Name: תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד שיטה חדשנית להקמת שורות תאי B לימפובלסטואידיים (B-LCLs) באמצעות מיצוי תאי דם אדומים ונגיף Epstein-Barr. השיטה מצריכה רק 0.5 מ"ל דם ומקצרת משמעותית את זמן העיבוד עד להקפאה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקטים המרכזיים של האקדמיה הסינית למדעים (KFZD-SW-205), מערכת תמיכה טכנולוגית אסטרטגית של משאבים ביולוגיים של האקדמיה הסינית למדעים (CZBZX-1).

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של לשכת גנטיקה וביולוגיה התפתחותית, ואת הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות המוסדיות על רווחת אדם. 1. הכנת וירוס EB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, להפשיר B95-8 תאים והתרבות 6 מ&quot;ל להשלים RPMI 1640 בינוני, בתוספת 10% בסרום שור עוברית, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, ואנטיביוטיקה (100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל, 100 פניצילין U / mL) בבית בקבוק תרבות T25. מניח את בקבוק התרבות ב- CO 2 באינקובטור 5% ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, לשמור על מורפולוגיה התאים תחת מיקרוסקופ. תאים הם במצב טוב כשהם מוארים ועגולים. הוסף 10 מ&quot;ל בינוני RPMI להשלים 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, להוסיף 10 מ&quot;ל בינוני טרי שלם RPMI 1640, ולאחר מכן להעביר בקבוק תרבות T75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 8, להוסיף 20 מ&quot;ל בינוני RPMI להשלים 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים למשך 8 ימים מבלי להוסיף בינוני טרי, כלומר, רעב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 16, להתבונן תאיםשנצפו תחת מיקרוסקופ. אוספים את התאים בצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל, 12 מ&quot;ל / צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריו לשמר ב -80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה, ולאחר מכן להפשיר במהירות על 37 מעלות צלזיוס. חזור 3 פעמים עד חלקיקי הנגיף משתחררים מהתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 240 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את supernatant באמצעות C 0.22 מיקרומטר מסנן, aliquot, 12 מ&quot;ל / צינור, ולאחסן ב -80 °. </li></ol> 2. טיפול דם מלא עם הצפת תמוגה תא דם האדום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל דם מלא anticoagulated ידי EDTA · K 2 לצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 1 חיץ דם תא תמוגה אדום מ&quot;ל (מסוננים לפי 0.22 מיקרומטר לסנן מופשר לטמפרטורת החדר לפני השימוש) אל הדם כולו ומערבבים היטב. מניחים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות. לאחר מכן להוסיף 5 - 7 מ&quot;ל 1x PBS במהירות התגובה להפסיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 240 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. תאי דם לבנים יהיה להאיץ בתחתית של התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, ולשטוף את המשקעים על ידי הוספה בינונית בסיסי 7 מיליליטר 1640. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 240 XG בטמפרטורת החדר. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה במדיום טרנספורמציה 300 μL (בינוני RPMI 1640, המכילה סרום שור העובר 20% ו -10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​phytohemagglutinin (PHA)). </li></ol> 3. EBV זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 60 μL של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ציקלוספורין A (CsA) על השעיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר aliquot של EBV על 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 240 μL EBV על השעיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב ומניחים ההשעיה תא לצלחת 96-היטב, 200 μL לכל טוב. כדי למנוע אידוי, להוסיף 200 μL 1x PBS לכל היטב סביב הצלחת 96-היטב. מניחים את הצלחת CO 2 באינקובטור 5% ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. הרחבה Cryopreservation של B-LCLS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה וחצי של המדיום פעם בשבוע במשך החודש הראשון לאחר ההדבקה EBV. רק Laye עבהr של שברי תאים גלוי תחת מיקרוסקופ על יום 7 (איור 2). לאחר חודש אחד של זיהום EBV, אשכולות תא lymphoblastoid גלויים תחת שכבה עבה של שברי תאים מתחת למיקרוסקופ (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה וחצי של המדיום כל 3 ימים עד צבירי תאים גלויים לעין תחת מיקרוסקופ (איור 2). בדרך כלל, תהליך זה לוקח בין 10 ל -20 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ערבוב, pipet התאים ולהעביר לצלחת 24 באר. להכפיל את נפח בינוני תרבות עם שלם RPMI 1640 בזמן שהוא הופך צהוב. תהליך זה תלוי בקצב צמיחת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, ולהעביר את התאים בקבוק תרבות T25. להכפיל את נפח בינוני תרבות כפי שמתברר צהוב עד נפח בינוני מתרחב עד 10 - 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית 24 שעות לפני ההקפאה. השעית תא צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 240 x. ספירת תאים עם דלפק תא ולהקפיא בצפיפות של 5 - 10 x 10 6 / מ&quot;ל ב frפתרון המניות אוזן המכיל FBS 90% ו -10% dimethylsulfoxide (DMSO). להקפיא בשיעור של 1 ° C לדקה ל -80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להעביר ישירות לתוך חנקן נוזלי. </li></ol> 5. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-diphenyl-tetrazolium ברומיד (MTT) Assay 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן השעית תא בודד B-LCLS עם המדיום 1640 המכיל סרום שור העובר 10%. זרע 3 x 10 4 תאים לכל טוב על צלחת 96-היטב, 100 μL לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת ב 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 - 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף MTT (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לבארות שבו תאים גדלים להתרחק אור עבור 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת תא צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 168 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ולהוסיף 100 μL DMSO לכל טוב. הערה: תיזהר. אל תיגעו גבישי צבע דמוי מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הצלחת במשך 10 דקות במהירות נמוכה כדי לפזר את הגבישים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליטה מדודה ב 570 ננומטר על ידיבאמצעות ספקטרופוטומטר microplate. </li></ol>

