Name: מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג ין ההתנגדות התרופה ב Toxoplasma gondii (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: למד מיפוי QTL ועריכת CRISPR/Cas9 לזיהוי גני התנגדות לתרופות ב-Toxoplasma gondii. שיטה זו מאפשרת ניתוח גנטי מדויק ומניפולציה יעילה של הגנום הטפילי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ל &#39;דוד סיבלי ואסיס חאן על תרומתם לפרסום המקורי שעליו מבוססים הפרוטוקולים. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק AI108721.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקולים אלה מציגים מספר שיטות כי כאשר בשילוב לאפשר זיהוי של הגן עמידות התרופה T. gondii . שני בפרט היו אינטגרלי לפרויקט, השיטה מתובל יחסית של מיפוי QTL ואת השיטה שפותחה לאחרונה של CRISPR / Cas9 עריכת הגן. לנדר ובוטשטיין פירסמו את השפעתם על הנייר ב -1989 בהפגנת מיפוי QTL המקשר בין לוקוסים גנטיים לבין פנוטיפים 36 . לאחרונה, בשנת 2012, תיאר Dounda ו- Charpentier את מערכת העריכה של CRISPR / Cas9 ב- Streptococcus pyogenes 22, אשר הותאמה במהירות ככלי גנטי במודלים שונים, כולל T. gondii 13 , 17 . שתי השיטות היו שימושיות כאן, כאשר מיפוי QTL הגדיר את מוקד המכיל את המוטציה עמידות התרופה שזוהה בסופו של דבר באמצעות זיהוי SNP מבוסס WGS, ועריכת CRISPR / Cas9 סיפקה לי<html> As לאשר SNR1 הוא הגן sinefungin התרופה סמים. ה- ME49-FUDR r x VAND-SNF r 8 פותח במקור כדי לחקור פנוטיפ ארסיות 19 , אבל זנים ההורים גם במקרה יש הבדל פנוטיפי נוסף אשר הגן הסיבתי לא היה ידוע, התנגדות sinefungin בהורה VAND. זה מדגיש יתרון אחד של צלבים כי הם יכולים להיות repurposed כאשר הבדלים פנוטיפי נוספים אצל ההורים הם נצפו. זה היה המקרה של הצלב Toxoplasma אחר, סוג 2 x סוג 3, שבו כמה גנים המעורבים ארסיות נמצאו על ידי מיפוי מספר פנוטיפים 37 , 38 , 39 , 40 . עד כה, ארבעה צלבים שונים T גונדיי תוארו בשימוש למפות גנים האחראים על פנוטיפיםSs = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 , אשר לכולם יש פוטנציאל לעשות שימוש חוזר למפות פנוטיפים חדשים שעבורם הבסיס הגנטי אינו ידוע. לאורך השורות הללו, הגנום של 62 טוני גונדיי המייצג את המגוון הגנטי העולמי ידוע כבר רצף 43 . צלבים חדשים יכול להיות מבריכה זו עבור זנים שונים זה מזה פנוטיפים מעניינים. לאחר שהזכיר את היתרונות של מיפוי QTL, יש לומר כי יצירת צלב אינה התחייבות קטנה. ישנן שיטות אחרות שניתן להשתמש בהן לזיהוי גנים סיבתיים. אחת הטכניקות החזקות משתמשת mutagenesis כימיים כדי ליצור מוטציות שניתן לבדוק עבור פנוטיפים. כדי למצוא את הגן הסיבתי, מוטציות יכול להיות משלים עם ספריות קוסמייד 44 או שיטות resequencing הגנום ניתן להשתמש כדי למצוא את המוטציה הסיבתית 45 . לקבלת מומחדש על זה, ראה שני מאמרים של JoVE על ידי Coleman et al. ו Walwyn et al. המתאר גישות אלה 46 , 47 . רבים מהצעדים המוליכים לזיהוי המוטציה הסיבתית של ה- SNF r (פרוטוקולים 2 ו -3) מסתמכים על שיטות חישוביות המתבצעות עם תוכנה הזמינה באופן חופשי לשימוש אקדמי. פקודות מפורטות עבור כל שלב מסופקות וכאשר לרוץ עם הקבצים הנכונים יאפשר למשתמש ליצור מחדש את הנתונים הדרושים כדי למצוא את סיבתית SNF R SNP. זכור שחלק מהתחביר בפקודות מתייחס לשמות קבצים או למבנה ספריות ($ PATH) שניתן לשנותם להעדפות המשתמש. למרות הפקודות שניתנו כאן בהחלט לא למצות את הדרכים ניתן לנתח צלב עם ניתוח QTL ו WGS מבוסס זיהוי SNP, הם מקיפים מספיק כדי לחזור על הניסוי המתואר במאמר זה אמור לאפשר למשתמש להפוך m<html> עפרות מכיר כיצד גישות אלה מנוצלים אופנה צעד אחר צעד. למרות מיפוי QTL ו רצף WGS מבוסס רצף SNP היו מספיקות כדי לזהות גן מועמד SNF r , ניסויים נוספים נדרשים כדי לאשר את תפקידה בהתנגדות סמים. זה יכול להיות משכנע הוכח באמצעות הפרעה גנים או טכניקות נוקאאוט, שניהם אשר ניתן להשיג באמצעות עריכת CRISPR / Cas9 הגן. שיטות מפורטות לשימוש CRISPR / Cas9 