משלוח הממברנה ממוקד על Encapsulated מטענים הידרופובי בנושאת Nanoparticle קריסטל נוזלת

המטרה הכללית של הליך ניסיוני זה היא להשתמש בננו-חלקיק המבוסס על גביש נוזלי כפלטפורמת הובלה למסירה מבוקרת של מטען הידרופובי לחלק הליפופילי של ממבנה הפלסמה של תאי יונקים חיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הובלת התרופות, כגון כיצד לאפשר באופן יעיל הובלה וספיגה תאית של מטענים הידרופוביים בעלי מסיסות נמוכה במים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הובלה ספציפית יותר של מטענים הידרופוביים המכוונים לממברנה, אל ממבנה הפלסמה, יחד עם הפחתה ברעילות התאית שלהם.

את הפרוצדורה ידגים ד"ר Okhil Nag, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחילו את הפרוצדורה בהכנת ננו-חלקיקי גביש נוזלי DiO כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של תמיסת עבודה טריה של NHSS/EDC ל-1.0 mL של ננו-חלקיקי גביש נוזלי DiO בבופר HEPES.

וראש את התערובת במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 20 µL של תמיסת מס (stock solution) של cholesterol PEG amine לתערובת זו וערבב במשך שעתיים. לאחר שעתיים, סבב את תערובת התגובה קצרה בצנטריפוגה במיני-צנטריפוגה שולחנית במהירות מרבית למשך 30 שניות.

לאחר מכן, העבירו את העילוי דרך עמודת כרומטוגרפיית סמך (size exclusion chromatography) מסוג PD 10 שהוזנה ב-Dulbecco's phosphate buffered saline. כדי לאשש באמצעות אלקטרופורזה בג'ל את הצמידה הקוולנטית המוצלחת של PEG cholesterol לפני השטח של ננו-חלקיקי הגביש הנוזלי DiO, הכינו ג'ל אגרוז כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר שהג'ל התגבש, הוסיפו מספיק תמיסת TBE running buffer כדי לשקוע את הג'ל בתוך התא.

לאחר מכן, הוסיפו 35 µL של דגימת ננוחלקיקי גביש נוזלי DiO לבארי הג'ל והריצו למשך 20 דקות במתח של 110 V. דמיינו את הג'ל באמצעות מערכת דימות ג'לים עם פילטר עירור של 488 nm ופילטרים פליטה של 500 עד 550 nm. הכינו צלחות תרבית רקמה בקוטר 35 mm המצוידות בהכנסות של זכוכית כיסוי מספר 1 בגודל 14 mm, על ידי ציפוי שלהן בפיברונקטין בקרים (bovine fibronectin) ב-DPBS למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר שעתיים, הסירו את תמיסת הציפוי של הפיברונקטין מכלי התרבית. קצרו תאי HEK 293 T17 מבקבוק T25 על ידי שטיפה ראשונית של שכבת התאים המונו-שכבתית ב-3 mL של DPBS, ולאחר מכן הוספת 2 mL של trypsin EDTA. הדגרירו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 °C למשך כသုံး דקות.

לאחר ניתוק התאים מהבקבוקה, יש לנטרל את ה-trypsin על ידי הוספת ארבעה מיליליטרים של מצע מלא לבקבוקה. קבעו את ריכוז התאים בסספנסיה באמצעות ספירה במספר תאים. לאחר מכן, התאימו את ריכוז התאים לכ-80,000 תאים למיליליטר באמצעות מצע גידול.

הוסיפו שלוש מיליליטר של תרחיף התאים לצלחית, והדגירו באינקובטור למשך הלילה. למחרת, התאים צריכים להגיע לכ-70 אחוזי התמזגות (confluency) ולהיות מוכנים לשימוש. צפיפות תאים נאותה היא קריטית לסימון חסון ויעיל של אחוז גבוה של תאים.

הכינו תמיסות בנפח של מיליליטר אחד של DiO, ננו-חלקיקי גביש נוזלי של DiO, וננו-חלקיקי גביש נוזלי של DiO עם PEG cholesterol, בתווך הובלה על ידי דילול של תמיסות המקור המתאימות. הסירו את מצע הגידול מהצלחות התרבית באמצעות פיפטה סרולוגית, ושטפו את שכבות התאים החד-שכבתיות פעמיים עם HEPES DMEM. בצעו את השטיפות באמצעות פיפטה להוספה עדינה של HEPES DMEM לשולי הצלחות, ולאחר מכן הסירו אותה.

הוסיפו 0.2 milliliters של תמיסות המסירה המוכנות של DiO חופשי או של ננו-חלקיקי גביש נוזלי DiO למרכז צלחות התרבית. לאחר מכן, החזירו את הצלחות לאנקובטור למשך פרק זמן מתאים. זמני דגירה ממושכים מובילים לסימון תאי לא ספציפי של אזורים שאינם קרומיים.

