsis, או באמצעות זקופה או מיקרוסקופ הפוכה.

איור 2 מציג תצוגות שונות של ערימות-Z confocal של ניצני פרחי ארבידופסיס חיו לבטא גני כתב ניאון שונים, מוכתם או יודיד propidium (איור 2, A-C5 ו- G) או FM4-64 (איור 2, E1-F) כדי לספק רזולוצית הסלולר ברורה. רוב מערכות confocal לאפשר הדמיה של שני fluorophores עם ספקטרום פליטה שאינן חופפות כגון GFP או YFP יחד עם או יודיד יודיד או FM4-64 (איור 2 א - 2F). מערכות confocal הטובות ביותר הן גם מסוגלות להפריד fluorophores המרובה עם ספקטרום פליטה חופף חלקית באותו דגימות, כגון GFP ו YFP, ו dsRed ו יודיד propidium (איור 2G). שלוש דוגמאות של ניסויי הזמן לשגות מוצגות באיור2 ולהראות ניצני פרחים מתפתח בצורה תקינה לאחר אבלציה עָלֶה גָבִיעַ בוצע גם עם מערכת אבלציה לייזר (איור 2, C1-C5 ו- D1-D5) או באופן ידני עם במלחציים פינים ופין מתכת (איור 2, E1-E2). שים לב ניצן הפרח שמוצג באיור 2, E1-E2 הוא מצמח סופרמן-1 מוטציה, וזו הסיבה primordia carpel לא נצפתה במרכז של ניצן ב אבלציה לייזר הבמה 7. primordia עָלֶה גָבִיעַ המתעוררים של ניצן הפרח 2 שמוצג באיור, C1-C5 מונעת מהם מכסה את FM, אשר עדיין ניתן הדמיה בשלב 5 (איור 2, C5). לעומת זאת, במקרה של ניצן הפרח שמוצג באיור 2, D1-D5, אבלציה לייזר רק מתעכב צמיחה עָלֶה גָבִיעַ, אבל עלי גביע הזמן למדה לכסות את רוב FM ידי שלב 5 (איור 2, D5 </strong&gt;). נהפוך הוא, אם הזמן כוח לייזר רב מדי מגורים משמש במהלך אבלציה לייזר, הנזק מתפשט אל החלק המרכזי של הפרח ומשפיע הצמיחה שלה ולפעמים התוצאה מכן למותו של ניצן הפרח כולו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> איור 2: ויזואליזציה של ערימות-Z confocal של ניצני פרחים חיים. A ו- B2 הם נופי שקיפות; B1 ו- B4-G הן תחזיות בעוצמה מקסימלית; B3 הוא נוף פרוס מאונך. (A - E2) פרחים להביע כתבת ונוס עבור גן APETALA3 (הירוק); קירות התא היו מוכתמים propidium יודיד (אדום, למעט B4, ירוק). (א) תפרחת; מספרים מצביעים בשלבים פרחוניים; עליי גביע בשלב 4 ו 5 פרחים לסנן את הקרינה של כתב ונוס, אשר בדרך כלל FORMS טבעת. שים לב כמה ניצני פרחים להופיע מוטה לעומת התפרחת. (B1 - B4) ארבע תצוגות שונות של Z-ערימת confocal הזהה של ניצן פרח שלב 5: תחזיות בעצמה מקסימלית (B1 ו- B4) עם עוצמת אות ונוס מקודדת עם עוצמת פיקסל בצבע הירוק (B1) או עם קוד צבע אש (B4; קוד צבע מוצג בתחתית הפאנל); שקיפות נוף (B2) ולהציג פרוסת אורתוגונלי (B3, את XY, נטיית XZ ו YZ של הפרוסות מצוינות בלוח). (C1 - C5) 4 ימים זמן לשגות של ניצן הפרח היחיד משלב 3 לשלב 5; כריתת ליזר (מסומן כתכונות לבנות) שבוצעה ביום 1 והיום 3 היו מספיק כדי למנוע את עלי הגביע מלסקר במרכז ניצן הפרח בשלב 5. (D1 - D5) 4 ימים זמן לשגות של ניצן פרח בודד שלב3 עד שלב 5; כריתת ליזר שבוצעה ביום 1, 2 ו 3 היו מספיקה כדי למנוע את עלי הגביע מלסקר במרכז ניצן הפרח. (E1 - E2) ניצן פרח פרט לאחר הסרה ידנית של abaxial ואת עליי גביע adaxial (E1), ושל כל עלי הגביע (E2); ראשי חץ לבן מציינים עלי גביע הנותרים; כוכביות לבנות מצביעות צלקות כתוצאה מההסרה עליי הגביע. (F) שלב 7 פרח apetala1-1 להביע כתבת DR5-3xVenusN7 18 (ירוק); ממברנות פלזמה הוכתמו FM4-64 (אדום); ראשי חץ כחול מצביעים על מבנים דמויי עלים שמחליפים עלי הגביע אינם מכסים את ניצן הפרח. (G) ניצן פרח שלב 4 להביע כתב GFP ניאון עבור DORNROSCHEN דמוי 7 (ירוק), כתב ונוס לסופרמן (אדום) ו כתב dsRed עבור 19 CLAVATA3 (ציאן); תאיםהקירות היו מוכתמים propidium יודיד (אפור). ד: יום; רח: במה. ברים בקנה מידה = 25 מיקרומטר; בקנה מידה זהה ב B1, B2 ו- B4, ב C1-C5 ו ב D1-D5. דמות זו שונתה מהתייחסות 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין תפרחות של Arabidopsis thaliana לצורך הדמיה של ניצני פרחים מתפתחים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום התפתחות הפרח בנוגע להיווצרות ומיקום של איברי הפרח ולדינמיקה של תאי גזע בפרח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה חיה של פרחים בזמן היווצרותם, דבר שהוא קריטי להבנת תהליך שמהותו היא דינמית.כדי לחשוף את ניצני הפרחים לצורך דימות, השתמשו בפינצטה להסרת התפרחותים המשניים וניצני פרחים מבוגרים מהתפרחות הראשית. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי ליצור חור אנכי באגרוז של צלחת דיסקציה. כעת, חתכו את 0.5 הסנטימטרים האחרונים של התפרחות והניחו אותה במצב זקוף בתוך האגרוז, כך שניצני הפרחים שנותרו יהיו מעל פני שטח האגרוז.