או ליצור מוטציות indel או להוסיף בונה מהונדס לתוך גן היעד T. gondii ניתנים. ספציפיות המיקוד אשר CRISPR / Cas9 מספק מגביר את היעילות של עריכת הגן על שיטות מסורתיות. כמו כן, זה גדל ביעילות אפשרה להשתמש זנים מותאמים שאינם במעבדה עבור מחקרים גנטיים שהיו בעבר קשה לשנות 13 . למרות בחיתוליו, CRISPR / Cas9 כבר נעשה שימוש כדי לגרום שיבושים גניםLass = &quot;xref&quot;&gt; 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , תג גנים 17 , ולעשות נוקאאוט גנים 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 ב T. gondii , מבטיח להיות כלי שימושי עבור מחקרים רבים אחרים בעתיד. התגלית כי SNR1 inactivation מוביל התנגדות sinefungin עושה את האתר SNR1 אתר מבטיח עבור ההכנסה transgene או השלמה גנטית. כדי למקסם את ההצלחה של שימוש CRISPR / Cas9 בתיווך גנים מיקוד לכוון את השילוב של transgene לתוך לוקוס SNR1 , ההיבטים הבאים צריכים להיות consideאדום במהלך העיצוב הניסויי. ראשית, סמן בחירה מומלץ להיכלל בבנייה מהונדס כדי להגביר את היעילות של הבנייה זן. אם סמן הבחירה נכלל, הן בחירה חיובית והן שלילית ניתן להשתמש, וכתוצאה מכך כמעט 100% של הטפילים שנבחרו כפליים להיות מהונדס עם ממשלת ישראל משולב ב SNR1 לוקוס. לעומת זאת, אם המבנה המהונדס אינו מכיל תכונות ניתנות לבחירה נוספות, והוא מסתמך על בחירה שלילית במיקוד SNR1 , היעילות של transgenesis מוצלח תלויה במידה רבה ביעילות של cotransfection של הפלסמיד CRISPR ובבניה הטרנסגנית. שנית, אם כי CRISPR / Cas9 בתיווך אינטגרציה ספציפית לאתר של קטע DNA לא הומולוגי משמש לעתים קרובות עבור השלמה ו transgenesis, יש לציין כי הכיוון של הכניסה לא יכול להיות מובטח במקרים כאלה כמו גם כיוון אפשרי. זה עלול להוות בעיהMs ליישומים מסוימים. לדוגמה, כדי להשלים את מוטציה עם אללים גנים שונים, קשה להבטיח כי כל אללים מוכנסים באותו כיוון, ועל פערים בכיוון עשוי לגרום להבדלים הביטוי. עבור סוג זה של יישום, בונה DNA עם רצפים הומולוגיים כדי מוקד SNR1 מומלץ, אשר יניע את הכיוון אינטגרציה נכונה ( איור 6 ). שלישית, במהלך transfection, היחס בין הפלסמיד CRISPR לבין מולקולת הדנ&quot;א הטרנסגני הוא קריטי עבור בנייה מוצקה מהונדס מהונדס. יחס זה צריך להיות מותאם על פי אסטרטגיות הבחירה. ההמלצות הבאות מומלצות: 1) אם המבנה המהונדס מכיל סמן עמיד לסמים והתרופה המתאימה היא הבחירה היחידה המשמשת ליצירת טפילים מהונדסים, כלומר sinefungin אינו בשימוש, יחס הטוחן המוצע בין המבנה המהונדס לבין הפלזמה CRISPRמזהה 1: 5. שימוש יותר CRISPR פלסמיד במקרה זה מגדיל את הסבירות כי טפילים המקבלים את המבנה המהונדס גם לקבל את הפלסמיד CRISPR, ולכן טפילים עמיד טילים נוטים יותר לקבל את הסמן מוכנס באתר הכוונה CRISPR. אם היחס הוא הפוך, רוב הטפילים המקבלים את המבנה המהונדס לא יקבלו את הפלסמיד CRISPR. כתוצאה מכך, הרוב המכריע של טפילים עמידים לתרופה להשיג את המבנה המהונדס באמצעות אינטגרציה אקראית לא קשור CRISPR / CAS9 בתיווך אתר ספציפי ההכנסה. 2) אם המבנה המהונדס מכיל סמן עמיד לסמים והתרופה המתאימה משמשת עם sinefungin לבחירת טפילים מהונדסים, היחס המוצע לטוחנות בין המבנה הטרנסגני לבין הפלסמיד CRISPR הוא 1: 1. אסטרטגיה זו מספקת את היעילות הגבוהה ביותר של בנייה זנים מהונדס. 3) אם המבנה המהונדס אינו מכיל יצרנית ניתנת לבחירה, בהסתמך על בחירה שליליתעל ידי sinefungin לבד כדי להשיג טפילים מהונדס, היחס המוצע טוחנת בין המבנה המהונדס לבין פלסמיד CRISPR הוא 5: 1. הרציונל לעיצוב זה הוא זהה להנחיה הראשונה לעיל. מאז הן pyrimethamine ו sinefungin שימשו לבחירה בפרוטוקול 5, היחס בין הגן מיני DHFR ו- SNR1 מיקוד CRISPR פלסמיד נקבע כמו 1: 1. יחדיו, לשיטות המפורטות כאן יש רמת פירוט שלא ניתן היה להעביר בפרסום המקורי שזיהה SNR1 2 . פרוטוקולים אלה; במיוחד, תחביר שורת הפקודה, פריסה רציפה של תוכניות מנוצל, ואת השימוש של CRISPR / Cas9 צריך לסייע במאמצים בעתיד לזהות גנים חדשים אחראים פנוטיפים.