<ol><li>Mohyuddin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+EBV-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).</li>
<li>Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+lymphoblastoid+cell+lines+from+monozygotic+twins+discordant+in+severity+of+autism+reveals+differential+regulation+of+neurologically+relevant+genes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes.</a> BMC Genomics. 7, 118(2006).</li>
<li>Toda, T., Sugimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B-lymphoblasts+and+the+proteome+database%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).</li>
<li>Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Epstein-Barr+virus-transformed+B+cell+lines+for+the+generation+of+immunoglobulin-producing+human+B+cell+hybridomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas.</a> J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+%26+characterization+of+lymphoblastoid+cell+lines+from+patients+with+multiple+primary+neoplasms+in+the+upper+aero-digestive+tract+%26+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals.</a> Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).</li>
<li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Routine+Method+for+the+Establishment+of+Permanent+Growing+Lymphoblastoid+Cell-Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines.</a> Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).</li>
<li>Oh, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).</li>
<li>Louie, L. G., King, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel-Approach+to+Establishing+Permanent+Lymphoblastoid+Cell-Lines+-+Epstein-Barr-Virus+Transformation+of+Cryopreserved+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes.</a> Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).</li>
<li>Tremblay, S., Khandjian, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+use+of+long-term+frozen+lymphocytes+for+the+establishment+of+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines.</a> Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).</li>
<li>Reidy, J. A., Wheeler, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+age+and+Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).</li>
<li>Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBV+immortalization+of+human+B+lymphocytes+separated+from+small+volumes+of+cryo-preserved+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood.</a> Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).</li>
<li>Lacelle, C., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+lymphoblastoid+cell+lines+from+frozen+blood+of+extremely+old+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals.</a> Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).</li>
<li>Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greatly+simplified+method+of+establishing+B-lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines.</a> Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).</li>
<li>Ventura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Simple+Method+for+the+Epstein-Barr+Virus+Transformation+of+Lymphocytes+from+Members+of+Large+Families+of+Reunion+Island%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Hered%22%5BJournal%5D)">Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island.</a> Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).</li>
<li>Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoblastoid+Cell-Lines+from+Frozen+Whole-Blood+-+a+Quick+and+Economical+Safeguard+for+Linkage+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis.</a> Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).</li>
<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-Examination+and+Further+Development+of+a+Precise+and+Rapid+Dye+Method+for+Measuring+Cell-Growth+Cell+Kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill.</a> J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).</li>
<li>Bogoslovsky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+enumeration+of+endothelial+progenitor+and+endothelial+cells+from+peripheral+blood+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials.</a> Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).</li>
<li>Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+flow+cytometric+immuno-staining+of+T-cell+perforin+is+preserved+using+diethylene+glycol+for+erythrocyte-lysis+but+lost+by+the+use+of+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride.</a> Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).</li>
<li>Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+A+resource+for+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).</li>
<li>Tosato, G., Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+Virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אנו מדווחים על פיתוח של שיטה חדשה המנציחה תאי B האדם מן הדם כולו על ידי lysing כדוריות דם אדומות, ואת כדאיות התא שלה הוקמה ב-LCLS הוערכה על ידי assay MTT. התוצאות הראו כי כדאיות התא של B-LCLS הוקמה בשיטת תמוגה תא דם אדום הוא גבוה הרבה יותר מזה של שיטת ההפרדה שיפוע צפיפות. היתרון העיקרי של שיטת תמוגה תא דם אדום הוא שזה פשוט ודורש נפח קטן (קטן כמו 0.5 מיליליטר) של דם עבור הקמת קו תא קבע עם שיעור הצלחה גבוה כדאיויות תא גבוהות. <p class="jove_content" style=";text-align:right;dire...

