Name: הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: למדו הכנת פרוסות אופקיות של רשתית עכבר למבוגרים לחקר תפקוד תאי אופקיים ואמקריניים. שיטה זו מאפשרת הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מדויקות באמצעות טכניקות פאץ'-קלאמפ ודימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 ו-FE464/11-1 to A.F. המחברים רוצים להודות לסיוע הטכני המצוין של אנדריאה נרץ.

כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים שהונפקו על ידי הרפובליקה הפדרלית של גרמניה. הערה: מכיוון רקמת הרשתית תהיה נטולה חמצן במהלך חלקים ממושכים של הליך זה, כל הצעדים צריכים להתבצע מהר ככל האפשר. עכברים צריכים להיות כהים מותאמים לפחות 3 שעות לפני הניתוח. כדי למנוע הסתגלות לאור ברשתית, הכנה חיתוך צריך להתבצע תחת אור אדום עמום. 1. הכנת כימיקלי מדיה אחרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן איימס בינוני 6. לאחר דיסקציה, לטבול רקמת הרשתית ב בינוני &#39;איימס בכל עת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2.2 גרם של בינוני &#39;איימס 298 HEPES מ&quot;ג ב 250 מ&quot;ל מים מזוקקים. ריכוז HEPES יהיה 5 מ&quot;מ. מערבבים בעדינות עד שכל החלקיקים המומסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני &#39;הבועה איימס בטמפרטורת החדר עם carbogen (חמצן 95%, 5% המכוניתפחמן דו בון) עבור 5 דקות לפחות. אספקת carbogen עם פיפטה פסטר זכוכית לפתרון. חבר את פיפטה פסטר דרך צינורות מתאימים לשקע של רגולטור הגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 475 מ&quot;ג-סודיום ביקרבונט לפתרון. התוספת של ביקרבונט לאחר מבעבע מונע משקעים של סידן פחמתי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן agarose gelling בטמפרטורה נמוכה. Agarose נדרש להטבעה של רקמת רשתית במהלך חתך vibratome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 180 agarose מ&quot;ג ב 9 מ&quot;ל איימס בינוני ו 1 מ&quot;ל מים מזוקקים. השתמש במיקרוגל כדי לחמם את פתרון agarose לאט עד שכל המוצקים הם מומסים. מחממים 5 - 10 במרווחים שניים כדי למנוע הצפה. הפתרון צריך להיות ברור ושקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות מומסת agarose באמבט מים ב 37 ° C למשך זמן של ההליך. </li></ol></li></ol> 2. הגדרת Vibratome הערה: כל החתך בוצע עםvibratome הנזכר בטבלת החומרים. ההגדרות שניתנו מתייחסים לסוג זה של vibratome בלבד. לפרטים נוספים על vibratome חתך של רקמה עצבית בבקשה להתייחס התייחסות 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח vibratome להב מזרק לתוך מחזיק להב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד הטיה אנכית של להב עם המכשיר &quot;vibrocheck&quot;. השתמש בורג התאמה על מחזיק הלהב כדי להטות את הלהב עד שהוא מקביל למישור החיתוך. המיקום המדויק של הלהב נחוץ כדי למנוע תופעות תריסים על פני שטח הסעיף וכדי לייצר קטע שטוח המכיל תאי חיים על פני השטח שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר vibratome להגדרות הבאות: משרעת, 1.00; מהירות, 0.20; עובי, 180 - 200 מיקרומטר. </li></ol> Dissection 3. רשתית עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש עכבר בוגר C57BL / 6 על ידי אידוי של כ 1 מ&quot;ל isoflurane במיכל אטום לאוויר. כאשר הרדמה תושלם, להרדים בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם. העכבר לא צריך להיות מעל גיל 3 