טווח המארח קובע את מידת השכיחות של טפילים. טפילים מסוימים יש דרישות המארח ספציפי מאוד להגביל את האזור שממנו הם נמצאים, אחרים הם generalists. אחד כזה הוא generalist Toxoplasma gondii ( T. gondii) . טפיל זה נמצא ברחבי העולם כפי שהוא יכול להדביק את כל היונקים ציפורים רבות. בני אדם הם גם רגישים ההערכה היא כי כ 1/3 של האוכלוסייה העולמית נדבק. למרבה המזל, תגובה חיסונית חזקה בדרך כלל שולטת על הצמיחה של הטפיל, אבל במצבים שבהם המערכת החיסונית נפגעת הטפיל יכול לגדול מסומנת ולגרום למחלות, לעתים קרובות אנצפלי. כמו כן, טפיל זה יכול לגרום למחלות מולדות אם נשים נגוע בעבר נגועים במהלך ההריון, כי הם חסרים זיכרון החיסון כדי להגביל במהירות את התפשטות הטפיל. בנוסף, יש נטל toxoplasmosis העין שיכול לגרום לאובדן ראייה 1 . עבור אלה reasoNs גונדי הפך למוקד המחקר, ובגלל שיטות מולקולריות רבות שפותחו עבור המחקר שלה, מודל טפילים Apicomplexan. שתי שיטות אשר יידונו כאן הם מיפוי כמותי Locus (QTL) מיפוי מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) / Cas9 גן עריכה. מיפוי QTL ועריכת CRISPR / Cas9 הם, בהתאמה, גישות גנטיות קדמיות ופוכות ששימשו במחקרים קודמים לזיהוי ו / או אפיון גנים של גונדאלי. הנה, שיטות אלה משולבים כדי לזהות ולאשר את הפונקציה של הגן sinefungin התנגדות (SNF r ), TgME49_290860, ו אורתולוגים שלה ( מעוטר כמו SNR1 ) 2 . למרות T. gondii יכול להדביק מגוון רחב של המארחים ביניים, הוא חייב לעבור דבק בתאי אפיתל המעי של עצה כדי להשלים את מחזור החיים. חתולים הם המארחים הסופי של הטפיל שבו sשלבים יוצאי דופן מיוצרים ואת רקומבינציה גנטית באמצעות המיוזה מתרחשת. כדי לבצע מחקר QTL יש ליצור צלב גנטי, ובמקרה של Toxoplasma זה אומר לעבור שני זנים שונים טפיל שונים זה מזה תכונה פנוטיפית, כתמי ההורים, דרך חתול לייצר צאצאים רקומביננטי 3 . לפני שהוא מוזן לחתולים, זנים ההורים נעשים עמיד בפני תרופות נפרדות כדי לאפשר זיהוי יעיל יותר של רקומביננטים על ידי בחירת סמים כפולה של הצאצאים 4 . שלוש תרופות שימשו ב T. gondii למטרה זו; Fluorodeoxyribose (FUDR) אשר עבורו uracil phosphoribosyl transferase ( UPRT ) הוא הגן ההתנגדות 5 , adenosine arabinoside (ARA) אשר עבורו אדנוזין קינאז ( AK ) הוא הגן ההתנגדות 6 , ו- sinefungin (SNF) אשר גן ההתנגדות לא היה ידוע לו 7 . כמה צלבים גנטיים היושנוצר עבור T. Gondii , אבל רק את הצאצאים של 24 ME49-FUDR R X VAND-SNF R צלב היו genotyped באמצעות רצף הגנום כולו (WGS) 8 . זה פתח את האפשרות של מיפוי וזיהוי הגן התנגדות SNF באמצעות הצלב הזה כמו ההורה VAND נעשה עמיד sinefungin על ידי mutagenesis כימי של זן רגיש VAND (VAND-SNF) זן, ואת הגנום התייחסות VAND היה רצף באמצעות VAND- זן של SNF ובכך מאפשר זיהוי של כל polyorphisms בין הצאצאים WGS לבין גנום התייחסות VAND-SNF s , כולל מוטציה הורשת VAND-SNF RV הוריות כי נתנו כמה הצאצאים sinefungin הצאצאים. על מנת לזהות את סיבתית יחיד נוקליאוטידים פולימורפיזם (SNP) של צאצאים צאצא SNF, כמה משאבי קוד פתוח מבוססי חישוב ניתן להשתמש כדי לנתח את הנתונים. כדי ליצור את המפה הגנטית עבור ME49-FUDR R X VAND-SNF R לחצות את חבילת התוכנה REDHORSE 9 פותחה המשתמשת WGS יישור של ההורים הצאצאים כדי לזהות במדויק את עמדות הגנום של crossovers גנטי. מידע זה מיפוי אז יכול להיות משולב עם הנתונים פנוטיפי (SNF R בתא) לעצב מערך נתונים תואם את החבילה &#39;qtl&#39; 10 ב R תוכנה תכנות סטטיסטי שבו סריקה QTL ניתן להפעיל לחשוף לוקוסים משמעותיים עם פנוטיפ. כדי לזהות את SNP סיבתי הממוקם בתוך מוקד QTL, WGS קורא של הצאצאים יכול להיות מיושר בנפרד לגנום SINEfungin רגיש VAND באמצעות תוכנית יישור Bowtie 2 שממנו 11 SNPs ניתן לקרוא באמצעות התוכנית varScan mpileup2snp המתקשר 12 . באמצעות SNP אלה, מוקד QTL יכול להיות סרוק עבור פולימורפיזם כי נמצאים RF SNF אבל לאב צאצא של SNF. עם SNP סיבתי המזוהה באזור קידוד של הגן, שינוי גנטי של הגן המועמד SNF R יכול להתבצע במתח של SNF כדי לאמת את התרופה עמידות לתפקוד. מערכת הגנום CRISPR / Cas9 הוקמה לאחרונה ב- Toxoplasma 13 , שהוסיפה כלים חשובים לחקר הביולוגיה המורכבת של הטפיל הזה, במיוחד עבור מחקרים גנטיים בזנים שאינם מותאמים למעבדה. בשל הפעילות הלא-הומולוגית הפעילה (NHEJ) הפעילה ביותר בתאי טוקסופלסמה ( WT Toxoplasma) , שינוי גנום ממוקד קשה להשגה, שכן הדנ&quot;א המשולב אקסוגני משולב באופן אקראי לגנום בתדירות גבוהה מאוד 14 . כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של שינוי ספציפי לוקוס, גישות שונות הועלו כדי להגביר את היעילות של רקומבינציה הומולוגיים ו / או ירידהפעילות NHEJ 15 , 16 . אחת הגישות הללו היא מערכת CRISPR / Cas9. בהשוואה לשיטות אחרות, מערכת CRISPR / Cas9 יעילה בהכנסת שינויים ספציפיים לאתר וקל לתכנן 13 , 17 , 18 . בנוסף, ניתן להשתמש בו בכל זן Toxoplasma ללא שינוי נוסף לטפיל 13 , 19 . מערכת ה- CRISPR / Cas9 נובעת ממערכת החיסון החיסונית של סטרפטוקוקוס pyogenes , אשר משתמשת בו כדי להגן על הפלישה של אלמנטים גנטיים ניידים כגון פאגים 20 , 21 , 22 . מערכת זו מנצל את RNA מודרך DNA אנלוגים אנזים CAS9 להציג פעמיים DNA גדיל לשבור (DSB) לתוך היעד, אשר לאחר מכן repaIred או על ידי NHEJ נוטה לשגיאה כדי להשבית גנים היעד באמצעות מוטציות indel קצר, או על ידי הומולוגיה מכוונת רקומבינציה לשנות את מיקום היעד בדיוק כפי שתוכנן 23 , 24 . ספציפיות היעד נקבע על ידי מולקולה קטנה RNA בשם RNA מדריך יחיד (gRNA), אשר מכיל רצף 20 מעוצבים באופן אינדיבידואלי, כי יש 100% הומולוגיה ל- DNA היעד 22 . המולקולה gRNA מכיל גם חתימות המוכרות על ידי CAS9 המכוונים את nuclease לאתר היעד, הכולל Protospacer מיוחד מוטיב הצמוד (PAM, רצף הוא &#39;NGG&#39;) 25 , 26 . לכן, מולקולת gRNA ואת רצף PAM לעבוד יחד כדי לקבוע את האתר Casavage Cas9 בגנום. אפשר בקלות לשנות את רצף gRNA למקד אתרים שונים עבור מחשוף. כאשר מערכת CRISPR / Cas9 פותחה לראשונה ב- ToxopLasma, פלסמיד אחד להביע את nuclease Cas9 ואת המולקולה gRNA שימש להציג DSB באתר מיקוד 13 , 17 . זה הוכח כי מערכת CRISPR / Cas9 מגדיל באופן דרסטי את היעילות של שינוי הגנום באתר ספציפי, לא רק על ידי רקומבינציה הומולוגיים, אלא גם שילוב לא הומולוגיים של דנ&quot;א אקסוגני 13 . זה עושה את זה זנים wildtype המכילים פעילות NHEJ. לכן, מערכת זו יכולה לשמש למעשה כל זן Toxoplasma עבור עריכת הגנום יעיל. בניסוי טיפוסי, היעד ספציפי CRISPR פלסמיד ואת קטע ה- DNA המשמש לשנות את היעד הם שיתוף transfected לתוך טפילים. אם קטע ה- DNA המשמש לשנות את היעד מכיל רצפים הומולוגיים אל היעד היעד, רקומבינציה הומולוגיים ניתן להשתמש כדי לתקן את ה- DSB הציג על ידי CRISPR / Cas9 כדי לאפשר שינוי מדויק של היעד. מצד שני, אם intRoduced קטע DNA אינו מכיל רצף הומולוגיים, זה עדיין יכול להיות משולב באתר CRISPR / Cas9 מיקוד. זה האחרון משמש לעתים קרובות כדי לשבש גנים על ידי החדרת סמנים לבחירה או כדי להשלים מוטציות ב loci המאפשרים בחירה שלילית 13 . כאן לוקוס SNR1 משמש כדוגמה כדי להראות כיצד CRISPR / Cas9 יכול לשמש הפרעה גנטית ואת הדור של טפילים מהונדס.