תאי B במנוחה יכולים להפוך על ידי נגיף אפשטיין-בר (EBV) במבחנה לשורות תאי לימפובלסטואיד B המתרבים באופן פעיל (B-LCLs). B-LCLs דומים לתאי נבט בהתמיינות ובהתפתחות, ושיעור המוטציות הסומטיות של B-LCLS היה רק 0.3%1, עם שינוי גנטי ופנוטיפי זניח. לכן, B-LCLs, כתחליפים לתאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs), האיצו באופן משמעותי את התקדמות מחקר הגנומיקה, הטרנסקריפטומיקה והפרוטאומיקה של מחלות הקשורות ל-EBV2,3. יתר על כן, ל-B-LCLs יש גם יישום חשוב בבדיקת נוגדנים חד-שבטיים4,5. 
פותחו מספר שיטות לאימורטליזציה של לימפוציטים מסוג B על ידי EBV. ההליכים הנפוצים העיקריים כוללים בידוד של לימפוציטים מסוג B ושימוש בשורות תאי B95-8 לייצור EBV זיהומי. מבידוד לטרנספורמציה, שיטות אלה מחולקות לשלוש אסטרטגיות. לימפוציטים מופרדים מדם טרי על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות וטרנספורמציה של EBV ישירות6-8, המכונה שיטת הפרדת שיפוע צפיפות במחקר זה. עם זאת, טכניקות אחרות מתגברות על הקושי בהעברת דם טרי ומשתמשות בהליך להקפאת לימפוציטים מטוהרים ולאחר מכן הפשרה וזיהום EBV9-11. דם מלא שמור בהקפאה יכול לשמש גם לבידוד של לימפוציטים B וטרנספורמציה12,13. בנוסף לצנטריפוגה של שיפוע צפיפות להפרדת לימפוציטים B, חלק מהחוקרים משתמשים במיון תאים מגנטיים כדי לבחור לימפוציטים B12. עם זאת, הפרדה מגנטית היא תהליך יקר, מורכב וגוזל זמן. למרות ששיטות אלו שימושיות להנצחת לימפוציטים מסוג B עם אחוזי הצלחה גבוהים, הצורך לטפל במספר רב של דגימות קליניות ונפח הדם הקטן יחסית דורשים שיטה פשוטה יותר להקמת קו תאים קבוע.
שיטה נוספת פחות נפוצה היא שימוש בדם מלא כמקור לתאים גרעיניים לזיהום EBV והקמת B-LCL. שיטות אלו מפשטות את הטכניקה על ידי השמטת הליך ההפרדה. רק כמות קטנה של דם מלא,טרי 14 או קפוא15,16, מספיקה כדי להשיג את שורות התאים. למרבה הצער, יש שונות גדולה בהצלחה ממסמכים15,16 וכמה מבדיקות האימות שלנו. יתר על כן, מושבות שעברו טרנספורמציה כמעט ולא מזוהות במיקרוסקופ בגלל הזיהומים המזהמים הגדולים. לפיכך, נדרשת שיטה אמינה יותר לטרנספורמציה.
בהתבסס על השיקולים לעיל, פיתחנו שיטה חדשה להקמת B-LCLs ללא טיהור קודם של הלימפוציטים, הנקראת שיטת הליזיס של תאי הדם האדומים. שיטה זו נוחה, חוסכת זמן וישימה למספר רב של דגימות. רק 0.5 מ"ל של דם מלא הספיקו כדי להשיג B-LCLs שניתן להשיג בקלות מתינוקות וקשישים מבלי לפגוע משמעותית בבריאותם.

