Name: ניתוח אופטימלי של In vivo ו במבחנה כבדית steatosis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: למד שיטות מיטביות ליצירה ואפיון של steatosis כבדית באמצעות גישות in vivo ובמבחנה. השיטות מאפשרות הערכה לא פולשנית של מחלות מטבוליות כמו מחלת כבד שומני, עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מעריכים את פייפיי ז'אנג על הדיונים המועילים. אנו אסירי תודה לג'ינג גאו ויי-שואן סון על הסיוע הטכני ולג'נגשואי ליו ופנג-גואנג מא על המחקרים בבעלי חיים.

כל פרוטוקולי הניסוי בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת טיפול שימוש בבעלי חיים המוסדית במכון למדעי תזונה, המכונה שנחאי עבור מדעי ביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים (שנחאי, סין). 1. במודל עכבר DIO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האכלת HFHS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את העכברים שמונה שבועות בן זכר C57BL / 6 עם HFHS המכיל 40 שומן קלוריות% סוכרוז% 40 קלוריות. לשכן אותם 12 שעות בתנאי מחזור כהה אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על עכברים במצב דיאטה האכלה HFHS במשך ארבע עד שש עשרה שבועות. בדוק שבועון משקל גוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הרכב הגוף ועל ניתוח התמונה פסאודו צבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא העכברים לניתוח מנתח הרכב הגוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure מודע, עכברים הרדים לא בתוך שפופרת פלסטיק. מדוד את מסת השומן בגוף, מסת גוף רזה, ונוזלים באמצעות מערכת NMR, כפי שתואר לעיל 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את כל הגוף של כל עכבר באמצעות מערכת MRI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים עם 1% Avertin באמצעות הזרקה הזרקה (25 μL / g) ולבצע ניתוח הדמיה צינורות זכוכית מיוחדים. הערה: תהליך ההדמיה נמשכת כמעט 0.5 שעות עבור כל עכבר. בסיום הבדיקה תושלם, להחזיר את העכברים לכלוב שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הגופים השלמים של עכברי גב, באמצע, ושכבות גחון; לסרוק את הכבד בכיוון האנכי. להשתמש במגנט 0.55 T והפרמטרים אינסטרומנטלי הבאים: שטח K = 192 x 256 מיקרומטר, עובי סעיף = 3 מ&quot;מ, TE = 14.8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 מ&quot;מ, FOVPhase = 100 מ&quot;מ, ומספר סריקות = 8. סריקה באמצעות אותו המצב מגנטי עבור כל הקבוצות של עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפה את התמונה בגוונים האפורה על גבי תמונה פסאודו צבע בהתאם לאות בעצמה 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתת חסד עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר dissectiכלי ng, כגון מלקחיים ומספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים isoflurane מספיק על מגבת נייר ולתת isoflurane לנדוף בתוך צנצנת זכוכית. ודא כי עכברים מומתים על ידי isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן העכברים על שולחן הניתוחים. ריסוס כל הבטן עם אתנול 75%, עושים חתך הדרמיס של תהליך xiphoid באמצעות מספריים, ולקרוע את הדרמיס לאורכו דרך קו האמצע עם הידיים כדי לחשוף את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את תהליך xiphoid עם מלקחיים לחתוך את לרוחב הצפק דרך התחתון של הצלעות לחשוף את הקרביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם צינורות מצופים EDTA על ידי לנקב לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הסרעפת לאורך הכבד ובזהירות להסיר את הכבד מן enterocoelia באמצעות מספריים בסדר. חותכים שלוש חתיכות של רקמת הכבד למדידות השומנים הבאים: א) 6 x 3 x 3 מ&quot;מ עבור צביעת H &amp; E, B) 6 x 3 x 3 מ&quot;מ עבור מכתים O אדום שמן, ו- C) 20-40 מ&quot;ג של הכבד עבור כלורופורם / מיצוי מתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת