Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An במבחנה Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

פרוטוקול זה מתאר בדיקה למדידת תפקוד CFTR ותגובות מודולטור CFTR ברקמות מתורבתות מנבדקים עם סיסטיק פיברוזיס (CF). אורגנואידים במעי שמקורם בביופסיה מתנפחים בצורה מונעת cAMP, תגובה פגומה (או מופחתת מאוד) באורגנואידים של CF וניתן לשחזר אותה על ידי חשיפה למודולטורים של CFTR.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את תפקוד ה-CFTR האינדיבידואלי ביעילות של טיפולי אפנון CFTR באמצעות נפיחות הנגרמת על ידי פורסקולין, או בדיקת FIS, באורגנואידים במעי שנוצרו מחולי סיסטיק פיברוזיס. שיטה זו נותנת מענה לשאלות מפתח בתחום סיסטיק פיברוזיס. בעיקר זה עוזר לזהות חולים שיכולים להפיק תועלת ארוכת טווח מתרופות קיימות או ניסיוניות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש ברקמה נגישה בקלות ליצירת אורגנואידים מכל חולה CF ללא תלות בגיל. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אורתיותרפיה של סיסטיק פיברוזיס, ועונה על צורך עכשווי דחוף בבדיקת יעילות תרופות בצורה חסכונית ואינדיבידואלית. מדגימים את ההליך מרווין סטטיה מ-Hubrecht Organoid Technology ואנלוט וונק מקבוצת ג'פרי ביקמן.

לקבלת נתוני בדיקת נפיחות אופטימליים הנגרמת על ידי פורסקולין, חיוני לעבוד עם תרבית המכילה אורגנואידים גדולים עם ניצנים מרובים. לאחר זיהוי תרבית כזו, סמן צינור חרוטי אחד של 15 מיליליטר עם שם המדגם וצינור אחד כשטוף. לאחר מכן, השתמש בפיפטה p1000 כדי לשאוב בזהירות את המדיום מבארות התרבות האורגנואידית מבלי להפריע לטיפות מטריצת קרום המרתף.

והוסף מיליליטר אחד של מדיום בסיסי לכל באר. כעת השתמש בפיפטה כדי לפרק את טיפות מטריצת קרום המרתף בכל באר, ולהעביר את מתלי האורגנואיד המתקבלים לצינור 15 מיליליטר עם שם המדגם. שוטפים כל באר עם מילימטר נוסף של מדיום בסיסי ומושכים את השטיפות בצינור הדגימה.

לאחר איסוף כל הדגימות, מלאו את צינור הדגימה לנפח סופי של 12 מיליליטר במדיום בסיסי והשתמשו בפיפטה רטובה מראש של חמישה מיליליטר כדי לערבב את התמיסה. לאחר מכן, צנטרפו את האורגנואידים, והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום בסיסי טרי. כסו את אותו קצה פיפטה p1000 בקצה p10 ללא פילטר ונסו לדרג את המתלה 20 פעמים.

לאחר מכן השליכו את שני הקצוות והשתמשו בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום בסיסי טרי לדגימה. הטה את הצינור כ-70 מעלות, וערבב במרץ את התמיסה פעמיים-שלוש עם קצה הפיפטה החדש p1000 הרטוב מראש. החזק את הצינור במצב מוטה למשך 10 שניות.

לאחר מכן השתמש באותה פיפטה p1000 כדי להעביר את המיליליטר העליון של הדגימה לצינורות השטופים ארבע פעמים. לאחר שנקטפה הדגימה האחרונה, אספו את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה והשעו מחדש את הגלולה ב-120 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף של 50%. לאחר מכן הנח טיפה של שלושה מיקרוליטר על שקופית מיקרוסקופ זכוכית ואשר את נוכחותם של לפחות 30 עד 50 אורגנואידים בתוך הטיפה תחת מיקרוסקופ אור.

לאחר מכן, צלחו שלוש טיפות אורגנואיד מיקרוליטר על אמצע כל באר של צלחת של 96 בארות, והניחו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי למצק את מטריצת קרום המרתף. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום מעי גס מלא בתוספת VX809, או מדיום מעי גס מלא בלבד לבארות האורגנואידים המתאימות, והחזירו את הצלחת לחממה למשך 18 עד 24 שעות. למחרת, השתמש בפיפטה משחזרת כדי להוסיף 10 מיקרוליטר תמיסת סידן לכל באר, השהה מחדש את הבארות פעם אחת עם פיפטה רב-ערוצית כדי להבטיח שהן מתערבבות, והחזיר את הצלחת לחממה למשך 30 דקות נוספות.

בזמן שהתאים מוכתמים, הגדר מראש את כלי ההדמיה החיה במיקרוסקופ הדמיית התא החי ל-37 מעלות וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני כדי לדגור מראש את תא ההדמיה. בתום הדגירה, העבירו את הצלחת למחזיק הצלחת במיקרוסקופ הקונפוקלי והשתמשו באפשרות ההתקנה החכמה כדי לבחור את מסלול Alexa floor 488. לאחר מכן, הגדר את חמש העדשות לשעבר ואזור הסריקה ל-0.6x כדי להקטין וללכוד את כל הבאר.

כוונן את עוצמת הלייזר ואת רגישות הגלאי כדי לאפשר זיהוי אופטימלי של האורגנואידים המסומנים בירוק סידן על הרקע. והגדר את עומק הסיביות לשמונה ואת גודל המסגרת ל-512 על 512 פיקסלים. השתמש באפשרות סדרת הזמן כדי להגדיר את זמן המדידה, התדירות והמרווחים.

ואפשרות האריח לקבוע ידנית את מיקומי הבאר האישיים. כעת הוסף 100 מיקרוליטר של פורסקולין טרי, ו/או VX770 לבארות המתאימות, החל מהבאר הראשונה שתצולם, והתחל במדידה. בשל תפקוד לקוי של מווסת המוליכות הטרנסממברנית של סיסטיק פיברוזיס, או CFTR, רוב האורגנואידים של סיסטיק פיברוזיס במעי הגס הם קומפקטיים בגודלם ואינם מתנפחים או מפגינים מעט מאוד נפיחות 60 דקות לאחר גירוי פורסקולין, תלוי בגנוטיפ שלהם.

עם זאת, כאשר אורגנואידים של CF מטופלים במודולטורים של CFTR לפני גירוי פורסקולין, האורגנואידים מראים עלייה בנפיחות. כדי לכמת את הנפיחות, ניתן למדוד את שטחי הפנים הירוקים של הסידן בכל נקודת זמן. לאחר שליטה, ניתן להשלים את הטכניקות הללו תוך שלוש או ארבע שעות אם הן מבוצעות כראוי.

לפני שתנסה הליך זה, השלב החשוב ביותר הוא אופטימיזציה של תנאי התרבות עבור אורגנואידים במעי, שכן תרביות באיכות טובה יקבעו את הביצועים האופטימליים של בדיקת FIS. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד לעבוד עם תרביות אורגנואידים במעי ולאחר מכן למדוד את פעילות CFTR ואת תגובת מאפנני CFDR באמצעות בדיקת נפיחות הנגרמת על ידי פורסקולין.