<table><tbody><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>צנטריפוגה</td></tr><tr><td>מונה תאים אוטומטי&nbsp;</td><td>קאונסטאר</td><td>&nbsp; IC 1000&nbsp;</td><td>לספירת תאים&nbsp;</td></tr><tr><td>Epoch Microplate ספקטרופוטומטר</td><td>BioTek מכשירים</td><td>SN263839</td><td>למדידת הספיגה</td></tr><tr><td>96 באר אשכול תרבית תאים</td><td>קורנינג משולב</td><td>3599</td><td>לוחות פוליסטירן</td></tr><tr><td>24 אשכול תרבית תאים</td><td>באר Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>לוחות פוליסטירן</td></tr><tr><td>25 ס"מ2 בקבוק תרבית תאים</td><td>קן</td><td>707001</td><td>פוליסטירן& נ.ב.פ;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>רכיב של B-LCLs בינוני</td></tr><tr><td>RPMI בינוני 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>עבור B-LCLs בינוני</td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp; &nbsp;</td><td>אמרסקו</td><td>0374</td><td>רכיב של תמיסת B-LCLs בינונית</td></tr><tr><td>100x סטרפטומיצין פניצילין BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>רכיב של B-LCLs</td></tr><tr><td>בינוני Ficoll paque בתוספת</td><td>GE&nbsp; בריאות</td><td>17-1440-03</td><td>לבידוד in vitro של לימפוציטים</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>לגירוי התפשטות לימפוציטים</td></tr><tr><td>ציקלוספורין A</td><td>קיימן&nbsp; כימי</td><td>12088</td><td>לעיכוב השפעת הציטוטוקסיות של תאי T</td></tr><tr><td>מאגר ליזה של תאים אדומים</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>לליזינג תאי דם אדומים</td></tr><tr><td>MTT</td><td>אמרסקו</td><td>0793</td><td>לזיהוי כדאיות התאים</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>להקפאת תאים</td></tr></tbody></table>

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי b lymphoblastoid

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

קיימות מספר שיטות להפיכת לימפוציטים מסוג B על ידי נגיף אפשטיין בר במבחנה לשורות תאים אימורטליות. פיתחנו שיטה חדשה עם אסטרטגיה עוצמתית ופשוטה להקמת B-CL, שיטת הליזיס של כדוריות הדם האדומות. שיטה זו פשטה את הליך ההפרדה של PBMC עם הסרת כדוריות דם אדומות, והשתמשה ב-0.5 מ"ל של דם מלא לביסוס קווי תאים אימורטליים של EBV, שיכולים להתרבות למספר תאים גדול בפרק זמן קצר יחסית עם שיעור הצלחה של 100%. השיטה פשוטה, אמינה, חוסכת זמן וישימה לטיפול במספר רב של דגימות קליניות.

במהלך התהליך של טרנספורמציה, השינויים המורפולוגיים של תאים הם דמיינו ידי מיקרוסקופ אור (איור 2). אשכולות קטנים של תאים נראו בבירור עם שיטת הפרדת שיפוע הצפיפות לאחר 7 ימים של זיהום, בעוד שרק שכבה עבה של שברי תאים גלויות משייט ימס דם אדום תא. עם זאת, צבירי תאי lymphoblastoid גלויים תחת השכבה העבה של שברי תאים 30 יום שלאחר זיהום. עם שינוי בינוני תכוף יותר, הירידות הפסולות תא ואת צבירי התאים גלויים לעין ולהציג אותה התמונה הוקמה בשיטת ה...