חודשים, אחרת איכות הפרוסות תדרדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כדור העין על ידי הצבת מלקחיים מעוקל תחת עינו. בעדינות הרמת כדור העין יחשוף את עצב הראייה. חותכים את עצב הראייה עם מספריים באביב ולהעביר כדור העין כדי בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ המכיל 2 מ&quot;ל בינוני &#39;איימס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע כל הצעדים הבאים על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו. התאם את ההגדלה לערך המאפשרת שליטה ויז&#39;ואלי מההליכים הבאים (שלבים 3.4 - 3.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את הקרנית על המעבר בלובן העין עם מלקחיים מחודדים או מחט 20 G. במהלך שלב זה, לייצב את כדור העין עם מלקחיים אחרים. היזהר שלא לפגוע ברשתית עם מכשיר ניקוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מספרי האביב לתוך החור הקטן עשוי בשלב 3.3 וחותכי עיגול סביב הקרנית. שוב, לייצב את כדור העין עם מלקחיים תוך חיתוך. שמור החתך מאוד קרוב לפני השטח כדי לא גut לתוך הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות הקרנית, העדשה, הגוף הזגוגי עם מלקחיים. הגוף הזגוגי מהווה רק שכבה שקופה דקה בחלק האחורי של העין. עם זאת, הוא חיוני עבור vibratome חתך כי הגוף הזגוגי יוסר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת פטרי, מקם את עיינית באופן מסתכל דרך החור למטה על הרשתית. שפת הפתח צריכה להיות מורכבת של רקמות scleral בלבד. אם החתך העגול (שלב 3.4) בוצע קרוב מדי לקו המשווה של עיינית, רקמת רשתית תהיה גם קרוב הווה אל החתך. היזהר אז שלא לפגוע ברשתית בשלב 3.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את בלובן העין עם מלקחיים ובזהירות לקרוע את הרקמה בנפרד. זה חיוני שלא לקרוע את הרשתית במהלך שלב זה. במידת הצורך, לנתק את הרשתית מן serrata אורה ידי מייצבת החלק scleral של הרקמה עם מלקחיים ובזהירות קילוף הרשתית עם מלקחיים אחרות. שמור המלקחיים סגורים; מעולם להתמודד מחדשטינה עם מלקחיים מאז הרקמה היא רכות מאוד תיתן לדרך מייד. הערה: בשלב זה, הרשתית ושאר עיינית יחוברו רק בראש עצב הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את האתר המצורף בראש עצב הראייה עם מספרי האביב. הרשתית צריכה עכשיו להיות צפה בחופשיות כמקשה אחת של רקמות בינוניות &#39;איימס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרשתית לתוך 4 - 6 מלבנים קטנים של כ 23 מ&quot;מ באמצעות סכין אזמל מעוקל על ידי החזקת הרשתית בשולי עם מלקחיים, כדי לתפעל אותו למקומו. הימנע צובט את רקמת הרשתית בתוך המלבנים. קח חתיכות מן החלקים המרכזיים של הרשתית, לא בפריפריה הרחוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר חתיכות רשתית עם פיפטה פסטר פלסטיק בקוטר גדול כדי בצלחת פטרי פלסטיק 35 מ&quot;מ, החלק התחתון של אשר הוחלף על ידי רשת עם גודל הרשת פחות מ -1 מ&quot;מ. תקן את צלחת פטרי בתוך השליש העליון של בקבוק בכוס או חרוטים לצלול חתיכות רשתית bu הבינוני &#39;איימסbbled עם carbogen. </li></ol> Embedding 4. רשתית חתיכות Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות 2 - 3 חתיכות רשתית לתוך צלחת 35 מ&quot;מ פטרי מפלסטיק יחד עם כמה מן הבינוני &#39;איימס. זה הכי נוח להשתמש פיפטה פסטר מפלסטיק בקוטר גדול עבור ההעברה. בשלב זה, את הכיוון המדויק של חתיכות ברשתית לא משנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר ככל האפשר