תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

המטרה הכוללת של שיטה פשוטה זו היא לבסס קווי תאים לימפובלסטואידים מסוג B, או B-LCLs עם יעילות אימורטליזציה גבוהה תוך שימוש בכמות קטנה בלבד של דם ולחסוך זמן בין התחלה לשימור בהקפאה. זוהי שיטה חדשנית להנצחת תאי B אנושיים מדם מלא על ידי ליזה של כדוריות דם אדומות. B-LCLs מספקים מקור רב ערך לביו-חומרים לביצוע מחקרים שונים.

היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שרק 0.5 מיליליטר דם מספיקים להשגת B-LCLs עם יעילות אימורטליזציה וכדאיות תאים גבוהה. להקים B-LCLs על ידי נגיף אפשטיין-בר, או EBV, הפיכת לימפוציטים B, השיטה הנפוצה לתאים חד-גרעיניים נפרדים בדם היקפי או PBMC, על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות Ficoll. עם זאת, כאשר הדגימה היא פחות ממיליליטר אחד של ליז כדוריות הדם האדומות, התוספת תיכשל.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר היה לנו קשה לבודד את ה-PBMC מתאי דם אדומים קטנים באמצעות שיטת הפרדת שיפוע צפיפות. כדי להכין את EBV, ביום הראשון יש להתחיל בהפשרת תאי B95-8 ולתרבית אותם בבקבוק תרבית T25 בשישה מיליליטר של RPMI 1640 Medium מלא בתוספת 10% FBS, שני מילימולר של L-גלוטמין ואנטיביוטיקה. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

ביום השני, תחת מיקרוסקופ, התבונן במורפולוגיה של התא. התאים במצב טוב כשהם בהירים ועגולים. הוסף 10 מיליליטר RPMI 1640 בינוני שלם לתרבות.

ביום הרביעי, הוסיפו 10 מיליליטר של מדיום טרי והעבירו את התאים לבקבוק תרבית T75. לאחר מכן, ביום השמיני, הוסיפו עוד 20 מיליליטר של מדיום ושמרו על התאים במשך שמונה ימים מבלי להוסיף מדיום טרי. ביום ה-16, בדקו את התאים תחת המיקרוסקופ.

לאחר מכן אסוף 12 מיליליטר תאים לצינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, שימור בהקפאה של התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת והפשרה מהירה של התרביות ב-37 מעלות צלזיוס. חזור על הפשרת ההקפאה, שלוש פעמים נוספות עד שחלקיקי הנגיף משתחררים מהתאים.

צנטריפוגה את התרבויות ב -240 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, סנן את הסופרנטנט דרך מסנן 0.22 מיקרון. יש לצרוך 12 מיליליטר מהפילטר לכל צינור ולאחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לצינור של 50 מיליליטר, הוסף 0.5 מיליליטר של דם מלא שעבר נוגד קרישה על ידי EDTA K2. הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות לכל הדם וערבב היטב. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. לאחר מכן הוסף במהירות חמישה עד שבעה מיליליטר של 1x PBS כדי לעצור את תגובת הליזיס.

לאחר הוספת מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות לדם, הקפד לערבב היטב. היפוך מבטיח שהתגובה תסתיים בזמן. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב -240 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

תאי הדם הלבנים ישקעו בתחתית הצינור. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את המשקעים על ידי הוספת שבעה מיליליטר של 1640 Basic Medium. ואז צנטריפוגה את התמיסה לפני שתחזור על הכביסה.

עם 300 מיקרוליטר של מדיום טרנספורמציה, השעו מחדש את גלולת התא. לאחר מכן כדי לבצע זיהום EBV, הוסף 60 מיקרוליטר של 20 מיקרוגרם למיליליטר של ציקלוספורין A לתרחיף התאים. הפשרה מהירה של EBV ב-37 מעלות צלזיוס והוספת 240 מיקרוליטר של הנגיף לתאים.

מערבבים היטב את המתלה ומעבירים 200 מיקרוליטר לבאר לצלחת של 96 בארות. לאחר מכן דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. בחודש הראשון לאחר הדבקה ב-EBV, החלף מחצית מהמדיום בתרבית התאים פעם בשבוע.

ביום השביעי, רק שכבה עבה של שברי תאים נראית מתחת למיקרוסקופ. לאחר חודש של זיהום, אשכולות תאים לימפובלסטואידים נראים מתחת לשכבה עבה של שברי תאים. מנקודה זו ואילך, החלף מחצית מהמדיום כל שלושה ימים עד שצבירי התאים נראים בבירור במיקרוסקופ.

לאחר השעיית התאים, העבירו את המתלה לבארות של צלחת 24 בארות. לאחר מכן, בהתאם לקצב צמיחת התאים, כאשר מדיום התרבות הופך לצהוב, הכפל את נפח ה-RPMI 1640 Medium השלם. כאשר אשכולות תאים לימפובלסטואידים נראים לעין בלתי, העבירו את התרבית לבקבוק תרבית T25.

כאשר מדיום התרבות הופך לצהוב, הכפל את נפח המדיום עד שהנפח מתרחב ל -10 עד 15 מיליליטר. לפני ההקפאה, החלף את המדיום 24 שעות קדימה בכל פעם. לאחר מכן כדי להקפיא את התאים, צנטריפוגה את תרחיף התאים והשתמש במונה תאים כדי לספור את התאים.

עם תמיסת המלאי הקפואה המכילה 90% FBS ו-10% DMSO, התאם את התרחיף לצפיפות של חמש עד 10 פעמים 10 לתאים השישיים למיליליטר. לאחר מכן הקפיאו את התרחיף בקצב של מעלה אחת צלזיוס לדקה עד מינוס 80 מעלות צלזיוס לפני העברת התאים הקפואים ישירות לחנקן נוזלי. במהלך תהליך הטרנספורמציה, השינויים המורפולוגיים של התאים נראים במיקרוסקופ אור.

לאחר שבעה ימים של הדבקה, אשכולות קטנים של תאים נראים בבירור בשיטת הפרדת שיפוע הצפיפות, בעוד שרק שכבה עבה של שברי תאים נראית משיטת הליזיס של תאי הדם האדומים. 30 יום לאחר ההדבקה, אשכולות תאים לימפובלסטואידים נראים מתחת לשכבה העבה של שברי התאים. עם שינויים תכופים יותר במדיום, פסולת התאים מצטמצמת ואשכולות התאים נראים בבירור ונראים דומים לתרבית שהוקמה על ידי הפרדת שיפוע צפיפות.

לבסוף, נעשה שימוש בבדיקת MTT כדי להעריך את הכדאיות של B-LCL. התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך שתאי B-LCLs שתורבו בשיטת ליזיס הדם האדום היו ברי קיימא משמעותית מהתרבית שהוקמה בשיטת הפרדת שיפוע הצפיפות. לאחר השליטה, ניתן לבצע את תהליך הטרנספורמציה הנגיפית של EBV תוך 30 דקות כאשר הוא מבוצע כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים B-LCLs בשיטת ליזה פשוטה וחוסכת זמן של כדוריות דם אדומות ללא טיהור קודם של לימפוציטים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו האיצה את התקדמות המחקר הגנומי, הטרנסקריפטומיקה והפרוטאומיקה של מחלות הקשורות ל-EBV ויישום זה בייצור נוגדנים חד-גרעיניים. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים אנושיים, כגון EBV עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות בעת ביצוע הליך זה.