<table><tbody><tr><td>צלוחיות T25</td><td>קורנינג</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>פיברובלסטים של עורלה אנושית (HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>T. gondii זן ME49</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>T. gondiiזן VAND</td><td>ATCC</td><td>PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (ללא נתרן ביקרבונט)</td><td>מדעי החיים</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS) VWR International בדרגת פרימיום</td><td></td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp; 200 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים 15710064 לצלוחיות</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>מחטים קהות 22 גרם x 1 אינץ'</td> <td>מוצרי BRICO</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>מסנן גרעין 3.0 ומיקרו; m, 25 מ"מ</td><td>GE Healthcare</td><td>110612</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מסנן Swin-Lok 25 מ"מ</td><td>GE Healthcare</td><td>420200</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Propper MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>R&nbsp;</td><td>קרן R</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr> <tr><td>J/qtl</td><td>קבוצת צ'רצ'יל</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>אוניברסיטת ג'ון הופקינס</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI ערכת כלים SRA</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>מכון וולקאם טראסט סנגר</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>אוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MUMmer</td><td>JCVI & אוניברסיטת המבורג</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #54467</td><td>T. gondii פלסמיד CRISPR לחיתוך הגן UPRT</td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #59855</td><td>T. gondii פלסמיד CRISPR לחיתוך הגן TG*_290860 SNR1</td></tr><tr><td>pUPRT::D HFR-D</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #58528</td><td>תבנית עבור DHFR* מיני גן</td></tr><tr><td>Q5 ערכת מוטגנזה מכוונת אתר&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין טריפושפט (ATP)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטתיון (GSH)</td><td>סיגמא Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 מערכת אלקטרופורציה</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורציה Cuvette&nbsp; 4 מ"מ</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>קריטל סגול</td><td>אלפא Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות TC צלחת</td><td>קורנינג</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 בארות צלחת TC</td><td>קורנינג</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית 12 מ"מ עגולה</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות TC צלחת</td><td>קורנינג</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>גיבסון ערכת שיבוט הרכבה (רב שבר)</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 פולימראז בנאמנות גבוהה&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Pyrimethamine</td><td>TCI AMERICA</td><td>P2037-1G</td><td>השתמש בקוצר בעת שימוש בטפילים עמידים לפירימתאמין - ראה פרוטוקול</td></tr></tbody></table>