של בינוני &#39;הנותר איימס עם פיפטה פסטר זכוכית. ברגע הנוזל הוסר להמשיך בשלב 4.3. אל תתנו יבש רקמת הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לכסות חתיכות רשתית עם 2 מ&quot;ל של מומס agarose (37 מעלות צלזיוס). בהתחשב בגודל שצוין בשלב 3.10, החלקים לא להתכרבל בתוך agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך agarose הנוזל, בעדינות לדחוף חתיכות ברשתית אל החלק התחתון של צלחת פטרי. שכבת תא גנגליון צריכה לפנות כלפי מטה. שימוש במיקרוסקופ סטריאו לשיפוט של מיקום מדויק. עבור מיצוב, להתמודד pi רשתיתeces עם מרית קטנה. מקם את הרשתית מהר ומדויק ככל האפשר מאז agarose יהיה לגבש במהירות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים חתיכות רשתית במקביל לחלק התחתון של המנה זכוכית; סעיפים אחרים יהיו משיקים או אלכסוני. יצירות בודדות לא צריכות לגעת זה בזה, אך גם לא צריך להיות יותר מדי רחוק אחד מהשני. נסה להניח את חלקי רשתית פחות או יותר על אותה הרמה אופקית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים בצלחת פטרי זכוכית עם חתיכות רשתית מוטבעות לתוך המקרר (4 - C ° 6) עבור 2 דקות לפחות. זה יקשיח את agarose במהירות לעיבוד נוסף. ברגע agarose יש polymerized להמשיך לשלב הבא. </li></ol> שמת 5. הרשתית Pieces <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את גוש agarose המכיל חתיכות רשתית מצלחת פטרי. השתמש מרית או מכשיר דומה כדי להרים את הגלגלת agarose ממשטח הזכוכית. בשל כוחות דבקים, זה יכול להתברר די קשה. עם זאת, למנוע שבירלחסום agarose. לבצע זאת וכל השלבים הבאים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גוש agarose על coverslip זכוכית ולהתאים את גודל עם להב סכין המנתחים. השאר 1 - 2 מ&quot;מ של agarose בכל צד של חתיכות רשתית. הגודל הסופי של הבלוק צריך להיות סביב 1,066 מ&quot;מ (10 מ&quot;מ מתייחס לגובה של הבלוק, 6 מ&quot;מ עד אורך קצה שלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק את בלוק agarose לבעל הדגימה של vibratome באמצעות דבק מיידי. חתיכות רשתית צריכות להיות ממוקמות בחלק העליון של הבלוק הגבוה 10 מ&quot;מימ ו מכוון במקביל פני השטח שלו, בעוד שחלק התחתון מודבק לבעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הבלוק מייד על ידי מזיגה הבינונית בעבר המבעבע &#39;איימס למגש החיץ של vibratome. </li></ol> 6. הכנת הסעיפים האופקית Vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל חתך. בתחילה להגדיר את העובי של חיתוך ידני עד שברי רקמת רשתית מופיעים הפרוס. ואז לשנות את ההגדרות בשלב 2.3. מאזרשתית העכבר היא רק כ -200 מיקרומטר עבה, לא תהיינה יותר מ 2 - 3 פרוסות לכל בלוק agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סעיפים ממגש חיץ עם מוט זכוכית ולהעבירם 2 מ&quot;ל בינוני &#39;איימס בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות חלקים מיד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2/55% O 2). את agarose המקיף את החלקים יישאר מוצק בחממה והוא יכול לשמש כדי להתמודד עם החלקים ללא פגיעה ברשתית. איכות פרוסת Better מתקבלת בעת אחסון על 37 מעלות צלזיוס בתוך האטמוספרה בהתאמה לעומת הבינוני &#39;מחומצן איימס ב RT. סעיפים ניתן להשתמש מיד או ניתן לאחסן עד 4 שעות בחממה עם תוצאות פיזיולוגיות טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ חתיכות רשתית הבאות בסעיפי agarose וחזור 4 - 6. </li></ol>