H &amp; E <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן הכבד אצטט פורמלין 4% שנאגרו פוספט ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ואז להטביע אותו שעוות פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חלקים פרפין (5 מיקרומטר) ו הר להם על שקופיות זכוכית צביעת H &amp; E, כפי שתואר לעיל 3, 10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים שמן האדום O <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Regent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון עובד שמן האדום O עם 10% פורמלין, 60% isopropanol, Hematoxylin, וריבת גליצרול. ממיסים 0.5 גרם של אבקת O האדום שמן עם 100 מ&quot;ל של isopropanol ומחממים אותו באמבט C 60 ° לעשות פתרון המניה 0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל עם מים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O) בכל 3: יחס 2 (3 מ&quot;ל של פתרון המניות ו -2 מ&quot;ל של DDH 2 O). סנן את הפתרון עובד ולתת לעמוד במשך 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ הכבד בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (אוקטובר) מתחם apתיבת הטבעה lastic. להקפיא אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. חותכים אותו לחלקים 8-מיקרומטר בתוך microtome מקפיא, הר רקמת בשקופית, ולמקם אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגבת נייר בתחתית גיגית מכתים לשפוך כמות קטנה של פורמלין 10% להרטיב מגבת נייר. מניחים את השקף באמבטיה מכתים ולתקן את הסעיפים קפוא אדי פורמלדהיד במשך 5 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופית isopropanol 60% באמבטיה מכתים עבור 3 s; לחזור פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמה טיפות של תמיסת עבודה האדומה שמן O לשקופית כדי לכסות את כל רקמות דגירה במשך 15 דקות. הגן על הרקמות מפני אור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את שקופית isopropanol 60% החדשים באמבטיה המכתימה עבור 3 s; וחזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את והחלק דרך מים מזוקקים פעמיים ולהסיר את המים סביב הרקמה. הקפד לא לייבש את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף ב Hematoxylin דקות 1 ולשטוף בעדינות עם מי ברז למשך 5-10דקות. לשטוף בעדינות את השקף במים מזוקקים פעמיים ולשמור על אותו במים מזוקקים עד מוכן לשים על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממו את ג&#39;לי גליצרול במיקרוגל ומניחים כמה טיפות על גבי הרקמה. בעדינות במקום coverslip על גבי ולדאוג שלא ליצור בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הכתם מתחת למיקרוסקופ ללכוד תמונות מאפיינות באמצעות מטרות 20X ו 40X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת שומנים בכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את רקמת הכבד גזור צינור צנטריפוגות 2 מ&quot;ל פלסטיק חדש. Homogenize ב 1 מ&quot;ל של PBS עם homogenizer ולהעביר את lysate אל צינור זכוכית 15 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של כלורופורם / מתנול (2: 1, V / V) פתרון, מערבולת את התערובת במרץ דקות 1, ולתת לעמוד במשך 2 שעות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1,650 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס; התערובת צריכה להתחלק 3 שכבות: שכבת מתנול העליונה, דיסק החלבון באמצע, ואת כלורופורם ושומנים התחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טראן<html> ספיר השלב התחתון לתוך צינור זכוכית חדש באמצעות pipet זכוכית פסטר; אין צורך לקבל כל טיפה של השבר התחתון. הגדר את הצינור בצד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600 μL של 4 מ&quot;מ MgCl 2 ו -1.5 מ&quot;ל של כלורופורם לשבר supernatant עזב בצינור מערבולת הקודם במרץ. דגירה על קרח למשך 30 דקות ו