מיפוי qtl ו crispr / cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; toxoplasma gondii</em

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

הידע המדעי קשור באופן מהותי לטכנולוגיות ולשיטות הקיימות. מאמר זה יציג שתי שיטות שאפשרו זיהוי ואיתור של הגן עמידות התרופה בטפיל Apicomplexan Toxoplasma gondii , השיטה של ​​מיפוי כמותי לוקוס (QTL) באמצעות מפת גנום שלם רצף (WGS) מבוסס על השיטה של אשכולות באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) / Cas9 מבוסס הגן עריכה. הגישה של מיפוי QTL מאפשרת לבחון אם יש מתאם בין אזור גנומי לפנוטיפ. שני מערכי נתונים נדרשים להריץ סריקת QTL, מפה גנטית המבוססת על צאצאיו של צלב רקומביננטי ופנוטיפ שניתן לכמת אותו בכל אחד מצאצאי הצלב. מערכי נתונים אלה מעוצבים אז כדי להיות תואמים לתוכנות R / qtl שיוצרים סריקת QTL כדי לזהות לוקוסים משמעותיים עם הפנוטיפ. למרות שזה יכול לצמצם מאוד את החיפוש wאינדו של מועמדים אפשריים, אזורים QTLs טווח המכיל מספר גנים שממנו הגן הסיבתי צריך להיות מזוהה. לאחר WGS של הצאצאים היה קריטי לזהות את המוטציה סיבתית התנגדות המוטציה ברמת הגן. לאחר זיהו, המוטציה המועמד ניתן לאמת על ידי מניפולציה גנטית של טפילים רגישים לסמים. השיטה הפשוטה והיעילה ביותר לשנות גנטית T. gondii היא מערכת CRISPR / Cas9. מערכת זו מורכבת רק 2 מרכיבים מקודדים על פלסמיד אחד, RNA מדריך יחיד (gRNA) המכיל רצף 20 BP המשלימים את היעד הגנומי ואת endonuclease Cas9 שיוצר הפסקה כפולה גדיל DNA (DSB) על המטרה, תיקון אשר מאפשר הוספה או מחיקה של רצפים סביב אתר הפסקה. מאמר זה מספק פרוטוקולים מפורטים להשתמש CRISPR / Cas9 מבוסס כלי עריכה הגנום כדי לאמת את הגן האחראי על עמידות sinefungin ולבנות טפילים מהונדס.

מאמר זה מתאר בפירוט מספר שיטות שניתן להשתמש בהם ברצף כדי לזהות גן אחראי על עמידות התרופה ( איור 1 ). 24 הצאצאים של ה- ME49-FUDR r x VAND-SNF r r הצלבים הוערכו עבור ההתנגדות ל- sinefungin של התרופה כמתואר בפרוטוקול 1. באמצעות המפה הגנטית והפנוטיפ r SNF של הצאצאים, סריקה של QTL הופעלה ב- R / Qtl - פרוטוקול 2 ( איור 2 ). זה הביא לשיא משמעותי אחד על כרומוזום התשיעי פורש כ 1 Mbp. באזור זה נמצאת המוטציה הסיבתית. כדי לזהות את המוטציה הסיבתית, WGS קורא מן הצאצאים היו מיושרים לגנום ההתייחסות של VAND-SNF באמצעות Bowtie2 - Protocol 3.1, SNPs נקראו באמצעות varScan mpileup2snp - פרוטוקול 3.2, ומיקום QTL בגנום VAND זוהה באמצעות Mummmer - פרוטוק3.3. צאצאי SNPs בתוך לוקוס QTL חולצו ונסרקו עבור דפוס שבו הצאצאים r SNF יש SNP ו SNF זה לא, וזה אפשרי כי SNPs צאצאים צאצאים הושגו על ידי השוואה גנום VAND-SNF התייחסות ( איור 3 ) . רק SNP אחד מתאים דפוס זה וכתוצאה מכך קודון להפסיק מוקדם ב משוער חומצת אמינו חומצה גן בשם SNR1 . אישור כי SNR1 הוא הגן SN ההתנגדות R SNF בוצעה באמצעות מערכת CRISPR / Cas9. חדש CRISPR / Cas9 פלסמיד מהונדסים עבור T. עריכת gondii הגן נעשה המכיל gRNA מיקוד הגן SNR1 ליד מוטציה R SNF מזוהה הצאצאים - פרוטוקול 4 ( איור 4 א ). SNR1 המיקוד CRISPR / Cas9 פלסמיד היה electroporated לתוך זן של WT טפיל WT טפיל ומוטנטים עמידים הושגו כאשר כתUred ב 0.3 מיקרומטר sinefungin. לא טפילי r SNF התקבלו כאשר electroporated עם UPRT מיקוד CRISPR / Cas9 פלסמיד. כמה מוטציות CRFPR SNF r היו משובטים באזור סביב המטרה gRNA SNR1 היה רצף. כל מוטציה היה indel כי שיבשו את רצף קידוד של הגן SNR1 ( איור 4 ב ). שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להוסיף מבנה מיקוד לתוך לוקוס SNR1 באמצעות NHEJ ( איור 5), או על ידי HR ( איור 6 ) - קובץ משלים 2 . <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> איור 1: זרימת עבודה סכמטית לניסויים המפורטים בפרוטוקולים. השלבים העיקריים בזיהוי ואישור הגן RF SNF באמצעות ME49-FUDR R X VAND-SNF R צלב מוצגים עם התייחסות הפרוטוקולים המתאימים המפורטים inבמאמרו. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> איור 2: R / qtl פקודות להפעלת QTL Scan על פנוטיפ rF SNF. הפקודות כפי שתוארו בפרוטוקול 2 הופעלו ב- R באמצעות חבילת qtl. פקודות נציג העלילה מוצגים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> איור 3: מיקום SNP הסיבתי. צאצאי WGS קורא היו מיושרים את הגנום VAND-SNF התייחסות עם Bowtie 2, SNPs נקראו עם VarScan, ואת מתאימות<html> מיקום VAND QTL מזוהה עם Mummmer. SNPs הממוקמים בתוך מוקד QTL יובאו לגיליון אלקטרוני ו- SNP סיבתי זוהה. הצאצאים של ה- SNF (צהוב), צאצאים של SNF (ירוק), SNF r SNP (אדום) (ראה קובץ נתונים 3 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> איור 4: אישור SNR1 כמו SNF r ג &#39;ין באמצעות CRISPR / Cas9. ( א ) CRISPR / Cas9 המושרה מוטציות Indel (ירוק) ב SNR1 לוקוס. ( B ) נציג Indels ב SNR1 נגרמת על ידי שני CRRPR ספציפיים שונים CRISPR פלסמידים (C5 ו C6 בהתאמה). RH הוא זן WT ו C5 ו C6 הם מוטציות SNF r . (B נלקח מתוך התייחסותS = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> איור 5. Insertional Mutagenesis באמצעות CRISPR / Cas9. ( א ) הוספת גנים משלימים או מהונדסים לתוך לוקוס SNR1 על ידי CRISPR / Cas9 בתיווך אינטגרציה ספציפית לאתר. שתי האוריינטציות האפשריות של הגן המיני DHFR * שהוכנס והפריימרים המשמשים לזיהוי, F1 / 2 ו- R1 / 2 מייצגים את אתרי הפרימינג של oligos המשמשים ב- PCRs אבחון. ( B ) אבחון PCRs של אחד snr1 :: DHFR * לשכפל, RH משמש כפקד WT. PCR של GRA1p נכלל כביקורת בדיקת איכות הדנ&quot;א הגנומי כתבניות. כוכביות מציינות נתיבים עם להקות לא ספציפיות (איור 5 ב נלקח מן להפנותCE 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> איור 6: נוקאוט גנים באמצעות CRISPR / Cas9. עיצוב קלאסי עבור CRISPR / Cas9 בתיווך תחליף גנטי הומולוגיים ב T. gondii . הכיוון של transgene שהוכנס קבוע במקרה זה. F1 / R1, F2 / R2 ו- F3 / R3 מייצגים את אתרי הפרימינג של oligos המשמשים PCRs אבחון. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> קובץ נתונים 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r קובץ הצלב fאו להשתמש ב R / qtl, &quot;CSV&quot; פורמט. קובץ .csv אחד שניתן לטעון ל- R / qtl עם אפשרות הפורמט = &quot;csv&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">לחץ כאן להורדת הקובץ.</a> קובץ נתונים 2: (chrid txt, גנוטיפ txt, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt ו- phenos.txt). ME49-FUDR R X VAND-SNF R קבצים צולבים לשימוש R / qtl, &quot;גארי&quot; פורמט. שש. קבצי txt שניתן לטעון ב R / qtl עם אפשרות פורמט = &quot;gary&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">לחץ כאן להורדת הקובץ.</a> קובץ נתונים 3. גיליון אלקטרוני עם Progeny SNPs על פני ה- SNF <stronG&gt; QTL Locus. מכיל גיליון עבודה אחד עם SNPs צאצאים, וגליון עבודה שני עם הנתונים פנוטיפי של ההורים הצאצאים של הצלב. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">לחץ כאן להורדת הקובץ.</a> קובץ משלים 1: פרטי פרוטוקול נוסף. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">לחץ כאן להורדת הקובץ.</a> קובץ משלים 2: פרוטוקול 5 - ניצול של בחירה שלילית ב SNR1 Locus עבור השלמה גנטית או בנייה זנים מהונדס . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">לחץ כאן להורדת הקובץ.</a></a>