<ol><li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li>
<li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li>
<li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li>
<li>Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li>
<li>Peichl, L., González-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae%3A+a+comparison+of+rat%2C+mouse%2C+gerbil%2C+and+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li>
<li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
<li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeichl%2C+L+%22Development+of+the+Retina%22">Development of the Retina</a>. , Plenum Press. New York. (1998).</li>
<li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light%2Fdark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li>
<li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+slice+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108(2006).</li>
<li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+%28Commentary+on+Feigenspan+%26+Babai%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

<html> בניגוד פרוסות אנכיות, את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים אורינטציה רדיאלית כמו תאים אופקיים ותאי amacrine נשמרה היטב. לעומת הכנות רשתית כולה, סוגי התאים אלה נגישים בקלות עבור microelectrodes ויכולים להיחקר על ידי שני טכניקות אלקטרו והדמיה. כאן, התמקדנו הרשתית החיצונית; עם זאת, גישה דומה דווחה במיוחד עבור תאי amacrine של הרשתית הפנימית 10. המאפיינים של הכנת החתך האופקית יש כמה השלכו...

מידע חזותי מקודד כדפוס במרחב ובזמן דינמיקה של הפעלת קולטי אור, ואת סינפסה הסרט בין קולטני אור ונוירונים מסדר השני קובעת את העברת הזרם של מידע חזותי. הכנת החיתוך האנכית של הרשתית היונקת היא כלי בעל ערך רב ללמוד עיבוד אותות במסלולים אנכיים, כלומר בין קולטני אור ותאים דו קוטביים, ובין תאים דו קוטביים סוגים מסוימים של תאי amacrine 1, 2, 3, 4. עם זאת, חתך אנכי תמיד גורם עיצור חמור של שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית רבים, שמוביל לאובדן ניכר של קשרים סינפטיים. במיוחד ברשתית החיצונית, תאים אופקיים מושפעים בשל שדות דנדריטים המורחבים רוחבי להפיץ שלהם ומערכות מסוף האקסון 5. בעוד אנכילהכנת פרוסה, הקלט הסינפטי של מאה מסופי photoreceptor חרוט אל דנדריטים של תא אופקי ובכך מצטמצמת כמה קשרים דלילים. זה עשוי להספיק כדי ללמוד את המאפיינים של סינפסות בודדות, אך היא עושה בשום פנים ואופן לא מייצג את יכולות עיבוד אותות שבבסיס ההפעלה המסונכרנת של סינפסות סרט קולטי אור. לפיכך, אנו פתחנו להכנת פרוסה אופקית, מה שמשאיר כמעט כל קולטי האור החרוטים קלט הסינפטי על דנדריטים תא אופקיים שלמות ומתפקד. המטוס של ריצות חתך מקביל פני השטח של הרשתית, אידיאלי חיתוך דרך שכבת הגרעין הפנימי בין תאים אופקיים ותאי amacrine. לפיכך, פרוסות אופקיות של הרשתית החיצונית נוצרות המכילות, באתר presynaptic, קולטני אור עם פלחים פנימיים וחיצוניים וכן מסוף הסינפטי, ותאים אופקיים תאים דו קוטביים באתר הפוסט-סינפטי. הכנה זו מתאימה היטב to לחקור תשומות הסינפטי מתואמות לתוך דנדריטים תא אופקיים על ידי כל קולטני האור חרוט בתוך השדה הדנדריטים שלו. זה ובכך עשוי להיות שימושי כדי להבין טוב יותר את פעולתו של סינפסה סרט קולטי האור, שהוא חיוני להעברת מידע חזותי מהמטריצה ​​של הפעלת קולטי האור לתוך תגובה postsynaptic.

<table><tbody><tr><td>איימס</td><td>סיגמא</td> בינוני <td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>קרבוגן</td><td>אוויר נוזלי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 35 מ"מ (פלסטיק)</td> <td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית פטרי צלחת</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dispensary בית חולים</td><td></td><td></td>אוניברסיטאי</tr><tr><td>להב מזרק Vibratome</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים למיקרוגל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 גרם מחטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td>אביביים</tr><tr><td>להבי</td><td></td><td></td><td></td>אזמל מעוקלים</tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>סטריאו פלסטיק</tr><tr><td>פסטר פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית פסטר פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

