לא פולשני בויבו פלואורסצנטי הדמיה אופטית של פעילות MMP דלקתית באמצעות Activatable פלואורסצנטי סוכן הדמיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בהדמיה אופטית כדי לדמיין בדיקה הניתנת להפעלה להערכת הפעילות in vivo של מטאלופרוטיזות מטריצת מפתח, או MMPs, במודלים ניסיוניים של דלקת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי המנגנון הביולוגי הבסיסי במחלות דלקתיות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מהירה, זולה וקלה ללמידה.

יתר על כן, מגוון גדול של בדיקות להתמקדות בתהליכים ביולוגיים שונים זמין. לאינדוקציה של דלקת מפרקים שגרונית, השתמש תחילה במיקרומטר כדי למדוד את כל קוטר הקרסול של כל בעל חיים. לאחר מכן, הרם את העכבר הראשון בעדינות בזנב והזריק תוך צפקית 200 מיקרוליטר של סרום עכבר KBN מדולל המכיל נוגדנים נגד איזומראז גלוקוז שש פוספט או GPI.

לאחר מכן החזירו את החיה לכלוב שלה ומדדו את נפיחות הקרסול מדי יום עד היום השישי. לרגישות יתר למגע, השתמש בגוזם שיער של בעלי חיים קטנים כדי לגלח בזהירות שטח של שניים על שני סנטימטרים מהבטן של עכבר מורדם והשתמש בפיפטה של 100 מיקרוליטר כדי למרוח 80 מיקרוליטר של תמיסת TNCB טרייה שהוכנה 5% על העור החשוף. חשוב מאוד להימנע מפגיעה בעור בכל שלב במהלך ההליך, מכיוון שהדבר עלול להוביל לאותות פלואורסצנטיים לא ספציפיים בתוך החיה ויכול להשפיע על תוצאות המחקר.

החזירו בעדינות את בעל החיים לכלוב שלו, הימנעו מטמפרטורות גוף נמוכות בשלב ההתאוששות. שישה ימים לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי למרוח 20 מיקרוליטר של תמיסת 1% TNCB על שני צידי האוזן הימנית, ולאחר מכן מריחה של 100 מיקרוליטר של 1% TNCB כל יומיים למשך עד 10 ימים ומדידה יומית של עובי האוזן. כדי למדוד את פעילות ה-MMP in vivo, תחילה מערבול בעדינות את צבע ההדמיה האופטי הניתן להפעלה וטען מזרק אינסולין של 0.5 מיליליטר עם שני ננו-מולרים של הצבע לכל עכבר.

לאחר מכן ציידו מזרק נוסף במחט בגודל 30 המחוברת לצנתר פוליאתילן והניחו את זנב העכבר הראשון במים חמים. כאשר הוורידים התרחבו, הכנס את הקטטר עם הקצה החתוך של המחט בזווית של 20 מעלות בצד הדיסטלי של הזנב לתוך וריד זנב מורחב ותלה מחדש את המזרק כדי לבדוק את המיקום הנכון של הקטטר. אם הצנתר ממוקם כראוי, החלף את המזרק והזריק שני ננו-מולרים של הבדיקה.

לאחר מכן החלף את מזרק בדיקת ההדמיה האופטית במזרק המכיל תמיסת מלח של 0.9% והזריק 25 מיקרוליטר של מי מלח לווריד הזנב כדי לנקות לחלוטין את הנפח המת של צינור הפוליאתילן. לאחר מכן, הגדר את קופסת סורק ההדמיה של סורק ההדמיה האופטי ל-37 מעלות צלזיוס והנח עד חמישה עכברים בקופסת הסורק במרכז שדה הראייה. 24 שעות לאחר ההזרקה, פתח את תוכנת ההדמיה ואתחל את המערכת, מה שמאפשר למצלמת ה-CCD להתקרר לטמפרטורת העבודה.

כאשר המערכת מוכנה, הגדר את אורכי הגל ופרמטרי ההדמיה המתאימים בהתאם לפלחת של בדיקת ההדמיה. לוח הבקרה לרכישת מערכת הדמיה in vivo יופיע. לאחר מכן לחץ על רכוש רצף כדי להתחיל את המדידה.

לשמירת התמונות שנרכשו, בחר את מיקום השמירה הרצוי. בנוסף, ניתן להוסיף מידע נוסף בחלון עריכת תוויות תמונה. כאן ניתן לראות את האות הפלואורסצנטי המשופר בבירור בכפות הקדמיות והקרסוליים של עכברי דלקת מפרקים שגרונית ביום השישי לאחר השראת המחלה, בהשוואה לאות המינימלי שנצפה בחיות ביקורת.

ניתוח התפלגות ביולוגית של פעילות ה-MMP באיברים של חיות הניסוי והביקורת מדגים אות משופר מאוד בקרסוליים ובכפות הקדמיות אך ורק במפרקים של עכברי דלקת מפרקים שגרונית. מעניין לציין כי אות MMP משופר נצפה גם בשתי הכליות של עכברי דלקת מפרקים שגרונית, בעוד שהכבד והמעיים מפגינים אות MMP חזק ללא קשר למצב דלקת מפרקים שגרונית שלהם. במהלך תגובת רגישות יתר כרונית למגע הנגרמת על ידי חמישה אתגרי TNCB לאוזן ימין, מוצגת פעילות MMP מוגברת מאוד באוזן ימין המודלקת בהשוואה לאוזן הביקורת השמאלית והבריאה.

ניתוח כמותי למחצה של עוצמת האות של קרסוליים או כפות מפרקים ובריאים מדגים עוצמת אות MMP מוגברת פי שבעה בקרסוליים הסובלים מדלקת מפרקים עם עוצמת אות MMP גבוהה פי שלושה שזוהתה בכפות הקדמיות בהשוואה לזו של בעלי החיים הבריאים. אוזני תגובת רגישות יתר למגע חריפה וכרונית מציגות גם אות MMP מוגבר משמעותית גם לאחר אתגר אחד בלבד שנשאר מוגבר במהלך האתגר החמישי. שיטה זו ניתנת ליישום בקלות במודלים שונים של חיות ניסוי ומאפשרת מעקב ארוך טווח אחר התהליכים הביולוגיים והטיפולים הבסיסיים in vivo.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלכל בדיקת הדמיה אופטית יש הליך הזרקה וזמן קליטה שונים. לכן, יש להשלים מחקרי אורך עבור כל צבע פלואורסצנטי חדש ובדיקת הדמיה אופטית. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו בעד חמישה בעלי חיים בפחות מ-10 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

שיטה זו מסוגלת לספק תובנה לגבי מנגנוני הדלקת in vivo, אך ניתן ליישם אותה גם כדי לחקור מחלות אחרות כמו סרטן או ניוון עצבי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בהדמיה אופטית in vivo עם בדיקת הדמיה הניתנת להפעלה במודלים של מחלות דלקתיות.