פרטים מוצגים על איך מיפוי QTL עם גנום שלם רצף גנטי מבוסס ניתן להשתמש כדי לזהות הגן עמידות התרופה ב Toxoplasma gondii וכיצד ניתן לאמת זאת עם מערכת CRISPR / Cas9 כי ביעילות עריכת יעד גנומי, במקרה זה גן ההתנגדות לסמים.

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיית מיפוי ה-quantitative trait locus (QTL) ועריכת הגנום באמצעות CRISPR/Cas9 היא לזהות ולאחר מכן לאמת גן המעורב בעמידות ל-sinefungin ב-Toxoplasma. שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בפרזיטולוגיה, כגון הבסיסים הגנטיים לווריאנטים, פתוגנזה ועמידות לתרופות. היתרון המרכזי של טכניקות אלו הוא השימוש בנתוני ריצוף גנומי מלא לצורך ניתוח QTL מדויק, ושימוש ב-CRISPR/Cas9 לעריכת גנום לצורך מניפולציה גנטית יעילה ב-Toxoplasma.את הפרוצדורה תדגים ד"ר Robin Powell, עמיתה למחקר מהמעבדה שלי. טפילים מסוג Toxoplasma gondii גודלים בתרבית של תאי פיברובלסט מעור של בני אדם (HFF) בשכבה רציפה (confluent), המושתלים בבקבוקי T25 עם מצע D10. כדי לבחון עמידות של שיבוטי צאצאים בודדים ל-sinefungin, יש לגדל כל שיבוט לצפיפות טפילים גבוהה, עד שרוב הטפילים מתחילים ללוות (lyse) את תאי המארח.לאחר הכנת תמיסת הטפילים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, השתמש בפעפעת כדי להעביר 2.5 times 10 to the fifth טפילים לבקבוק תרבית T25 HFF חדש המכיל מצע D10, עם ריכוז עבודה של 0.3 micromolar של התרופה sinefungin. גדל את הטפילים בטמפרטורה של 37 degree celsius וב-5%CO2 למשך שבעה עד 10 ימים. בחן את השכבה החד-שכבתית (monolayer) של תאי HFF תחת מיקרוסקופ פאזה הפוך ודרג את הצאצאים לפי פנוטיפ הגדילה בנוכחות התרופה sinefungin.לדוגמה, ניתן לתת ציון אפס להעדר גדילה וציון אחד לגדילה וליזיס של השכבה החד-שכבתיות (monolayer). לאחר שכל הצאצאים דורגו, הנתונים ישמשו כפנוטיפ בינארי למיפוי לוקוס של תכונה כמותית (QTL mapping). כדי לזהות את המוטציה הגורמת לכך, רצפי רצף גנומי מלא של הצאצאים מיושרים לגנום הייחוס של זן ה-van הרגיש ל-sinefungin, מתבצע קריאה של SNPs והלוקוס של ה-QTL נסרק לאיתור SNP הקשור לעמידות ל-sinefungin.אישור לכך ש-SNR1 הוא הגן המקנה עמידות לסינפונגין יבוצע על ידי השבתה של SNR1 ברקע של זן בר הרגיש לסינפונגין, באמצעות מוטציות indel המושרות על ידי CRISPR/Cas9. כדי לבנות את פלסמיד ה-CRISPR הספציפי ל-SNR1, משתמשים בפלסמיד CRISPR המכוון ל-UPRT כתבנית במוטגנזה מכוונת לאתר מבוססת PCR באמצעות פריימרים שתוכננו במיוחד. תוצרי המוטגנזה המכילים את פלסמידי ה-CRISPR הספציפיים לגן המבוקש מותמרים לתאי E.Coli.לאחר מכן נבחרים שיבוטים בודדים ומגודלים במצע LB, והפלסמידים שחולצו נותחים באמצעות אלקטרופורזה של DNA בג'ל כדי לבדוק את גודלם. לאחר מכן הפלסמידים יעברו ריצוף כדי לאשר את רצף ה-guide RNA הספציפי למטרה. כאשר פלסמיד ה-CRISPR הספציפי למטרה מוחדר לתא של Toxoplasma, ה-guide RNA מכוון את גרעין ה-Cas9 למטרה כדי לגרום לשבירה של רצף DNA דו-גדילי בלוכוס ספציפי במטרה.שבר ה-DNA מתוקן לאחר מכן על ידי פעילות חיבור לא-הומולוגית המועמדת לטעויות, דבר המוביל למוטציות indel בגן המטרה. יומיים עד שלושה ימים לפני התעתוק (transvection) של הטפילים עם פלסמיד CRISPR הספציפי ל-SNR1, הוסיפו מספיק טפילים לבקבוק T25 המכיל שכבת מונואלייר של תאי HFF בצפיפות (confluent) כדי להשיג ליזיס של 70% עד 80% של תאי ה-HFF בתוך יומיים עד שלושה ימים. בחנו את התרבית תחת מיקרוסקופ פאזה הפוך כדי לוודא ששכבת המונואלייר של ה-HFF עברה ליזיס בשיעור של 70% עד 80% על ידי הטפילים.הסר בעדינות את המצע באמצעות פיפט ושטוף את התאים מפני השטח של הבקבוק בעזרת 5 milliliters של cytomix buffer. העבר את תמיסת הטפילים למבחנה קונית של 15 milliliter. העבר את תמיסת הטפילים דרך מזרק של 10 milliliter עם מחט קהה במידה 22 gauge, פעמיים עד שלוש פעמים.כדי להסיר תאי HFF ושאריות תאיות, סננו את תמיסת הטפילים דרך ממברנה בעלת גודל נקבים של 3 microns אל תוך מבחנה קונית חדשה. רספדו את הטפילים המסוננים באמצעות סנטריפוגציה ב-400 ×g למשך 10 דקות. שפכו את העלייה (supernatant) והשביו את הטפילים הרספודים ב-10 milliliters של cytomix buffer.הוצאו אליקוט של 10 µL, כדי לקבוע את ריכוז הטפילים באמצעות המוציטומטר. רספו שוב את שאר התוךן על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-400 ×g למשך 10 דקות. הסירו את הנוזל העליון והשביו שוב את המשקע בתוך בופר הערבוב כדי להגיע לצפיפות של 4×10⁷ טפילים למילליטר.