הכנות פרוסות אנכיות מבוססות היטב ללמוד מעגלים והעבירו אותות ברשתית של יונקי הבוגרים. המטוס של חתך בהכנות אלה הוא בניצב לפני שטח הרשתית, מה שהופך אותו אידיאלי לחקר נוירונים רדיאלית אורינטציה כמו קולטני אור ותאים דו קוטביים. עם זאת, סוכות דנדריטים הגדולות של תאים אופקיים, תאי amacrine רחב בתחום, ותאי גנגליון הן בעיקר קטומות, עזב פעילות סינפטית מופחתת במידה ניכרת בתאים אלה. בעוד תאי גנגליון ותאי amacrine העקורים ניתן ללמוד הכנה שלמה הרכובה של הרשתית, תאים אופקיים ותאי amacrine ממוקמים שכבת הגרעין הפנימית הם רק גרוע נגישים עבור אלקטרודות ברקמת רשתית כולה. כדי להשיג נגישות מקסימלית ויושרה הסינפטי, פתחנו תכשיר חתך אופקי של רשתית העכבר, ולמדו להעברת אות ב הסינפסה בין קולטני אור ואופקיתאים. חתך אופקי מאפשר (1) זיהוי חזותי קל וחד משמעי של גופי תא אופקיים מיקוד אלקטרודה, ו (2) שמירה על שדות דנדריטים תא אופקי המורחבים, כתנאי מוקדם קלט הסינפטי חרוט שלם ופונקציונלי דנדריטים תא אופקיים. תאים אופקיים מן הפרוסות אופקיות הציגו פעילות סינפטית טוניק בחושך, והם הגיבו לתדרך הבזקי אור עם ירידה של פעילות סינפטית נוכחית והפחיתה פנימה. ראיות Immunocytochemical מציין שכמעט כל קונוסים בתוך השדה הדנדריטים של תא אופקי להקים סינפסות עם דנדריטים ההיקפיים. בהכנת הפרוסה האופקית ולכן מתאימה גם ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של נוירונים ברשתית להאריך אותה אופקית כמו גם להעברת אות חושית ואינטגרציה ברחבי סינפסות שנבחרו.

<html> ב פרוסות אופקיות של רשתית העכבר, גופי תא אופקיים ניתן היו לזהות בקלות על פי המורפולוגיה הייחודית שלהם עם מספר דנדריטים העיקרי העולה מתוך (איור 1 א) גוף תא מצולעים. גופי התא האופקיים סמוך לפני השטח של הפרוסה היו נגישים באופן שגרתי עבור אלקטרודות מהדק תיקון. במהלך הקלטות, תאים היו מלאים צבע פלואורסצנטי, חושף arborization הדנדריטים שלהם המורכב, שדמה את המורפולוגיה של תאים אופקיים נושאות האקסון של רשתית העכבר השלמה <sup class="xr...