שיטת תמוגה תאי דם אדומה פשוט לצורך ביסוס B-LCLS פותחה עם יעילות גבוהה הנצחה, מחייב כמות קטנה של דם חיסכון בזמן מן החניכה cryopreservation.

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

המטרה הכוללת של שיטה פשוטה זו היא להקים קווי תאי B lymphoblastoid, או B-LCLs, ביעילות אימון (immortalization) גבוהה תוך שימוש בכמות קטנה של דם וחיסכון בזמן שבין תחילת התהליך להקפאה (cryopreservation). זוהי שיטה חדשנית לאימון של תאי B אנושיים מדם מלא על ידי ליזיס של תאי דם אדומים. תאי B-LCLs מספקים מקור בעל ערך של חומרים ביולוגיים לביצוע מחקרים שונים.היתרון העיקרי של שיטה זו הוא ש-0.5 milliliters בלבד של דם מספיקים כדי להשיג B-LCLs עם יעילות אלמוות וחיוניות תאים גבוהה. כדי להקים B-LCLs על ידי טרנספורמציה של לימפוציטים B באמצעות נגיף Epstein-Barr, או EBV, נעשה שימוש בשיטה הנפוצה של הפרדת תאים חד-גרעיניים של דם פריפריאלי (PBMC), באמצעות סבוב צנטריפוגי במדרג צפיפות של Ficoll. עם זאת, כאשר הדגימה קטנה ממיליליטר אחד של ליזיס תאי דם אדומים, התהליך ייכשל.הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר גילינו כי בידוד PBMC מכמויות קטנות של תאי דם אדומים הוא קשה בשימוש בשיטת הפרדה במפל דחיסות. כדי להכין EBV, ביום הראשון התחילו בהפשרת תאי B95-8 וטפחו אותם בבקבוק תרבית T25 בששה מיליליטר של מצע RPMI 1640 מלא, בתוספת 10% FBS, שני מילימולר של L-glutamine ואנטיביוטיקה. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.ביום השני, תחת מיקרוסקופ, יש לבחון את מורפולוגיית התאים. התאים נמצאים במצב טוב כאשר הם בהירים ועגולים. הוסף 10 milliliters של Complete RPMI 1640 Medium לתרבית.ביום הרביעי, הוסיפו 10 milliliters של מצע טרי והעבירו את התאים לבקבוק תרבית T75. לאחר מכן, ביום השמיני, הוסיפו 20 milliliters נוספים של מצע ותחזקו את התאים במשך שמונה ימים ללא הוספת מצע טרי. ביום ה-16, בדקו את התאים תחת המיקרוסקופ.לאחר מכן, אספו 12 milliliters של תאים למבחנות צנטריפוגה של 15 milliliter. בשלב הבא, הקפיאו את התאים בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius למשך שעה אחת והמיסו את התרביות במהירות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. חזרו על תהליך ההקפאה וההפשרה שלוש פעמים נוספות עד לשחרור חלקיקי הווירוס מהתאים.סבבו את התרביות בצנטריפוגה ב-240 ×g בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, סננו את הנוזל העליון דרך מסנן של 0.22 מיקרון. חלקו את התסנין למנבובות של 12 מיליליטר לכל מנבובת ואחסנו את המנבובות במינוס 80 מעלות צלזיוס.למבחנה של 50 milliliter, הוסף 0.5 milliliters של דם מלא שעבר אנטי-קואגולציה באמצעות EDTA K2. הוסף מיליליטר אחד של בופר לליזה של תאי דם אדומים לדם המלא וערבב היטב. הדגר את התערובת בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. לאחר מכן, הוסף במהירות חמישה עד שבעה milliliters של 1x PBS כדי לעצור את תגובת הלליזה.לאחר הוספת תמיפת ליזיס של תאי דם אדומים לדם, יש לוודא שהתערובת מעורבבת היטב. היפוך המבחנה מבטיח את סיומו של התגובה במועד. לאחר מכן, סבב את המבחנה בצנטריפוגה ב-240 ×g בטמפרטורת החדר למשך five minute.