בקוובטה בעלת מרווח של ארבעה מיליליטר, ערבבו 250 עד 300 µL של תמיסת הטפיל עם 7.5 µg של פלסמיד CRISPR, שישה µL של ATP ושישה µL של גלוטתיון. בצעו אלקטרופורציה לטפילים, בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי לטרנספקציה של T gondii. כללו אלקטרופורציה נפרדת כביקורת שלילית, שבה פלסמיד CRISPR פונה לאתר אחר.גדלו את הטפילים שעברו אלקטרופורציה בבקבוק T25, עם תאי HFF, בטמפרטורה של 37 degree celsius למשך יומיים. כדי להתחיל את ההליך לבדיקת המוטציות המושרות, ראשית, החליפו את המצע בבקבוק בחמישה מיליליטר של D10, המכיל 0.3 micromoles של sinefungin. השאירו את הטפילים ואת מצע הברירה למשך שלושה מעברים לפחות, עד שהמאגר העמיד יהיה יציב.כפי שעולה מהיעדר צמיחת טפילים בקבוצת הביקורת השלילית, לעומת צמיחת טפילים חסונה בקבוצה הניסויית. בצע סב-קלונינג (subclone) למאגר העמיד ל-sinefungin כדי לקבל שושלות קולוניאליות. אסוף טפילים שזה עתה יצאו מהתאים (egress), טהר אותם באמצעות סינון בממברנה של 3 מיקרון, ובצע סב-קלונינג לתוך פלטות של 96 בארות, המוזרעות בתאי HFF בצפיפות (confluent) ב-150 µL של מצע D10.גדלו את תרביות התת-שיבוט (subcloning) באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 degree celsius למשך שבעה עד 10 ימים, ללא הפרעה לפלטות. לאחר שבעה עד 10 ימים, בדקו את פלטות ה-96 בארות תחת מיקרוסקופ פאזה הפוך. חפשו בארות המכילות פלאק (plaque) אחד בלבד וסמנו בארות אלו.העבירו את התאים מכל באר לפלטות 24 בארות, שבהן נזרעו תאי HFF. דגרו בטמפרטורה של 37 °C. כאשר הטפילים מתחילים לליזות את השכבה החד-שכבתית (monolayer), העבירו 50 µL מתמיסת הטפילים לבאר חדשה כדי לשמר את הזן, ואספו את השאר לצורך בידוד genomic DNA.מרכזו את שאר תמיסת הטפילים בצנטריפוגה ב-1000 ×g למשך 10 דקות. שטפו את הטפילים שהורכזו ב-PBS ומרכזו אותם שוב. בודדו DNA גנומי מהתאים שהורכזו באמצעות קיט מסחרי או על ידי הרתחה, והמיסו מחדש את הטפילים ב-50 עד 100 µL של PBS.לבסוף, בצעו PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי להשיג מקטע של הגן SNR1 לצורך ריצוף. צאצאים של ההכלאה, שהופקו באמצעות זן ME49 עמיד ל-FUDR וזן van עמיד ל-sinefungin של ההורים, נבדקו לעמידות לתרופה sinefungin, כפי שהתבטאה בצמיחה ובליזיס של שכבת המונולייר של HFF. סריקת QTL הניבה שיא משמעותי אחד בכרומוזום 9, המשתרע על פני כ-1 MBP.המוטציה הסיבתית ממוקמת באזור זה. ריצוף הגנום המלא הוביל לזיהוי המוטציה. SNPs של הצאצאים בתוך לוקוס ה-QTL יובאו לגיליון אלקטרוני ונסרקו כדי למצוא תבנית שבה לצאצאים העמידים ל-sinefungin, המסומנים בצהוב, יש SNP, בעוד שלצאצאים הרגישים ל-sinefungin, המסומנים בירוק, אין SNP כזה.רק SNP אחד המסומן באדום התאים לתבנית זו, שמובילה לקודון עצירה מוקדם בגן של נשא חומצות אמינו משוער בשם SNR1. כאשר פלסמיד CRISPR-Cas9 המכוון ל-SNR1 הוכנס באמצעות אלקטרופורציה למאבק של פראסייט מסוג wild type הרגיש לסינפונגין (sinefungin), התקבלו מוטנטים עמידים כאשר הם גודלו בסינפונגין. לעומת זאת, לא התקבלו פראסייטים עמידים לסינפונגין עם פלסמיד CRISPR שכוון לאתר אחר.מספר מוטנטים של CRISPR העמידים לסינפונגין (sinefungin) שובטו באזור סביב יעד ה-guide RNA של SNR1 ורצפם. תוצאות מייצגות מזן ה-RH הפראי ומהמוטנטים C5 ו-C6 העמידים לסינפונגין מראות שבכל מוטנט היה indel ששיבש את רצף הקידוד של הגן SNR1. אין לשכוח שעבודה עם Toxoplasma gondii עלולה להיות מסוכנת, שכן הוא מידבק לבני אדם.יש לנקוט באמצעי זהירות במהלך הליך זה, כגון טיפול נכון בחפצים חדים שעלולים לבוא במגע עם הטפיל. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הכנסה של גן אקסוגני לאתר ספציפי בתיווך CRISPR/Cas9, במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון קומפלמנטציה גנטית או בניית טפיל טרנסגני. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הפרזיטולוגיה המולקולרית לחקור את הביולוגיה המורכבת ואת מנגנוני הפתוגנזה של Toxoplasma gondii.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע ניתוח QTL באמצעות נתוני ריצוף גנומי, וכן של ביצוע מטאבולציה גנטית של Toxoplasma gondii באמצעות עריכה גנטית בשיטת CRISPR/Cas9.