צנטריפוגות ב 1,650 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את השלב התחתון עם צינור השלב התחתון הראשון באמצעות pipet פסטר. מחק את השכבות הגבוהות ובינוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות את כלורופורם תחת גז חנקן באמבט 37 מעלות צלזיוס. שטפו את צידי צינורות זכוכית ביסודיות עם 200 μL של 1% Triton X-100 / כלורופורם (v / v). להתאדות תחת גז חנקן. ממיסים את השומנים עם 200 μL של DDH 2 O ו מערבולת היטב כדי להפוך את תחליב הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הטריגליצרידים הכולל (TG) וכולסטרול (TC) רמות באמצעות ערכת טריגליצרידים או כולסטרול על פי פרוטוקול של היצרןXref &quot;&gt; 3. הערה: ערכי השומנים הם מנורמלים לאלה של ריכוזי חלבון homogenate הראשוני, כפי שנקבעו על ידי חלבון כימות 3. </li></ol></li></ol> 2. דגם ראשונים העכבר Hepatocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של hepatocytes העיקרי העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים כל עכבר עם 6% הכלורל-הידרט (10 μL / g intraperitoneally). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד hepatocytes העיקרי, כפי שתואר לעיל 10. לגדל תאים על coverslips זכוכית מצופה קולגן צלחת 6-גם עבור מכתים O האדום השמן. להפקת שומנים בדם, זרע התאים על צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים 10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאי והכתים O האדום השמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עם 2 מ&quot;ל של מדיום רעב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. טפל בו עם 30 גלוקוז מ&quot;מ ו -100 אינסולין ננומטר. דגירה זה תרבות חממת 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום. הוסף 2 מ&quot;ל של PBS ו מערבולת בעדינות כדי לשטוף את בינוני; לחזור פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את coverslip לשקופית עם גומייה. לחשוף את התאים חסידים אל פני השטח החיצוניים. בצע את מכתים O האדום השמן כפי שתואר לעיל (שלב 1.5). הערה: רמות הבסיס של הצטברות שומנים הם מגורה עם טיפול גלוקוז בתוספת אינסולין גבוה לאחר רעב בסרום. טיפות השומנים הם דמיינו ידי מכתים שמן האדום O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת שומנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את hepatocytes עם גלוקוז גבוה בתוספת אינסולין באותו המצב (שלב 2.2.1). הוסף 1 מ&quot;ל של PBS על כל צלחת תרבית תאים של 10 ס&quot;מ. לגרד את התאים למסוק אותם לתוך צינורות זכוכית חדש 15 מ&quot;ל, שממנו aliquots של 100 μL מועברים צינורות 1.5 מ&quot;ל טריים כימות חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של כלורופורם / מתנול (2: 1, V / V) על 900 μL של התאים הנותרים. Sonicate במשך 20 צפצופים המשוער ולאחר מכן מערבולת במרץ לשחררהשומנים בתאים. דגירה את התערובת על קרח למשך 2 שעות. בצע את מיצוי השומנים (שלב 1.6). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Angulo, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11961152">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li>
<li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li>
<li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li>
<li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fatty+liver+disease%3A+old+questions+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li>
<li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li>
<li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li>
<li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23507799">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע טבעי של סין (מס &#39;81,270,930, 31,471,129, ו 31,671,224) והתכנית מאה ככר האקדמיה הסינית למדעים (2013OHTP04) כדי י.ל.