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

המטרה הכללית של הכנת חתך אופקי של רשתית העכבר היא לשמר את השלמות המורפולוגית והפיזיולוגית של נוירונים בעלי אוריינטציה אופקית, וזאת כדי לחקור את תפקידם התפקודי במעגלים סינפטיים של הרשתית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום עיבוד המידע החזותי, כגון האופן שבו אותות חושיים מקודדים ומסונכרנים בסינפסות הסרט (ribbon synapses) של הרשתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שנוירוני ביניים בעלי אוריינטציה אופקית, כגון תאי אופק (horizontal cells) ותאי אמקרין (amacrine cells), נשארים תקינים מבחינה תפקודית ונגישים להקלטות אלקטרוניות.את הפרוצדורה תדגים אנדראה נרץ, טכנאית במעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הוציאו את גלגל העין על ידי הנחת פינצטה קמורה מתחת לעין. הרימו בעדינות את גלגל העין כדי לחשוף את העצב האופטי וחתכו אותו בעזרת מספרי קפיץ.לאחר מכן, העבירו את גלגל העין לצלוחית פטרי של 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר של מצע AMS. תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, כווננו את ההגדלה לערך המאפשר בקרה ויזואלית אופטימלית. לאחר מכן, ייצבו את גלגל העין באמצעות פינצטה ונקבו את הקרנית במעבר ללובן העין בעזרת פינצטה מחודדת אחרת או מחט בכיול 20 gauge.הקפידו לא לפגוע ברשתית בעת ניקוב הקרנית. לאחר מכן, הכניסו את מספרי הקפיץ לתוך החור הקטן. ייצבו את גלגל העין באמצעות פינצטה בעודכם גוזרים מעגל מסביב לקרנית, והשאירו את החתך קרוב מאוד לפני השטח כדי לא לחתוך לתוך הרשתית.הסר בזהירות את עדשת הקרנית ואת הגוף הזגוגית. הגוף הזגוגית מורכב משכבה שקופה ודקה בלבד בחלקו האחורי של העין. עם זאת, חיוני להסיר את הגוף הזגוגית במלואו לצורך חיתוך בויברטום.בתוך צלחת הפטרי, מקמו את גביע העין כך שייראה חור ברור עד לרשתית. שולי הפתח צריכים להיות מורכבים מרקמת הלובן (sclera) בלבד. לאחר מכן, תפסו את הלובן בעזרת פינצטה וקרעו בזהירות את הרקמה.קריטי להקפיד לא לקרוע את הרשתית בשלב זה. בשלב זה, הרשתית ושאר גביע העין צריכות להיות מחוברות אך ורק בראש עצב הראייה. גזרו את נקודת החיבור בראש עצב הראייה באמצעות מספרי קפיץ.הרשתית צריכה כעת לצוף בחופשיות כחתיכת רקמה אחת בתווך AMS. לאחר מכן, העבירו את הרשתית לזכוכית כיסוי באמצעות פיפטת פסטור בעלת קוטר גדול, וחתכו את הרשתית לארבע עד שש מלבנים קטנות של כ-2x3 מילימטרים רבוע באמצעות להב סקלפל מעוקל. הימנעו מצביטה של רקמת הרשתית בתוך המלבנים.בפרוצדורה זו, העבירו בזהירות שתיים עד שלוש חתיכות רשתית לתוך צלחת פטרי מזכוכית יחד עם מעט מתווך ה-AMS באמצעות פיפט פסטור מפלסטיק בעל קוטר גדול. הסירו כמה שיותר מתווך ה-AMS הנותר באמצעות פיפט פסטור מזכוכית. לאחר מכן, כסו מיד את חתיכות הרשתית בשני מיליליטר של אגרוז מומס בטמפרטורה של 37 degree Celsius.דחפו בעדינות את חלקי הרשתית לתחתית צלחת הפטרי. מקמו את שכבת תאי הגנגליון כך שתפנה כלפי מטה במהירות ובדיוק רב ככל האפשר, כיוון שהאגרוז מקריש במהירות. במקביל, סדרו את חלקי הרשתית כך שיהיו מקבילים לתחתית צלחת הזכוכית כדי למנוע מהחתכים להפוך למשיקיים או אלכסוניים.לאחר מכן, העבירו את חתיכות הרשתית המוטמעות למקרר כדי להקשיח את האגרוז לפני המשך העיבוד. כעת, הפרידו בזהירות את בלוק האגרוז המכיל את חתיכות הרשתית מבתרי הדש. השתמשו בלהב סקלפל כדי להרים בזהירות את בלוק האגרוז מהזכוכית.לאחר מכן, הנח את בלוק האגרוז על לביש 유리 (cover slip). התאם את גודלו באמצעות להב סקלפל והשאר מילימטר אחד עד שניים של אגרוז מכל צד של חתיכות הרשתית. לאחר מכן, הדבק את בלוק האגרוז למחזיק הדגימות של הוויברטום באמצעות דבק מהיר.כסו את הבלוק מיד על ידי מזיגת מצע AMS שהובעב מראש לתבנית הבאפר של הוויברטום. בדמות זו, תא אופקי הממוקם סמוך לפני השטח של הפרוסה הודגם באמצעות אופטיקת ניגודיות נקודתית. תמונה זו מראה תא אופקי שמולא ב-Oregon Green 488 BAPTA-1 באמצעות אלקטרודת פץ' שעדיין הייתה מחוברת לתא.מוצג כאן מיזוג (overlay) של תא אופקי שהוזרק בו צבע ומערך של פדיקלים של קונוסים המסומנים ב-fluouisine coupled peanut agglutinin, אשר חושף את מגעי הסינפס המשוערים. באיור זה, רישום voltage clamp של תא שלם בפוטנציאל החזקה של 60- millivolts מראה פעילות סינפטית טונית בתדר גבוה. ברזולוציה זמנית גבוהה יותר, אירועים סינפטיים מציגים צורות גל מונופזיות או מסלולי זרם מורכבים יותר.באיור זה מוצגת תגובה זרמית של תא אופקי לגירוי של אור. אור גורם לסגירה של תעלות יונים ולחסימה של פעילות סינפטית. ובאיור זה פוטורצפטורים מסוג קונוס עוררו חשמלית באמצעות אלקטרודה חוץ-תאית.זרמים עירוריים פוסט-סינפטיים הם מדורגים בהתאם לעוצמת הגירוי. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע הליך זה בפחות משעה אם הוא מבוצע כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון דימות סידן כדי להשיב על שאלות נוספות, כמו עיבוד מידע חזותי ברשתות הרטינה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן חיתוך פרוסות אופקיות של רשתית יונקים עם קלטים סינפטיים תפקודיים לסוגי תאים בעלי התפשטות אופקית.