qtl-mapping-crisprcas9-editing-to-identify-drug-resistance-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של...

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג...

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי וכל רצף הגנום. בנוסף, מערכת להמרת ה-DNA בתאים נגועים מתוארת שיכול לשמש למיפוי גנטי. שיטה זו יכולה להיות ישימה באופן נרחב למערכות חיידקים חסרות מערכות טרנספורמציה וכלים גנטיים מולקולריים.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

Forward genetics היא גישה רבת עוצמה לזיהוי גנים בפתוגנים תוך-תאיים החשובים לעמידות לחסינות אוטונומית של התאים. הגישה הנוכחית משתמשת בתאי חיסון מולדים, במיוחד מקרופאגים, כדי לזהות גנים חדשים של טוקסופלזמה גונדי החשובים להתחמקות חיסונית.

קדימה גנטיקה מסכי שימוש המקרופאגים לזיהוי<em&gt; Toxoplasma gondii</emחסינות אוטונומית נייד להתנגדות לIFN-γ-Dependent&gt; גנים חשובים

אנו מתארים שיטה ליצירת glmS-המבוסס על מוטציות תמונות ציפורים מותנה ב- falciparum הפלזמודיום באמצעות עריכת הגנום CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחדיר נוקאאוט גן לתוך amastigote החילוץ של טריאנוסומה cruzi, באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. פנוטיפ הצמיחה ניתן לעקוב גם על ידי ספירת התאים של התרבות האמסטימית axenic או על ידי התפשטות amastigote תאיים לאחר הפלישה התא מארח.

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

מוצג כאן הוא פרוטוקול להעריך את היעילות עכבות של תרכובות כימיות נגד הצמיחה מחוץ למוח טוקסופלזמה gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה. הטכניקה משמשת כדי לאשר את העיכוב ספציפיות על ידי מחיקה גנטית של הגן היעד המתאים. עיכוב של LHVS נגד TgCPL פרוטאז מוערך כדוגמה.

קביעת יעילות מעכבי כימית נגד הצמיחה טוקסופלזמה Gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

למד מיפוי QTL ועריכת CRISPR/Cas9 לזיהוי גני התנגדות לתרופות ב-Toxoplasma gondii. שיטה זו מאפשרת ניתוח גנטי מדויק ומניפולציה יעילה של הגנום הטפילי.

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג 'ין ההתנגדות התרופה ב

גלה סרטונים נוספים