NAFLD היא סדרה של מחלות כבד מתקדמת אשר מזוהה עם תסמונת מטבולית, השמנה, עמידות לאינסולין, או סוכרת סוג 2 (T2DM) 11. המאפיין העיקרי של NAFLD הוא steatosis, הצטברות של שומנים hepatocytes. הנה, קשת של שיטות מוצגת לאפיין את פנוטיפים ופרמטרים של steatosis בכבד באמצעות עכברי DIO ו hepatocytes העיקרי עכבר. הליך זה יכול להיות מועיל על מנת להבהיר את המנגנונים המולקולריים של NAFLD ומחלות מטבוליות נלוות אחרות. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direct...

השמנה היא בעיה בריאותית המתפתחת במדינות מפותחות ומתפתחות. זה כבר דווח להיות אחד מחלות רקע קשורה לעיתים קרובות עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עם שכיחות הנע בין 30 ל -100 אחוזים בחולים NAFLD 1. בשל הקשר החזק בין כבד שומני והשמנה, שמנים-induced דיאטה (DIO) במודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים מורכבים הקשורים בפיתוח NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Steatosis כבדיה היא השלב המוקדם של NAFLD, וזה יכול להתקדם steatohepatitis אלכוהולי (NASH), שחמת כבד, ובסופו של דבר, סרטן כבד 7. לכן, המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור מודלים של בעלי חיים ותא של תנאי steatotic בכבד ל- PRפרוטוקולי ovide מפורטים למדידת שומנים יעילה ומדויקת. מודלים ומדידות אלה שימושיים גם עבור החקירה של הפרעות מטבוליות אחרות, כגון עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2. כפי מזוהה שמן להיות אחד מגורמי הסיכון המרכזיים עבור NAFLD, א-שומן גבוה, סוכרוז דיאטה (HFHS) המחקה את הדיאטה עתיר שומן בסגנון המערבי משמשת לגרום להשמנה בעכברים. בהמשך לכך, מידת steatosis הכבד ניתן להעריך באמצעות שיטות שונות. ראשית, משקל הגוף וניתוח הרכב הגוף עם תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להראות את הצטברות השומנים במהלך שעת ההאכלה. מסת שומן המסה רזה ניתן לכמת באופן פולשני בזמן אמת. בנוסף, הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) משמשת כדי להראות הוא את הגוף ואת חלוקת הכבד של שומן. האות בגווני אפור של ניתוח MRI ניתן להמיר תמונה פסאודו צבע קריא, ואת עוצמתאת הגוון האפור והצבע הוא חם לכימות. טכנולוגיה זו מספקת יתרונות ייחודיים למדידת הצטברות שומנים בבעלי חיים. שנית, ניתוח היסטולוגית של הכבד הוא השיטה הנפוצה ביותר כדי לקבוע steatosis בכבד. מכתים Hematoxylin ו Eosin (H &amp; E) מספק מידע היסטולוגית, כגון מורפולוגיה hepatocyte וחדירה מקרופאג, בעוד מכתים האדום O שמן מראה את הגודל והמיקום של טיפות השומנים ב hepatocytes. שלישית, ניתוח תוכן השומנים באמצעות מיצוי כלורופורם / מתנול הוא מדידה מדויקת וכמותית של שומנים בכבד. רמות הטריגליצרידים והכולסטרול סה&quot;כ ניתן למדוד עם שיטות ביוכימיות. חשוב לציין, ניתוח שאיבת שומנים מכתים האדום O שמן יכול לשמש גם מניפולציה גנטית או hepatocytes מטופלים pharmaceutically. היתרון של השיטה הנוכחית הוא הניצול של גישות אופטימיזציה מרובות כדי ליצור מודלי steatotic כבדיםולאפיין את פנוטיפים הוא in vivo ו במבחנה מקיפה. המודלים העכבר DIO יכול לשחזר את פנוטיפים פתולוגיה מטבולית של מחלת כבד שומני האדם. פרמטרים מטבוליים אחרים בבני אדם ניתן לשכפל במודל זה, כמו גם 8. הדור של מודל hepatocyte steatotic בתגובה גבוהה גלוקוז בתוספת אינסולין יעיל, שימושי, מתגבר על מגבלה של עבודה עכבר זמן רב ויקר. יחדיו, שיטות אלה מספיקות וחיוניים לחקר תפקוד ועמידות לאינסולין שומנים בכבדים במהלך עומס יתר מזין.

<table><tbody><tr><td>תרכובת O.C.T</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>שמן אדום O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טריגליצרידים אינפיניטי</td><td>Fisher&nbsp; סיינטיפיק</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>אינפיניטי כולסטרול</td><td>קיט פישר&nbsp; Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מסוג I, זנב עכברוש</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (גלוקוז נמוך)</td> <td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>מתמוסס ב-PBS, 1 מ"מ למלאי</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 10 ס"מ צלחת</td><td>קורנינג</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA מבחן</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>תהודה מגנטית גרעינית</td><td>טכנולוגיית Niumag</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>דיאטה עתירת שומן (HFHS)</td><td>דיאטות מחקר</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח אופטימלי של<em&gt; in vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