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

באופן מסורתי פרוסה האנכי והכנת כל הר של הרשתית שימשו ללימוד פונקציה של מעגלים הרשתית. כאן, אנו מתארים את הרומן חיתוך שיטה לשמר את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים ברשתית ללא פגע.

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

סרטון זה מדגים טכניקת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה. פיפטת זכוכית דקה עם אלקטרודה משמשת להתקרבות לתאים אמקריניים מתפוצצים בכוכבים (SACs) בתוך הרשתית. לאחר יצירת חותם, היניקה מוחלת כדי לקרוע את הממברנה וליצור את תצורת מהדק טלאי התא כולו. לבסוף, זרימת היונים דרך קולטני SAC סינפטיים נמדדת באמצעות התצורה.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה

הסרטון מתאר את ההקלטה האלקטרופיזיולוגית של סינפסות רטינוגניקולאט וקורטיקוגניקולאט בפרוסות מוח של עכבר. הפרוסות המכילות את גרעין הגניקולאט הגבי הצידי (dLGN) ממוקמות בתא הקלטה. פיפטה מגרה ממוקמת על מערכת הראייה כדי לעורר תאי גנגליון ברשתית (RGCs) ולחקור סינפסות רטינוגניקולאט, או את גרעין הרשתית תלאמי כדי לעורר נוירונים בקליפת המוח ולחקור סינפסות קורטיקוגניקולטיות. עם הגירוי, ה-RGCs והנוירונים בקליפת המוח משחררים מוליכים עצביים מעוררים, אשר מייצרים זרמים סינפטיים בנוירוני ממסר LGN. זרמים אלה...

מחקר אלקטרופיזיולוגי של סינפסות רטינוגניקולאט וקורטיקוגניקולאט בפרוסות מוח עכבר

מקור: Laboissonniere, et. al. רצף RNA של תא בודד של תת-קבוצות מוגדרות של תאי גנגליון ברשתית. J. Vis. exp.{{}} (2017).  }סרטון זה מדגים טכניקת מעקב פלואורסצנטית לזיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) ברשתית של עכבר טרנסגני. התהליך כולל אבטחת הרשתית המבודדת בתא הקלטה, שמירה על כדאיות התא עם זלוף מחומצן, והתמקדות ב-RGCs עם תווית פלואורסצנטית באמצעות פיפטה עם עוקב. על ידי ניתוח מורפולוגיה וריבוד דנדריטי, השיטה מאפשרת סיווג של תת-סוגים מובהקים של RGC.

זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

הוסר לאחר מהגוף, רקמה עצבית היא השפיעה מאוד על ידי תנאים סביבתיים, המוביל השפלה הסופי של רקמות לאחר 6 - 8 שעות. באמצעות שיטת דגירה ייחודית, אשר מקיימים מעקב קפדני אחרת ומסדירה את הסביבה התאית של הרקמות, כדאיויות רקמות ניתן להאריך באופן משמעותי עבור&gt; 24 שעות.

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

למדו הכנת פרוסות אופקיות של רשתית עכבר למבוגרים לחקר תפקוד תאי אופקיים ואמקריניים. שיטה זו מאפשרת הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מדויקות באמצעות טכניקות פאץ'-קלאמפ ודימות.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

גלה סרטונים נוספים