תאי הדם הלבנים ישקיעו בתחתית המבחנה. יש להסיר את הנוזל העליון (supernatant) ולשטוף את המשקע על ידי הוספה של שבעה מיליליטר של 1640 Basic Medium. לאחר מכן, יש לצנטריפוג את התמיסה לפני חזרה על פעולת השטיפה.שחזר את משקע התאים באמצעות 300 µL של תוצר טרנספורמציה. לאחר מכן, כדי לבצע הדבקה ב-EBV, הוסף לתלי התאים 60 µL של Cyclosporin A בריכוז 20 µg/mL. הפשר במהירות מנה של EBV בטמפרטורה של 37 °C והוסף 240 µL של הנגיף לתאים.ערבבו היטב את התרחיף והעבירו 200 µL לכל באער בלוח 96 באערים. לאחר מכן, דגרו את הלוח בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. במהלך החודש הראשון לאחר ההדבקה ב-EBV, החליפו מחצית ממצע גידול התאים פעם בשבוע.ביום השביעי, נראה תחת המיקרוסקופ רק שכבה עבה של שרידי תאים. לאחר חודש אחד של זיהום, ניתן להבחין בצבירי תאים לימפובלסטואידיים תחת שכבה עבה של שרידי תאים. מנקודה זו ואילך, יש להחליף מחצית מהתווך מדי שלושה ימים, עד שצבירי התאים ייראו בבירור תחת המיקרוסקופ.לאחר תליית התאים מחדש, העבירו את התליה לבארות של פלטת 24 בארות. לאחר מכן, בהתאם לקצב גדילת התאים, כאשר מצע התרבית הופך לצהוב, הכפילו את נפח מצע ה-RPMI 1640 המלא. כאשר צבירי תאי לימפובלסטים נראים לעין, העבירו את התרבית לבקבוק תרבית T25.כאשר תוצר המדיום הופך לצהוב, הכפילו את נפח המדיום עד שהנפח יתרחב ל-10 עד 15 milliliters. לפני ההקפאה, החליפו את המדיום 24 שעות מראש. לאחר מכן, כדי להקפיא את התאים, סבבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה והשתמשו במונה תאים כדי לספור את התאים.בעזרת תמיסת המלאי הקפואה המכילה 90% FBS ו-10% DMSO, כוון את צפיפות התוך-תרחיף ל-5 עד 10 כפול 10⁶ תאים למיליליטר. לאחר מכן, הקפא את התרחיף בקצב של מעלה אחת צלזיוס לדקה עד למינוס 80 °C, לפני העברת התאים הקפואים ישירות לחנקן נוזלי. במהלך תהליך הטרנספורמציה, ניתן להבחין בשינויים המורפולוגיים של התאים באמצעות מיקרוסקופיה של אור.שבעה ימים לאחר ההדבקה, ניתן להבחין בבירור בצבירים קטנים של תאים בשימוש בשיטת הפרדה במדרג צפיפות, בעוד שבשיטת ליזיס של תאי דם אדומים נראית רק שכבה עבה של שיירי תאים. 30 ימים לאחר ההדבקה, נראים צבירי תאים לימפובלסטואידיים מתחת לשכבה העבה של שיירי התאים. עם החלפות תכופות יותר של המצע, כמות פסולת התאים פוחתת, וצבירי התאים נראים בבירור ודומים לתרבית שהוקמה בשיטת הפרדה במדרג צפיפות.לבסוף, נעשה שימוש בבדיקת MTT כדי להעריך את החיות של ה-B-LCLs. התוצאות המוצגות כאן מעידות כי תאי ה-B-LCLs שגודלו באמצעות שיטת הליזיס של כדוריות דם אדומות היו חיוניים באופן משמעותי יותר מהתרבית שהוקמה באמצעות שיטת הפרדה במעבר בצפיפות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את תהליך הטרנספורמציה הוויראלית של EBV בתוך 30 דקות, כאשר הוא מבוצע כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים B-LCLs באמצעות שיטת ליזיס פשוטה וחסכונית בזמן של תאי דם אדומים, ללא טהרה מוקדמת של לימפוציטים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו האיצה את התקדמות המחקרים בתחומי הגנומיקה, הטרנסקריפטומיקה והפרוטאומיקה של מחלות הקשורות ל-EBV, וכן את היישום שלה בייצור של נוגדנים מונוקלונליים. זכרו כי עבודה עם פתוגנים אנושיים, כגון EBV, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.