הקמת מערכת נהלים לאפיון איכותי וכמותי של סטיאטוזיס בכבד in vivo ו-in vitro חשובה למחקר מטבולי בכבד. כאן, מתוארות בדיקות רבות כדי למדוד באופן מקיף את הפנוטיפ והפרמטרים של סטיאטוזיס בכבד במודלים של עכברים והפטוציטים. 
בשילוב השיטות הפיזיולוגיות, ההיסטולוגיות והביוכימיות, ניתן להשתמש במערכת זו כדי להעריך את התקדמות הסטיאטוזיס בכבד. in vivo, מדידות משקל הגוף והתהודה המגנטית הגרעינית (NMR) מספקות הבנה כללית של עכברים בצורה לא פולשנית. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) ושמן אדום O קובעים את המורפולוגיה ההיסטולוגית ואת שקיעת השומנים של רקמת הכבד בתנאי עומס יתר של חומרים מזינים, כגון הזנה דיאטטית עתירת שומן. לאחר מכן, תכולת השומנים הכוללת מבודדת על ידי מיצוי כלורופורם/מתנול, ולאחר מכן ניתוח ביוכימי לטריגליצרידים וכולסטרול. יתר על כן, הפטוציטים ראשוניים של עכברים מטופלים בגלוקוז גבוה בתוספת אינסולין כדי לעורר הצטברות שומנים, מודל יעיל במבחנה לחיקוי היפרגליקמיה הנגרמת על ידי דיאטה והיפראינסולינמיה in vivo. לאחר מכן, שקיעת השומנים נמדדת על ידי צביעת שמן אדום O ומיצוי כלורופורם/מתנול. צביעת שמן אדום O קובעת פנוטיפים סטאטוטיים אינטואיטיביים בכבד, בעוד שניתוח מיצוי השומנים קובע את הפרמטרים שניתן לנתח סטטיסטית. הפרוטוקולים הנוכחיים מעניינים מדענים בתחומי מחלות כבד שומני, עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2.

כפי שניתן לראות בתרשים 1 א &#39;, משקל גוף העכבר הוגדל ל 45 ± 1.2 גרם לאחר 16 שבועות של האכלת HFHS, וזה בערך פי 1.5 גבוה יותר מאשר קבוצת האכלת דיאטת צ&#39;או. הרכב הגוף NMR ניתוחי מראה את מסת השומן ומסת רזה של עכברים מסומנים (איור 1B). התפלגויות השומן של הגוף ושל הכבד נקבעו על ידי בדיקת MRI, ותמונות פסאודו צבע נציג בעכברים חיים, מודעים מוצגות באיור 1C-D. הגוף במשקל גוף הרכב נמדד ו מדמיין תוך כדי תה...

כאן מתוארות שיטות מותאמות ליצירת מודלים in vivo ו-in vitro של סטיאטוזיס בכבד ולניתוח הפנוטיפים הסטאטוטיים והפרמטרים הפיזיולוגיים הקשורים.

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לספק שיטה מותאמת להפקה ואפיון של Steatosis כבדי באמצעות גישות In Vivo ו-In Vitro. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במחקר מכניסטי של דה-רפליקציה כבדית של חילוף חומרים של ליפידים וגלוקוז במהלך עומס תזונתי והשמנה. יתרון אחד של טכניקות אלו הוא שניתן להעריך את ההתקדמות הפיזיולוגית של Steatosis כבדי באופן לא פולשני לפני ביצוע ניתוח היסטולוגי וביוכימי.שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מחלת כבד שומני. ניתן ליישמה גם על מחלות מטבוליות אחרות, כגון עמידות לאינסולין, סוכרת מסוג II והשמנה. את הפרוצדורה ידגימו Zhimin, Yamei ו-Aoyuan.כולם סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי העוסקים בבקרת השעתוק של חילוף חומרים של ליפידים וגלוקוז. לאחר הרדמה של העכבר התורם, קחו דגימת דם באמצעות ניקור לב ואספו את הדם למבחנה עם EDTA. כדי להוציא את הכבד, חתכו את הסרעוף לאורכו של הכבד והוציאו אותו בזהירות מה-entero colia.מהכבד, הכין שני בלוקים של רקמה לצביעת H and E ולצביעת Oil Red O. שמור את שארית הרקמה למדידת תכולת הליפידים, עבורה נדרשים לפחות 20 milligrams. לאחר הכנת תמיסת מלאי בריכוז 0.5% מ-Oil Red O מאבקה, דלל אותה לתמיסה בריכוז 0.3% במים וסנן את התמיסה המדוללת דרך מסנן של 0.22 micron.לאחר מכן, יש להניח לתמיסה לשקוע במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש להטמיע את הכבד בתרכ