מלאו את הצלחת במים דה-יוניים סטריליים כך שקודקוד הנבט יהיה טבול לחלוטין, והשתמשו בפיפטה של 1,000 microliter כדי לשטוף בועות אוויר כלשהן שנלכדו סביב קודקוד הנבט. לאחר מכן, הניחו את הדגימה תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמשו בפינצטה כדי להסיר מהדגימה הטבולה את ניצני הפרחים שאינם מיועדים לדימוי.כאשר ניצני הפרחים מגיעים לשלב שבע, יש לרוקן את המים מצלחת הדיסקציה, להחזיר את צלחת הדיסקציה אל מתחת למיקרוסקופ ולהשלים את הדיסקציה. לאחר מכן ניתן להניח את הקודקוד בצורה זקופה בתוך המצע של צלחת דימות, כך שרק המריסטמה האפיתלית של הנצר והניצנים הסובבים אותה יהיו מעל פני המצע. אם לא צובעים את הקודקוד באופן מיידי, השתמשו בפיפט של 1,000 µL כדי להוסיף טיפה של מים לדגימה לשמירה על הידרטציה.כדי לצבוע את ניצני הפרח, ראשית הסיר את המים מפני השטח של צלחת הדימוג באמצעות פיסת נייר סופג. לאחר מכן, הנח את הצלחת על צדה כדי לנקז את שארית המים מפני השטח של המצע. המתן דקה, ולאחר מכן הסר את המים שהצטברו באמצעות נייר סופג חדש.לאחר מכן, תחת המיקרוסקופ, השתמשו בפיפט של 10 microliter כדי להעביר 20 עד 30 microliter מהצבע המתאים, תוך הקפדה על כך שכל הדגימה תהיה מכוסה כדי להבטיח צביעה הומוגנית. לאחר תקופת האינקובציה המתאימה, שטפו את הנבטים פעמיים במים דאיוניים סטריליים. לצילום במיקרוסקופ הפוך, השתמשו בפיפט של 1,000 microliter כדי להניח טיפה של מים דאיוניים סטריליים על קצה העדשה.לאחר מכן, הפוך את צלחת הדימוי, הוסף טיפה של מים סטריליים דה-יוניים לקודקוד המנותח והנח את הדגימה כשהיא הפוכה על במה המיקרוסקופ, תוך הקפדה לא למעוך את הדגימה. השתמש בבקרי ה-X, Y ו-Z כדי להביא את הקודקוד המנותח למגע עם הטיפה שבקצה העדשה. כך תיווצר עמודת מים.עבור דימוי במיקרוסקופ אנכי, מלאו את צלחת הדימוי במים סטריליים דה-יוניים כך שפני המצע והדגימות יהיו טבולים לחלוטין ב-2.5 עד חמישה מילימטרים של מים. לאחר מכן, הניחו את הצלחת על בסיס המיקרוסקופ האנכי וכוונו את עדשת הטבילה במבסיס כך שקצה העדשה יטבול במים. לאחר מכן, השתמשו בפיפט של 1,000 microliter כדי לשטוף בועות אוויר כלשהן שנלכדו בקצה העדשה.עבור כל אחד מסוגי המיקרוסקופים, כאשר הדגימה מוכנה, השתמשו בבקר ה-X, Y כדי למקם את אחד הקודקודים המנוסחים בתוך שדה העדשה, ובבקר ה-Z כדי להתמקד בדגימה. לאחר איתור הדגימה, השתמשו בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי לבצע זום על ניצן הפרח הרלוונטי לצורך קבלת תמונה. הגדירו את פרמטרי הדמיה וקבעו את הגבול העליון והתחתון של ה-Z-stack, ולאחר מכן התחילו בהדמיית ניצן הפרח.עבור אבלציה בלייזר של ראשיתי הגביע (sepal primordia), העבירו את נתיב האור למצלמה המחוברת למערכת האבלציה בלייזר. לאחר מכן, השתמשו בתוכנת מערכת האבלציה בלייזר כדי להגדיר את אזור האבלציה. לאחר מכן, הגדירו את עוצמת הלייזר ואת זמן השהייה (dwelling time) לפרמטרים המתאימים לאבלציה של מספיק תאים מבלי לגרום לנזק רב מדי לרקמות שמתחתיהם, והתחילו באבלציה.אם מתוכננים ניסויי timelapse, יש לשפוך את המים ולכסות את הצלחת כדי למנוע התייבשות בין נקודות הזמן של הדימות. לאחר מכן, יש להניח את הדגימות בתנאי תרבית מתאימים. רוב מערכות הקונפוקל מאפשרות דימות סימולטני של שני פלואורופורים בעלי ספקטרומי פליטה שאינם חופפים, כגון GFP או YFP יחד עם propidium iodide או FM4-64.מערכות קונפוקליות איכותיות מסוגלות להפריד בין מספר פלואורופורים בעלי ספקטרי פליטה חופפים חלקית באותן דגימות, כגון GFP או YFP, DsRed ופרופידיום יודאיד (propidium iodide), כפי שמוצג בתמונה מייצגת זו. כאן מוצגות דוגמאות לניסויי timelapse עם ניצני פרחים שהתפתחו כסדרם לאחר הסרה (ablation) של גבנונים באמצעות מערכת אבלציה בלייזר או באופן ידני בעזרת מלחציים לסיכות וסיכה ממתכת. אבלציית לייזר של פרימורדיומים של גבנונים בבקיעתם בניצן פרחים זה מנעה מהם לכסות את המריסטמה של הפרח, שניתן היה להמשיך ולדגמה בשלב חמישה.לעומת זאת, בניצן פרח זה, האבלאציה בלייזר רק עיכבה את צמיחת הגבנויות, אם כי בסופו של דבר הגבנויות צמחו וכיסו את מרבית המריסטמות של הפרח עד שלב חמישה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת Arabidopsis לצילום קונפוקאלי של ניצני פרחים חיים. בעקבות הליך זה, ניתן להפיק נתונים איכותניים וכמותיים מהתמונות הקונפוקאליות שלכם באמצעות תוכנות שונות לניתוח תמונות.טכניקה זו תסייע לחוקרים בתחום התפתחות הצמחים לבחון את הדינמיקה של ביטוי גנים, חלוקת תאים ויצירת איברים בפרחים חיים בשלבי התפתחותם.