a-simple-red-blood-cell-lysis-method-for-establishment-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מערכת יעילה של מבנה וניתוח פונקציה של גן...

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

אנו מתארים שיטה להפקת הפך תא B באמצעות קווי Epstein-Barr הוירוס. אנחנו גם להמחיש assay רומן שיכולה לזהות תאים B עתידה לעבור שינוי מוקדם ככל שלושה ימים לאחר ההדבקה.

הקמת Epstein-Barr Virus צמיחה הפך שורות תאים Lymphoblastoid

בסרטון זה אנו מתארים שיטה לחקר הדינמיקה של אברוני הלימפוציטים מסוג B בעקבות הפעלתם עם מיקרו-כדוריות מצופות אנטיגן.

דינמיקה של אברונים בלימפוציטים מסוג B לאחר הפעלה עם חרוזים מצופים אנטיגן

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לגירוי לימפוציטים באמצעות המופילוס אינפלואנזה (NTHi) שאינו ניתן להקלדה ולהערכת התגובה החיסונית. דגירה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים (PBMCs) עם NTHi גורמת לתאי החיידק לעורר לימפוציטים מסוג T, מה שמוביל לייצור ציטוקינים. עם עיכוב הפרשת הציטוקינים, מבוצעת צביעה אימונופלואורסצנטית כדי לזהות את הציטוקינים התוך-תאיים שהצטברו בלימפוציטים T מגורים.

טכניקת מבחנה לגירוי לימפוציטים באמצעות חיידקים פתוגניים

סרטון זה מדגים בדיקה החוקרת את תפקידם של תאים דמויי נויטרופילים בהגנה על תאי לימפומה מפני ציטוטוקסיות של חומרים כימותרפיים. תרבית משותפת תלת-ממדית, המורכבת מלימפומה ותאים דמויי נויטרופילים, מוקמת ונחשפת לווינקריסטין – תרופה כימותרפית. מגע ישיר עם תאים דמויי נויטרופילים גורם upregulation של חלבונים אנטי אפופטוטיים בתאי לימפומה, ובכך לקדם את הישרדותם בנוכחות vincristine.

קביעת תפקידם של תאים דמויי נויטרופילים ברגישות תאי לימפומה לתרופה ניסיונית

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

מיטוגנזה של לימפוציטים מסוג T מלווה בטרנספורמציה בלסטוגנית, שבה נפח התא גדל לפני חלוקת התא. כאן, אנו מתארים שיטה לכימות בלסטוגנזה בלימפוציטים מסוג T באמצעות מונה תאים אוטומטי עם יכולת מדידת קוטר תאים.

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

שיטה פשוטה להשגת שיבוטים NK ו T תאים מחולים CAEBV פותחה עם יעילות גבוהה, כמות קטנה של דם היקפיים במינון נמוך של il-2.

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

כאן אנו מתארים שיטה חדשה כדי לעזור להבהיר את מנגנוני החסינות התאית פלסמודיום בשלב הדם של זיהום. זוהי בדיקת מבחנה המודדת הרג תאי דם אדומים נגועים על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים.

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

למד שיטה חדשנית להקמת שורות תאי B לימפובלסטואידיים (B-LCLs) באמצעות מיצוי תאי דם אדומים ונגיף Epstein-Barr. השיטה מצריכה רק 0.5 מ"ל דם ומקצרת משמעותית את זמן העיבוד עד להקפאה.

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

גלה סרטונים נוספים