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה, אנו מדגימים צביעה חוץ גופית של שומנים ניטרליים בהפטוציטים כדי לזהות סטאטוזיס בכבד או הצטברות שומן מופרזת בכבד. עודף שומן מצטבר בתאים בצורה של טיפות שומנים. שמן אדום O הוא צבע מסיס שומנים שנקשר לשומנים ניטרליים תוך תאיים בטיפות שומנים אלה. כאשר נצפים תחת מיקרוסקופ אור, טיפות שומנים תוך תאיות אלה מופיעות בצבע אדום עז.

שמן אדום O צביעה: טכניקה להכתמת שומנים ניטרליים ב hepatocytes לגילוי סטאטוזיס בכבד במבחנה

lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

הדו"ח הנוכחי מתאר בדיקה אנזימטית במבחנה למדידת פעילות פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז באמצעות תמציות תאי לישמניה. בדיקה זו מבוססת על העברה של קבוצת מתיל רדיואקטיבית מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine על פוספטידיל-אתנולמין אנדוגני.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגרימת הכבד שלפוחית השומן בתאי HepaRG עם חומצות שומן מלח נתרן לרדוף ולהעסיק שיטות זיהוי וכימות של הצטברות שומנים בדם, כולל anti-סטוקס קוהרנטי פיזור ראמאן (מכוניות) מיקרוסקופ, ניתוח ציטופלוורימטרי, שמן אדום כתמים ו-qPCR.

גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG

פרוטוקול זה נועד להיות כלי לחקר סטאטוזיס ואת השינויים המולקולריים, הביוכימיים, התאיים המיוצרים על ידי חשיפה יתר של hepatocytes שומנים במבחנה.

מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

באמצעות מודל עכבר של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) הנגרמת על ידי דיאטה, אנו מתארים את השימוש בטכניקות הדמיה מיקרו-ממוחשבות חדשניות in vivo כשיטה לא פולשנית להערכת שלבי ההתקדמות של NAFLD, תוך התמקדות בעיקר ברשת כלי הדם בכבד בשל מעורבותה המשמעותית בחוסר ויסות כבד הקשור ל- NAFLD.

רומן in vivo טכניקות הדמיה טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להערכת ההתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי

במסמך זה, אנו מדגימים פרוטוקול מותאם BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות לאפיון טיפות שומנים ברקמת הכבד. באמצעות שימוש בהקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, הפלואורופור מאפשר הבחנה מוצלחת בין סטאטוזיס מיקרו-שלפוחית וסטאטוזיס מקרו-שלפוחית ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים להערכת סטאטוזיס בכבד.

ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

מאמר זה מתאר את השימוש בתאי HepG2 הנגרמים על ידי חומצה אולאית כמודל למחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי.

מידול חוץ גופי של שקיעת שומן במחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי

מערכת אופטית שפותחה לדמיין microcirculation כבד עם אריתרוציטים FITC, שכותרתו למדוד את הלחץ החלקי של החמצן microvessels עם phosphorimetry בסיוע לייזר. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים על ידי ניתוח מבנה בקוטר כלי הדם, זרימת דם מהירות, ומתח החמצן.

הדמיה וניתוח של זרימת הדם ואת צריכת החמצן microcirculation כבד: בקשה דגם הפטיטיס חריפה

למד שיטות מיטביות ליצירה ואפיון של steatosis כבדית באמצעות גישות in vivo ובמבחנה. השיטות מאפשרות הערכה לא פולשנית של מחלות מטבוליות כמו מחלת כבד שומני, עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2.

ניתוח אופטימלי של

גלה סרטונים נוספים