live-confocal-imaging-of-developing-arabidopsis-flowers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק...

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים חיים של השלד המיקרו-טבובול הקליפתי ב"ירי" ומנטר את תגובתו לשינויים בכוחות הפיזיים.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

כאן, אנו מתארים שיפור של שיטת Semi-in vitro (SIV) לצפייה בהנחיית צינור אבקה וקליטה ב- Arabidopsis thaliana, אשר מגביר את הקבלה של הביציות. ניתן לשלב את שיטת SIV cum septum בעלת תפוקה גבוהה עם קווי סמן gametophyte וחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לפקח על התהליך הדינמי של ההפריה.

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum

תנועת כרומוזומים במהלך פרופאזה מיוטית היא תופעה לא מובנת היטב שהיא בסיסית להיווצרות נבגים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה, ניתוח וכימות של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית במיוציטים זכריים של Arabidopsis thaliana .

אפיון הדמיה חיה של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב- Arabidopsis thaliana

פרוטוקול זה מציע תהליך עבודה יעיל להדמיית מיקרוסקופיה בלוקליזציה בודדת של גרעיני ארבידופסיס מבודדים, תוך שימוש בבידוד, קיבוע ותיוג אופטימליים להשגת ויזואליזציה ננומטרית אמינה של כרומטין ו-RNA פולימראז II. גישה זו ניתנת להתאמה קלה לחלבונים אחרים הקשורים לכרומטין או לשינויים בהיסטונים להדמיה ברזולוציה גבוהה.

פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס

תהליך זה עושה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם גרעין מסומן פלואורסצנטי וקו סמן כרומטין ב-Arabidopsis thaliana כדי לתעד בו-זמנית את דינמיקת הגרעין והכרומטין בשורשי הערבידופסיס ולחקור שינויים בדינמיקה אלו בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים.

הדמיה כמותית של תאים חיים של צורת גרעין ודינמיקת כרומטין במהלך ההתפתחות ולחץ סביבתי בשורש Arabidopsis thaliana

למד הדמיה חיה בקונפוקל לפיתוח פרחים ב-Arabidopsis thaliana. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תהליכים דינמיים של יצירת איברי פרח ותאי גזע בזמן אמת.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

גלה סרטונים נוספים