לאחר תקופת הדגירה, הסירו את תמיסות ההגשה באמצעות פיפטה סרולוגית. שטפו את שכבות התאים המונואדוריים פעמיים עם DPBS, בנפח של שני מיליליטר לכל שטיפה. קבעו את שכבות התאים המונואדוריים באמצעות פאראפורמאלדהיד בריכוז ארבעה אחוזים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

הסיר את תמיסת הפראפורמלהיד באמצעות פיפטה ושטוף בעדינות את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של DPBS. כעת התאים המקובעים מוכנים לצילום לבדיקת נוכחות של אות פלואורסצנטי ממברנלי, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (confocal laser scanning microscopy). על במה של מיקרוסקופ המצוידת בתא דגירה מחומם, צלם את דגימת התאים החיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להעריך את סימון הממברנה.

אם הדימוג אינו מבוצע באופן מיידי, יש להחליף את המצע ב-DPBS המכיל 0.05 אחוזים של sodium azide ולשמור את הצלחותיהם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. בשיטה זו, התאים מסומנים באופן משותף עם DiO כתורם FRET, ועם DiI כמקבל FRET. סמנו את התאים באופן רצופי עם DiO liquid crystal nanoparticle PEG cholesterol, ועם DiI חופשי כפי שבוצע בעבר.

לאחר הצביעה, שטפו את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של DPBS באמצעות פיפט סרולוגי והחליפו בשני מיליליטר של תמיסת דימות לתאים חיים. על במה של מיקרוסקופ המצוידת בתא דגירה מחומם, דמייו את דגימת התאים החיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם דימות FRET. הגדירו את הניסוי למרווחי זמן של 30 דקות לאורך תקופה של ארבע שעות על ידי עירור של תורם DiO ב-488 ננומטר, ואיסוף ספקטרום פליטה מלא הן של תורם ה-DiO והן של מקבל ה-DiI מ-490 עד 700 ננומטר, עם גלאי ספקטרלי בעל 32 ערוצים.

לאחר מכן, קבעו את עוצמת הפליטה הרזולוציונית בזמן של התורם DiO ושל המקבל DiI בתאים שצבעו עם ננו-חלקיקי גביש נוזלי DiO PEG cholesterol ו-DiI. לבסוף, חשבו את יחס ה-FRET של המקבל והתורם הרזולוציוני בזמן עבור התמונות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. DiO חופשי מצטבר באופן לא ספציפי בחלק הפנימי של התא, בניגוד לקרומי הפלסמה של התאים אשר נצבעו בצביעה נגדית באמצעות פוספוליפיד ממברנלי בעל שני סמנים.

ניתן להמחיש זאת באמצעות התמונות הממוזגות. לעומת זאת, ננו-חלקיקי גביש נוזלי DiO PEG cholesterol מסמנים באופן ספציפי רק את ממברנת התא, כפי שניתן לראות מהמיקום המשותף (colocalization) עם פוספוליפיד הממברנה המסומן בשני צבעים. FRET מאשר את המעבר (partitioning) של DiO מננו-חלקיק הגביש הנוזלי אל השכבה הליפידית הכפולה של הממברנה, כפי שניתן להסיק מעלייה נצפית בהעברת האנרגיה מתורם ה-DiO למקבל ה-DiI.

FRET בין DiO ל-DiI, כמו גם שינויים בפליטה של DiO ו-DiI, מאשרים עלייה ב-FRET מ-DiO ל-DiI כפונקציה של הזמן. ננו-חלקיקי גביש נוזלי DiO עם PEG cholesterol מראים ציטוטוקסיות מינימלית עם חיות של 90%, בהשוואה לרעילות משמעותית של DiO חופשי עם חיות של כ-50%. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הסינתזה של ננו-חלקיקי גביש נוזלי טעונים במטען, ביו-פונקציונליזציה שלהם עבור טרגוט תאי, ודימיוג של תאים טעונים במטען כדי לאשש מסירה תאית מוצלחת.

בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקושי, שכן המסירה הספציפית של DiO מתמיסה מימי לממברנה הפלזמית מהווה אתגר משמעותי. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה לאחר שהשתמשנו בפלטפורמת ננו-חלקיקים של גביש נוזלי למסירה תאית של התרופה האנטי-סרטנית doxorubicin, והבחנו ביכולתה לווסת את קינטיקת הספיגה התאית של התרופה. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם גישה זו למסירה תאית של מגוון רחב של מטענים הידרופוביים, המהווים אתגר מיוחד בכל הנוגע למסירתם לתאים מתוך מדיה מימית.

ניתן להשתמש בגישה זו כדי להשיג הובלה יעילה יותר של תרופות המכוונות לממברנה ומולקולות ביולוגיות פעילות, כגון צבעים רגישים למתח עבור דימוי מוחי, או תרופות פוטודינמיות לטיפול תרופתי בסיוע פוטוני.